Reagenti forniti e numero di identificazione

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PROTOCOLLO SPERIMENTALE
Introduzione
L'equilibrio tra la produzione di nuove cellule e l' eliminazione delle cellule “vecchie” è uno
degli obiettivi principali di ogni organismo pluricellulare.
Si conoscono due modalità principali mediante cui le cellule possono essere eliminate: la
NECROSI e l’APOPTOSI. Nel primo caso la cellula va incontro a rigonfiamento, rottura della
plasmamembrana e lisi, rilasciando il proprio contenuto nell’ambiente esterno. Nel secondo,
invece, la cellula si “condensa” e successivamente si frammenta in vescicole, dette corpi
apoptotici, che sono rapidamente digerite dai macrofagi. A differenza delle cellule necrotiche, i
corpi apoptotici sono ancora circondati da membrana, quindi il materiale che contengono non può
raggiungere l’ambiente esterno. Questa distinzione è estremamente importante dal momento che i
materiali contenuti all’interno di una cellula possono essere dannosi per le cellule vicine.
Lo studio della morte cellulare per apoptosi viene generalmente effettuato utilizzando linee
cellulari, che si possono mantenere in coltura mediante procedure standardizzate.
In questo esperimento verranno utilizzate cellule L929, una linea di fibroblasti murini.
Queste cellule crescono “in monostrato”, hanno cioè bisogno di ancorarsi ad un substrato, e
smettono di crescere quando arrivano a “toccarsi” (inibizione da contatto, confluenza). Il terreno di
coltura contiene, fra le altre cose, carboidrati, aminoacidi, lipidi, sodio bicarbonato, ed è
addizionato di siero, la componente fluida del sangue, allo scopo di arricchirlo di nutrienti. Il colore
rosso è dovuto alla presenza del rosso-fenolo, un indicatore di pH. Perché le cellule possano
moltiplicarsi, devono essere mantenute nel loro terreno di coltura in appositi incubatori in
un’atmosfera contenente il 5% di anidride carbonica (CO2).
Scopo del lavoro
L’esperimento proposto ha lo scopo di valutare se le cellule L929 vanno incontro a morte
per apoptosi in seguito al trattamento con il farmaco anti-tumorale etoposide, anche indicato con la
sigla VP-16, oppure con il tassolo (Paclitaxel).
Esecuzione
I giorno



Osservare le piastre Petri al microscopio.
Cambiare il terreno (2 ml / piastrina).
arrivando ad una
 Mettere le Petri nell’incubatore per 24 ore.
II giorno



Osservare le piastre al microscopio.
Lavare il vetrino contenuto nelle piastre in PBS (soluzione 1).
Fissare per 5 minuti in etanolo 95% (soluzione 2).


Lasciare asciugare a temperatura ambiente.
Effettuare la colorazione con ematossilina-eosina secondo il protocollo seguente:
- etanolo 70% (soluzione 3)
- H2O distillata
- ematossilina (soluzione 4)
- H2O distillata
- eosina 0,5% con goccia di CH3COOH (soluzione 5)
- H2O distillata
- etanolo 70% (soluzione 3)
- etanolo 95% (soluzione 2)
- etanolo 100% (soluzione 6)

Prelevare il vetrino dalle piastre:
- xilene (sotto cappa chimica!!)
- sintex

Osservare i preparati al microscopio.
Reagenti utilizzati




terreno DMEM contenente penicillina 1
bovino (FCS) 10% v/v
etoposide 1 mM
tassolo 1 mM
tripsina 1x (2,5 mg/ml) in PBS
Reagenti forniti e numero di identificazione
1.
2.
3.
4.
5.
6.
4 minuti
1 goccia.
Coperchiare il vetrino su un vetrino portaoggetti e lasciare asciugare fino al giorno seguente.
III giorno

2 minuti
5 minuti
3 minuti
sciacquare
1-2 minuti MAX
sciacquare
2 minuti
1 minuto
2 minuti.
PBS
etanolo 95%
etanolo 70%
ematossilina
eosina 0,5% acidificata con CH3COOH
etanolo 100%
RISULTATI
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