PROTOCOLLO SPERIMENTALE Introduzione L'equilibrio tra la produzione di nuove cellule e l' eliminazione delle cellule “vecchie” è uno degli obiettivi principali di ogni organismo pluricellulare. Si conoscono due modalità principali mediante cui le cellule possono essere eliminate: la NECROSI e l’APOPTOSI. Nel primo caso la cellula va incontro a rigonfiamento, rottura della plasmamembrana e lisi, rilasciando il proprio contenuto nell’ambiente esterno. Nel secondo, invece, la cellula si “condensa” e successivamente si frammenta in vescicole, dette corpi apoptotici, che sono rapidamente digerite dai macrofagi. A differenza delle cellule necrotiche, i corpi apoptotici sono ancora circondati da membrana, quindi il materiale che contengono non può raggiungere l’ambiente esterno. Questa distinzione è estremamente importante dal momento che i materiali contenuti all’interno di una cellula possono essere dannosi per le cellule vicine. Lo studio della morte cellulare per apoptosi viene generalmente effettuato utilizzando linee cellulari, che si possono mantenere in coltura mediante procedure standardizzate. In questo esperimento verranno utilizzate cellule L929, una linea di fibroblasti murini. Queste cellule crescono “in monostrato”, hanno cioè bisogno di ancorarsi ad un substrato, e smettono di crescere quando arrivano a “toccarsi” (inibizione da contatto, confluenza). Il terreno di coltura contiene, fra le altre cose, carboidrati, aminoacidi, lipidi, sodio bicarbonato, ed è addizionato di siero, la componente fluida del sangue, allo scopo di arricchirlo di nutrienti. Il colore rosso è dovuto alla presenza del rosso-fenolo, un indicatore di pH. Perché le cellule possano moltiplicarsi, devono essere mantenute nel loro terreno di coltura in appositi incubatori in un’atmosfera contenente il 5% di anidride carbonica (CO2). Scopo del lavoro L’esperimento proposto ha lo scopo di valutare se le cellule L929 vanno incontro a morte per apoptosi in seguito al trattamento con il farmaco anti-tumorale etoposide, anche indicato con la sigla VP-16, oppure con il tassolo (Paclitaxel). Esecuzione I giorno Osservare le piastre Petri al microscopio. Cambiare il terreno (2 ml / piastrina). arrivando ad una Mettere le Petri nell’incubatore per 24 ore. II giorno Osservare le piastre al microscopio. Lavare il vetrino contenuto nelle piastre in PBS (soluzione 1). Fissare per 5 minuti in etanolo 95% (soluzione 2). Lasciare asciugare a temperatura ambiente. Effettuare la colorazione con ematossilina-eosina secondo il protocollo seguente: - etanolo 70% (soluzione 3) - H2O distillata - ematossilina (soluzione 4) - H2O distillata - eosina 0,5% con goccia di CH3COOH (soluzione 5) - H2O distillata - etanolo 70% (soluzione 3) - etanolo 95% (soluzione 2) - etanolo 100% (soluzione 6) Prelevare il vetrino dalle piastre: - xilene (sotto cappa chimica!!) - sintex Osservare i preparati al microscopio. Reagenti utilizzati terreno DMEM contenente penicillina 1 bovino (FCS) 10% v/v etoposide 1 mM tassolo 1 mM tripsina 1x (2,5 mg/ml) in PBS Reagenti forniti e numero di identificazione 1. 2. 3. 4. 5. 6. 4 minuti 1 goccia. Coperchiare il vetrino su un vetrino portaoggetti e lasciare asciugare fino al giorno seguente. III giorno 2 minuti 5 minuti 3 minuti sciacquare 1-2 minuti MAX sciacquare 2 minuti 1 minuto 2 minuti. PBS etanolo 95% etanolo 70% ematossilina eosina 0,5% acidificata con CH3COOH etanolo 100% RISULTATI