Procedura e risultati

PREPARAZIONE DELLA FORMA
APOENZIMATICA DELLA SHMT
Indice
Introduzione
Materiali e metodi
Cromatografia
Tamponi
Spettroscopio
Procedura e risultati
Preparazione della colonna e caricamento del campione
Lavaggio e controllo della presenza del complesso tiazolidinico nell'elusto
Eluizione dell'apoSHMT e conferma della sua presenza
Discussione
Formazione del complesso tiazolidinico e sua rimozione del gruppo PLP dall'enzima
Conferma della presenza dell'apoSHMT
Introduzione
Nel corso della purificazione della SHMT (serine hydroxymethyltransferase) (quale SHMT ed
espressa in quali cellule batteriche trasformate), abbiamo voluto preparare ed isolare la sua forma
apoenzimatica priva del gruppo prostetico PLP (piridossal fosfato).
Gli enzimi PLP-dipendenti come la SHMT legano covalentemente nel loro sito catalitico una
molecola di piridossal fosfato ad una lisina attraverso una base di Schiff (questo complesso è
chiamato aldimmina interna, vedi fig. 1).
Figura 1: struttura del PLP e legame ad una lisina nel sito catalitico di un enzima PLP-dipendente
Gli enzimi PLP-dipendenti (con eccezione della glicogeno fosforilasi) legano un amminoacido al
PLP nel loro sito catalitico formando una nuova base di Schiff con il gruppo α-amminico
dell'amminoacido stesso (complesso chiamato aldimmina esterna, vedi fig. 2).
Figura 2: formazione di un'aldimmina esterna negli enzimi PLP-dipendenti
Per isolare la forma apoenzimatica della SHMT abbiamo sfruttato questa reazione. L'amminoacido
L-cisteina non è il substrato fisiologico della SHMT ma ad alte concentrazioni forma un'aldimmina
esterna con il PLP dell'enzima. Il gruppo solfidrilico della cisteina è in grado di attaccare il carbonio
impegnato nella base di Schiff del PLP per formare un complesso tiazolidinico stabile che può
dissociarsi dall'enzima (vedi fig. 3). Questo complesso ha un picco di assorbimento a 330nm, una
caratteristica che può rendere sua formazione rilevabile attraverso spettrofotometria.
Figura 3: formazione del complesso tiazolidinico
Per rimuovere il PLP sotto forma di complesso tiazolidinico dalla SHMT abbiamo quindi eseguito
una cromatografia ad interazione idrofobica con una resina di fenil sefarosio. In questo tipo di
cromatografia si usa un tampone eluente con un'alta forza ionica che causa la precipitazione per
salting out delle proteine in soluzione e l'attacco di queste alla resina idrofobica. Nel nostro caso,
utilizzando un tampone con un'alta forza ionica e con L-cisteina in eccesso rispetto alla proteina è
possibile rimuovere il gruppo PLP dall'oloSHMT: il complesso tiazolidinico formatosi con l'Lcisteina può essere lavato via mentre l'apoSHMT rimane attaccata alla resina. L'apoenzima può
essere in seguito eluito utilizzando un tampone con una minore forza ionica.
Materiali e metodi
Abbiamo svolto in tre gruppi tre cromatografie ciascun gruppo indipendentemente dall'altro
utilizzando tutti gli stessi strumenti e materiali. Ogni gruppo ha eseguito però la cromatografia
caricando quantità differenti dei diversi tamponi e raccogliendo diverse quantità di eluato. La
procedura ed i dati di questa tesina si riferiscono alla cromatografia eseguita dal gruppo del quale io
facevo parte.
Cromatografia
Abbiamo usato colonne cromatografiche da 10ml (sicuro?) con circa 7ml di resina di fenil
sefarosio che per i suoi gruppi fenilici è adatta ad una cromatografia ad interazione idrofobica. Per
caricare i tamponi sulla colonna abbiamo usato delle pipette Pasteur e per raccogliere l'eluato
abbiamo usato delle provette di plastica.
Tamponi
Per la cromatografia abbiamo utilizzato i seguenti tamponi:
Tampone 1: 25% (NH4)2SO4, K2PO4 20mM pH 7.2, L-cisteina 1M. Per legare l'SHMT ai gruppi
idrofobici della resina e per far formare e lavare via il complesso tiazolidinico abbiamo usato questo
tampone con un'alta forza ionica (dovuta in grande parte all'ammonio solfato) preparandone 250ml
per ogni gruppo.
Tampone 2: 25% (NH4)2SO4, K2PO4 20mM pH 7.2. Dopo avere lavato la colonna con il tampone 1,
volevamo assicurarci che prima di iniziare ad utilizzare il tampone eluente per lavare via
l'apoSHMT, l'L-cisteina eventualmente rimasta nella fase mobile fosse stata rimossa e per questo
abbiamo usato questo tampone.
Tampone 3: K2PO4 20mM pH 7.2. Una volta fatto rimosso il PLP sotto forma di complesso
tiazolidinico, per eluire l'apoSHMT dalla colonna abbiamo utilizzato questo tampone con una forza
ionica minore rispetto ai precedenti, nel quale l'enzima è nuovamente solubile.
Nome del tampone
Utilizzo
Tampone 1
Conentrazione (in
mM) K2PO4 e pH
Concentrazione (in
g/100ml) di
(NH4)2SO4
Conentrazione (in
mM) di L-cisteina
equilibrio della
20, pH 7.2
colonna, formazione e
lavaggio del
complesso
tiazolidinico
25
1000
Tampone 2
lavaggio dell'Lcisteina rimasta dopo
la rimozione del
complesso
tiazolidinico
20, pH 7.2
25
0
Tampone 3
lavaggio
dell'apoSHMT
20, pH 7.2
0
0
Tabella 1: i diversi tamponi utilizzati nella cromatografia ad interazione idrofobica
Spettrofotometro
Per misurare le assorbanze dei campioni raccolti dalla cromatografia abbiamo utilizzato uno
spettrofotometro UV-visibile presente in laboratorio.
Procedura e risultati
Preparazione della colonna e caricamento del campione
Per iniziare la cromatografia, abbiamo equilibrato la colonna caricando del tampone 1 ed abbiamo
fatto andare la colonna a secco.
L'oloSHMT che avevamo preparato in seguito ai tre passaggi della purificazione (lisi con 20% di
ammonio solfato, precipitazione con 60% di ammonio solfato, e cromatografia CM Sephadex), era
disponibile in una soluzione con concentrazione di proteina totale di 3mg/ml (stimata attraverso il
saggio di Bradford). (qualche info sul grado di purificazione?) A 4ml di questa soluzione si sono
aggiunti ammonio solfato e L-cisteina per avere una soluzione con 25% ammonio solfato e con Lcisteina 1M.
La soluzione contenente oloSHMT che aveva un colore visibilmente giallo (il PLP associato
all'enzima riemette nel giallo la luce assorbita) è immediatamente diventata incolore in seguito
all'aggiunta di L-cisteina a causa della formazione del complesso tiazolidinico (che non riemette
luce visibile).
Abbiamo caricato questa soluzione contenente il campione proteico sulla colonna ed abbiamo fatto
andare la colonna a secco.
Lavaggio e controllo della presenza del complesso tiazolidinico
nell'eluato
A questo punto abbiamo cominciato il lavaggio del complesso tiazolidinico. Caricando il tampone
1 sulla colonna abbiamo iniziato a raccogliere l'eluato in una serie di provette, alle quali abbiamo
assegnato una numerazione crescente a partire da 1. In tutto abbiamo usato 5 provette cercando di
raccogliere 1ml circa in ognuna.
Le assorbanze a 330nm (un picco di assorbimento del complesso tiazolidinico) dell'eluato raccolto
nelle provette sono indicate nella tabella 2.
Eluizione dell'apoSHMT e conferma della sua presenza
Per eliminare l'L-cisteina rimasta nella colonna abbiamo caricato del tampone 2 (privo di Lcisteina) facendo andare la colonna a secco.
Abbiamo iniziato così a caricare il tampone 3 per lavare via l'apoenzima dalla colonna. Il tampone
3 non avendo ammonio solfato, possiede una forza ionica inferiore rispetto a quella dei tamponi
usati precedentemente. In queste condizioni la solubilità della SHMT aumenta e dissociandosi dai
gruppi idrofobici presenti sulla resina può essere eluita.
Abbiamo nuovamente iniziato a raccogliere l'eluato in provette alle quali abbiamo continuato ad
assegnare una numerazione crescente cercando sempre di raccogliere circa 1ml per provetta.
Le A280 (gli amminoacidi aromatici presenti nelle proteine hanno dei picchi di assorbimento intorno
ai 280nm) sono indicate nella tabella 2.
Numero
assegnato alla
provetta
Tampone
caricato
ml di eluato raccolti
A330
A280
1
1
circa 1
-
-
2
1
circa 1
0,25
-
3
1
circa 1
-
-
4
1
circa 1
0,06
-
5
1
circa 1
-
-
6
2
fino a riempimento
-
-
7
3
circa 1
-
-
8
3
circa 1
-
-
9
3
circa 1
-
0,03
10
3
circa 1
-
-
11
3
circa 1
-
1
12
3
circa 1
-
1,1
13
3
circa 1
-
-
Note
lavaggio dell'L-cisteina rimasta
nella colonna
Tabella 2: provette utilizzate nella cromatografia e volume raccolto in esse
Discussione
Formazione del complesso tiazolidinico e rimozione del gruppo
PLP dall'enzima
In seguito all'aggiunta di L-cisteina la soluzione con oloSHMT prima vistosamente gialla è
diventata incolore. Questo indica che il PLP in una soluzione con L-cisteina 1M inizia subito a
essere rimosso dall'oloSHMT come complesso tiazolodinico.
Le A330 dell'eluato nelle provette 2 (0,25) e 4 (0.06) dimostrano che l'L-cisteina ha effettivamente
formato un complesso tiazolidinico con il PLP dell'oloSHMT e che attraverso un lavaggio continuo
con il tampone 1 il complesso è stato lavato via, dissociandosi dall'enzima rimasto così in forma
apo.
La mancanza di un picco di assorimento a 280nm nello spettro dell'eluato contenente il complesso
tiazolidinico (vedi fig. 4) indica che l'SHMT è rimasta saldamente attaccata alla resina idrofobica
durante il lavaggio con il tampone 1 ad alta forza ionica.
Il fatto che l'A330 della provetta 2 fosse maggiore a quello della provetta 4 indica che la maggior
parte del complesso tiazolidinico era già stato lavato via di subito dopo aver iniziato a caricare il
tampone (si può anche levare questo).
Conferma della presenza dell'apoSHMT
Le A280 dell'eluato nelle provette 11 (1.0) e 12 (1.1) dimostrano che in seguito al lavaggio con il
tampone 3 è stata effettivamente eluita della proteina, la quale rimaneva invece legata alla resina
durante i lavaggi con i precedenti tamponi aventi una forza ionica maggiore.
Negli enzimi PLP dipendenti l'aldimmina interna ha un picco di assorbimento a circa 430nm. La
mancanza di questo picco nello spettro dell'eluato contenente l'SHMT lavata via (vedi fig. 4)
dimostra che il PLP si è dissociato dall'enzima e che quest'ultimo è rimasto nella forma apo. Per
confrontare le differenti assorbanze intorno ai 430nm negli spettri dell'apoSHMT e dell'oloSHMT
(ricavati in altri esperimenti) vedi fig. 5.
Per confermare la preparazione dell'apoSHMT sono stati successivamente eseguiti dei saggi
enzimatici con essa. Questi hanno dimostrato che l'enzima isolato non è effettivamente in grado di
catalizzare alcuna reazione, ma in seguito all'aggiunta di PLP mostra nuovamente attività catalitica
ritornando nella forma oloenzimatica.
4
3,5
frazione eluita con il tam pone 1 (complesso tiazo lidinico)
frazione eluita con il
tampone 3 (apoSHMT)
3
2,5
A
2
1,5
1
0,5
0
250
270
290
310
330
350
370
390
410
430
450
-0,5
lunghezza d'onda (nm)
Figura 4: in rosso lo spettro di una frazione raccolta in seguito al lavaggio tampone 1 (complesso tiazolidinico e Lcisteina) ed in blu lo spettro di una frazione raccolta in seguito al lavaggio con il tampone 3 (apoSHMT). Nello spettro
tracciato in rosso notare il picco a 330nm del complesso tiazolidinico e l'assenza di picco a 280nm (che indica l'assenza
di proteine nella frazione). Nello spettro tracciato in blu notare il picco a 280nm e l'assenza di picco a 430nm del PLP.
0,08
oloSHMT
apoSHMT
0,07
0,06
A
0,05
0,04
0,03
0,02
0,01
0
300
320
340
360
380
400
420
440
460
480
500
lunghezza d'onda (nm)
Figura 5:
in blu lo spettro dell'oloSHMT in rosso lo spettro dell'apoSHMT. L'oloSHMT presenta un
picco di assorbimento intorno ai 430nm.