D.M. 10 novembre 1997 (1).
Ufficializzazione del metodo di analisi per la «Determinazione enzimatica dell'acido lattico nel latte».
(1) Pubblicato nella Gazz. Uff. 3 gennaio 1998, n. 2.
L'ISPETTORE GENERALE CAPO DELL'ISPETTORATO CENTRALE REPRESSIONE FRODI DI
CONCERTO CON IL DIRETTORE GENERALE DEL DIPARTIMENTO DELLE DOGANE E DELLE
IMPOSTE INDIRETTE DEL MINISTERO DELLE FINANZE IL DIRETTORE GENERALE
DEL DIPARTIMENTO DEGLI ALIMENTI E NUTRIZIONE E DELLA SANITÀ PUBBLICA
VETERINARIA DEL MINISTERO DELLA SANITÀ IL DIRETTORE GENERALE PER LO SVILUPPO
PRODUTTIVO E LA COMPETITIVITÀ DEL MINISTERO DELL'INDUSTRIA, DEL COMMERCIO E
DELL'ARTIGIANATO
Visto l'art. 2 del decreto legislativo 4 giugno 1997, n. 143, che istituisce il Ministero per le politiche
agricole;
Visto il decreto legislativo 3 febbraio 1993, n. 29, concernente norme per la razionalizzazione
dell'organizzazione delle amministrazioni pubbliche e revisione della disciplina in materia di pubblico
impiego, a norma dell'art. 2 della legge 23 ottobre 1992, n. 421;
Visti l'art. 43 del regio decreto-legge 15 ottobre 1925, n. 2033, convertito nella legge 18 marzo 1926, n. 562,
riguardante la repressione delle frodi nella preparazione e nel commercio di sostanze di uso agrario e di
prodotti agrari, e l'art. 108 del regolamento per l'esecuzione dello stesso regio decreto-legge, approvato con
regio decreto 1° luglio 1926, n. 1361, i quali prescrivono che le analisi occorrenti in applicazione delle
norme contenute nel regio decreto-legge e nel regolamento di esecuzione suddetti dovranno essere eseguite
dai laboratori incaricati con i metodi di analisi prescritti da questo Ministero, di concerto con il Ministero
delle finanze, il Ministero della sanità ed il Ministero dell'industria, del commercio e dell'artigianato;
Visto il decreto del Presidente della Repubblica 26 marzo 1980, n. 327 «Regolamento di esecuzione della
legge 30 aprile 1962, n. 283», e successive modificazioni, in materia di disciplina igienica della produzione
e della vendita delle sostanze alimentari e delle bevande;
Vista la legge 3 maggio 1989, n. 169, sulla disciplina del trattamento e della commercializzazione del latte
alimentare vaccino;
Visto il decreto interministeriale 26 marzo 1992, pubblicato nel supplemento ordinario alla Gazzetta
Ufficiale n. 90 del 16 aprile 1992, con il quale è stata data attuazione alla decisione n. 91/180/CE
concernente la fissazione di metodi di analisi e prova relativi al latte crudo e al latte trattato termicamente;
Visto il decreto del Presidente della Repubblica 14 gennaio 1997, n. 54, pubblicato nel supplemento
ordinario alla Gazzetta Ufficiale n. 59 del 12 marzo 1997, con il quale è stata data attuazione alle direttive n.
92/46 e n. 92/47 in materia di produzione ed immissione sul mercato di latte e di prodotti a base di latte;
Considerato che, come noto, l'acido lattico, quale prodotto della fermentazione del lattosio, è un parametro
qualitativo indice dello stato di conservazione del prodotto latte;
Ritenuto pertanto opportuno disporre di un metodo analitico che tramite il dosaggio dell'acido lattico
fornisca elementi informativi a supporto di un giudizio di genuinità e qualità del prodotto latte sia sotto il
profilo igienico-sanitario che di composizione;
Ritenuto altresì indispensabile porre a disposizione di tutti gli istituti e laboratori pubblici idonei metodi di
analisi per il controllo del latte, perché le analisi da essi compiute risultino uniformi nei procedimenti e nei
risultati;
Sentito il parere della Commissione UE - a norma della direttiva n. 83/189/CE, che dispone una procedura di
notifica nel settore delle norme e regolamentazioni tecniche - al fine di prevenire l'adozione di norme che
possano creare ostacoli alla libera circolazione delle merci;
Sentito il parere della Commissione per l'aggiornamento dei metodi ufficiali di analisi per i prodotti agrari e
le sostanze di uso agrario - sottocommissione per i formaggi - di cui al decreto ministeriale 11 febbraio 1981
e successive modificazioni, alla quale con decreto ministeriale 19 dicembre 1992 è stato attribuito anche
l'aggiornamento dei metodi ufficiali di analisi del prodotto agricolo latte;
Vista la legge 14 gennaio 1994, n. 20, contenente disposizioni in materia di giurisdizione e controllo della
Corte dei conti;
Decreta:
Articolo unico
1. È approvato il metodo ufficiale di analisi relativo alla «Determinazione enzimatica dell'acido lattico nel
latte» descritto nell'allegato al presente decreto.
2. È fatto salvo il principio del mutuo riconoscimento in virtù del quale la qualità e l'autenticità del latte
legalmente fabbricato e/o commercializzato in un altro Stato membro o Paese firmatario dell'accordo sullo
S.E.E. e immesso sul mercato italiano possano altresì essere controllate tramite metodi di analisi alternativi
che offrano garanzie equivalenti al metodo di cui al presente decreto.
3. Il presente decreto è inviato alla Corte dei conti per il controllo preventivo di legittimità ed entrerà in
vigore il giorno successivo a quello della sua pubblicazione nella Gazzetta Ufficiale della Repubblica
italiana.
Allegato
Determinazione enzimatica dell'acido lattico nel latte
1 - Scopo e campo di applicazione.
Determinazione del tenore in acido lattico, come somma di acido D-lattico e L-lattico, nel latte crudo,
pastorizzato e sterilizzato.
2 - Riferimenti.
D.M. 26 marzo 1992 - Attuazione della decisione n. 91/180/CE - Allegato I - Metodi di campionamento.
3 - Principio.
La determinazione enzimatica dell'acido Llattico e D-lattico viene eseguita sul latte, deproteinizzato e diluito
opportunamente, utilizzando gli enzimi L-lattato deidrogenasi, D(-)-lattato deidrogenasi. In presenza di
questi enzimi, gli ioni L-lattato e D(-)-lattato vengono ossidati a piruvato dal cofattore nicotinamide-adenindinucleotide (NAD) che, a sua volta, si riduce a NADH.
L-LDH o D-LDH
lattato + NAD___________piruvato + NADH + H+
Poiché l'equilibrio di questa reazione è quasi completamente spostato dalla parte del lattato, si sottrae il
piruvato per mezzo di una reazione catalizzata dall'enzima glutammato-piruvatotransaminasi (GPT) in presenza di L-glutammato.
piruvato + L-glutammato____ GPT ____ L-alanina +-chetoglutarato
In tal modo, l'equilibrio viene spostato dalla parte del piruvato e del NADH. La quantità di NADH formatosi
nella reazione, equivalente a quella di L-lattato e di D-lattato iniziali, viene dosata per via
spettrofotometrica.
4 - Reattivi.
4.1 - Acqua bidistillata.
4.2 - Soluzione diluita di Carrez I.
Sciogliere 3,60 g di ferrocianuro di potassio (K4[Fe(CN)6]-3 H2O) in 100 ml di acqua (4.1).
4.3 - Soluzione diluita di Carrez II.
Sciogliere 7,20 g di solfato di zinco (ZnSO4-7 H2O) in 100 ml di acqua (4.1).
4.4 - Soluzione di idrossido di potassio 2 N circa.
4.5 - Soluzione Tampone (acido L-glutammico 0,1 M in tampone glicilglicina 0,6 M a pH10).
Sciogliere in un pallone tarato da 50 ml, 3,96 g di glicilglicina e 0,73 g di acido L-glutammico con circa 40
ml di acqua (4.1), aggiungere 3,8 ml di soluzione di idrossido di sodio 10 M e portare a volume con acqua
(4.1). La soluzione è stabile per almeno tre mesi se conservata in frigorifero.
4.6 - Soluzione NAD (nicotinamide 47 mM).
Sciogliere 0,21 g di beta nicotinamide adenina dinucleotide monoidrato (beta NAD+) in 6 ml di acqua (4.1).
La soluzione è stabile almeno un mese se conservata in frigorifero.
4.7 - Soluzione GPT (enzima glutammato-piruvato transaminasi).
Centrifugare una sospensione commerciale dell'enzima (solitamente in ammonio solfato 3,2 M e con attività
di circa 80 U/mg) a 4000 rpm per 10 minuti; prelevare il surnatante limpido e scartare il residuo. La
soluzione è stabile almeno un anno se conservata in frigorifero.
4.8 - Soluzione D-LDH (enzima D(-)-lattato deidrogenasi) da lactobacillus leichmannii.
Soluzione commerciale dell'enzima (solitamente in miscela glicerolo acqua, da 5 mg/ml e con attività
specifica di circa 300 U/mg). La soluzione è stabile almeno un anno se conservata in frigorifero.
4.9 - Soluzione L-LDH (enzima L-lattato deidrogenasi).
Soluzione commerciale dell'enzima (solitamente in miscela glicerolo-acqua, da 10 mg/ml e con attività
specifica di circa 550 U/mg). La soluzione è stabile almeno un anno se conservata in frigorifero.
4.10 - Soluzione Standard-D-Lattico circa 40 mg/l (calcolata in base alla esattezza della pesata).
Pesare esattamente 42,6 mg circa di D(-)lattato di litio anidro oppure 49,7 mg circa di D-Lattato di sodio
(titolo > 99%) e scioglierli in 100 ml di acqua (4.1). Prelevare 10 ml e diluirli a 100 ml. La soluzione
corrisponde a circa 40 mg/l di acido D(-)lattico. Se si dispone di soluzioni già pronte, diluirle fino a ottenere una concentrazione finale nota di circa
40 mg/l.
4.11 - Soluzione Standard-L-Lattico circa 40 mg/l (calcolata in base alla esattezza della pesata).
Pesare esattamente 42,6 mg circa di L-lattato di litio anidro oppure 49,7 mg circa di L-Lattato di sodio
(titolo > 99%) e scioglierli in 100 ml di acqua (4.1). Prelevare 10 ml e diluirli a 100 ml. La soluzione
corrisponde a circa 40 mg/l di acido Llattico. Se si dispone di soluzioni già pronte, diluirle fino a ottenere una concentrazione finale nota di circa
40 mg/l.
5 - Apparecchiatura.
5.1 - Provette graduate da 10 ml con tappo.
5.2 - Pipette con puntali monouso per volumi di 20, 100, 200, 500, 1000 microlitri.
5.3 - Spettrofotometro.
5.4 - Cuvette in quarzo o in plastica monouso con cammino ottico da 1 cm.
5.5 - Bacchette con estremità appiattite, tali da entrare nelle cuvette (5.4).
6 - Campionamento.
Vedi punto 2.
7 - Procedimento.
7.1 - Preparazione del campione.
7.1.1 - Pesare 5 g di campione in una provetta da 10 ml (5.1). Aggiungere 0,75 ml di soluzione di Carrez I
(4.2) e mescolare. Aggiungere 0,75 ml di soluzione di Carrez II (4.3), mescolare e neutralizzare con alcune
gocce idrossido di potassio (4.4). Portare a volume con acqua (4.1).
7.1.2 - Filtrare.
7.2 - Determinazione.
7.2.1 - Preparare una serie di cuvette (5.4) e denominarle:
B: cuvetta per la prova del bianco
St: cuvetta per il controllo degli standard D-Lattico (4.10) e L-Lattico (4.11)
C: cuvetta per la determinazione del campione.
7.2.2 - Con pipette (5.2), pipettare in tutte le cuvette, nell'ordine:
1,00 ml di soluzione Tampone (4.5);
0,20 ml di soluzione NAD (4.6);
0,02 ml della soluzione GPT (4.7).
7.2.3 - Con pipette (5.2), pipettare in:
cuvetta B: - 1,00 ml di acqua (4.1)
cuvetta St: - 0,50 ml di standard D-Lattico (4.10) e 0,50 ml di standard L-Lattico (4.11).
cuvetta C: - 1,00 ml di campione filtrato (7.1.2)
Mescolare con le bacchette (5.5) (una per cuvetta) e lasciar riposare per 5 minuti.
7.2.4 - Determinazione dell'acido D-Lattico.
Misurare le estinzioni delle singole cuvette a 340 nm contro acqua (4.1). I valori letti sono denominati E1 e,
abbinati alle rispettive cuvette, diventano:
E1B l'estinzione iniziale del bianco per il D-Lattico
E1St l'estinzione iniziale dello standard D-Lattico
E1C l'estinzione iniziale del campione per il D-Lattico.
7.2.5 - Aggiungere nelle cuvette:
0,02 ml di soluzione D-LDH (4.8)
Mescolare e lasciar riposare per 30 minuti.
7.2.6 - Misurare le estinzioni delle singole cuvette a 340 nm contro acqua (4.1). I valori letti sono
denominati E2 e, abbinati alle rispettive cuvette, diventano:
E2B l'estinzione finale del bianco per il D-Lattico
E2St l'estinzione finale dello standard D-Lattico
E2C l'estinzione finale del campione per il D-lattico.
7.2.7 - Determinazione dell'acido L-Lattico.
La determinazione, continua nelle stesse cuvette ancora contenenti le soluzioni della determinazione
dell'acido D-lattico. Le estinzioni finali relative all'acido D-Lattico (7.2.6) costituiscono anche le estinzioni
iniziali per l'acido L-Lattico.
E2B l'estinzione iniziale del bianco per l'L-Lattico
E2St l'estinzione iniziale dello standard L-Lattico
E2C l'estinzione iniziale del campione per l'L-lattico.
7.2.8 - Aggiungere nelle cuvette:
0,02 ml di soluzione L-LDH (4.9)
Mescolare e lasciar riposare per 30 minuti.
7.2.9 - Misurare le estinzioni delle cuvette a 340 nm contro acqua (4.1). I valori letti sono denominati E3 e,
abbinati alle rispettive cuvette, diventano:
E3B l'estinzione finale del bianco per l'L-Lattico
E3St l'estinzione finale dello standard L-Lattico
E3C l'estinzione finale del campione per l'L-lattico).
8 - Espressione dei risultati.
8.1 - Calcolo
La formula generale di calcolo è:
C(in mg/l) = V*PM
______________*E
*d*v
dove:
V = volume finale del test (2,24 ml - per bianco, campione e standard D-Lattico, 2,26 per bianco, campione
e standard L-Lattico)
v = volume della soluzione analizzata (0,50 ml per gli standard, 1,00 ml per il campione e 1,00 ml per il
bianco)
PM = peso molecolare dell'acido lattico (90,1 sia nella forma L che nella forma D)
d = spessore della cuvetta (1 cm)
Î = coefficiente di estinzione molare a 340 nm del NADH pari a 6,3
DeltaECD = (E2C-E1C) = differenza estinzioni acido D-Lattico
DeltaECL = (E3C-E2C) = differenza estinzioni acido L-Lattico
DeltaEStD = (E2St-E1St) = differenza estinzioni standard D-Lattico
DeltaEStL = (E3St- E2St) = differenza estinzioni standard L-Lattico
DeltaEBD = (E2B-E1B) = differenza estinzioni bianco D-Lattico
DeltaEBL = (E3B-E2B) = differenza estinzioni bianco L-Lattico.
8.2 - Verifica della validità del metodo - Prova di recupero.
Si confronta il valore determinato delle soluzioni standard di acido D-Lattico e di acido L-Lattico con il
valore teorico delle stesse. Il volume finale del test di controllo (V) è pari a 2,24 ml per l'acido D-Lattico e a
2,26 per l'acido L-Lattico; il volume di standard usato è pari a 0,5 ml. Sostituendo nella formula, si ottiene:
Conc. Standard D-Lattico (mg/l) = 64,07 * (DeltaEStD-DeltaEBD)
Conc. Standard L-Lattico (mg/l) = 64,64 * (DeltaEStL-DeltaEBL)
I valori determinati degli standard devono corrispondere ai valori dichiarati iniziali con recupero pari almeno
al 95%.
8.3 - Tenore di acido D-Lattico in mg/Kg di latte.
Il volume finale del test è 2,24 ml e il volume di campione è pari a 1,00 ml. Sostituendo i valori nella
formula e facendo riferimento ai grammi pesati (G) e diluiti a 10 ml, si ottiene:
Conc. D-Lattico (mg/Kg) = 32,03 * (DeltaECD DeltaEBD) * 10/G
8.4 - Tenore in acido L-Lattico in mg/Kg di latte.
Il volume finale del test è 2,26 ml e il volume di campione è pari a 1,00 ml. Sostituendo i valori nella
formula e facendo riferimento ai grammi pesati (G) e diluiti a 10 ml, si ottiene:
Conc. L-Lattico (mg/Kg) = 32,32 * (DeltaECL - DeltaEBL) * 10/G
8.5 - Il tenore finale di acido lattico in mg/Kg di latte (p.p.m.) è dato dalla somma delle concentrazioni del
D-Lattico e del L-Lattico.
Per la somma, devono essere prese in considerazione solo le concentrazioni superiori a 4 mg/Kg di latte.
Determinazione acido lattico
Tabella riassuntiva
Aggiungere nelle cuvette
Soluzione Tampone(4.5)
Soluzione NAD (4.6)
Soluzione GPT (4.7)
Acqua (4.1)
Standard D-Lattico(4.10)
Standard L-Lattico(4.11)
Campione filtrato (7.1.2)
Leggere le estinzioni
Soluzione D-LDH (4.8)
Leggere estinzioni
Soluzione L-LDH (4.9)
Leggere estinzioni
Bianco
B
ml
1,00
0.20
0,02
1,00
---E1B
0,02
E2B
0,02
E3B
Standard
ST
ml
1,00
0,20
0,02
-0,50
0,50
-E1St
0,02
E2St
0,02
E3St
Campione
C
ml
1,00
0,20
0,02
---1,00
E1C
0,02
E2C
0,02
E3C
9 - Osservazioni.
9.1 - La temperatura di lavoro ottimale deve essere compresa fra 20 e 25 gradi C.
9.2 - La quantità di acido lattico (D o L) non deve essere inferiore a 2 mg in cuvetta, corrispondente a 4
mg/kg nel campione operando come descritto. La quantità di 4 mg/kg pertanto diviene la quantità minima
determinabile di acido lattico.
9.3 - La quantità di acido D-Lattico normalmente riscontrabile è inferiore a 4 mg/kg e pertanto il tenore di
acido lattico totale nel campione in esame sarà dato dalla somma dei due enantiomeri solo quando la
quantità di D-Lattico risulterà superiore a 4 mg/kg. In caso contrario, il tenore di acido lattico sarà dato dalla
quantità del solo acido L-Lattico.
10 - Precisione del metodo.
10.1 - Su un latte con tenore di acido lattico pari a circa 10 mg/kg, sono state eseguite 15 determinazioni.
Dalle valutazioni statistiche si è ricavato:
Coefficiente di variazione (C.V.) = 10%
Intervallo di confidenza (x ± 2 s) = x ± 2
