MEDICINA
di
LABORATORIO
appunti dalle lezioni
1
Capitolo 1
SIEROPROTEINE
2
ELETTROFORESI
Le proteine del siero ammontano in totale a 6-8 g/dl; nel neonato 5 g/dl.
Aumento delle proteine totali:
- disidratazione
- cambiamenti posturali
- epatopatie (accumulo di γglobuline)
- tumore delle plasmacellule
- infezione cronica (aumento Ig)
- anemia (aumento transferrina)
Diminuzione delle proteine totali:
- iperidratazione (ad es. nella gravidanza)
- malnutrizione
- dieta non equilibrata
- malattie renali
- epatopatie
- enteropatie protido-disperdenti
- malassorbimento
- ustioni
- eccessivo catabolismo
L’elettroforesi viene eseguito sul siero (ciò che rimane del plasma dopo l’evento coagulativo); non
sul plasma il quale è ricco di fibrinogeno che si annida tra le γglobuline e C3 (posizione occupata di
solito dalla componente monoclonale)
A pH 7,4 prevale la dissociazione tra gli amminoacidi (gruppi COO¯). Le cariche si spostano verso
il polo positivo (anodo) di elettroforesi.
3
L’elettroforesi permette di evidenziare 5 bande.
1) Banda A corrispondente all’albumina (ALB)
2) Banda α1 corrispondente ad α1antitripsina (AAT) ; α1antichimotripsina (AAC);
α1glicoproteina acida (AAG); α-fetoproteina
3) Banda α2 corrispondente ad aptoglobina (HPT); α2macroglobulina (AMG); ceruloplasmina
(CER)
4) Banda β corrispondente a transferrina (TRF) (nella parte anodica) e C3 (nella parte catodica)
5) Banda γ corrispondente alla maggior parte delle immunoglobuline
1)
- Prealbumina
- La prealbumina è un ottimo indicatore di nutrizione perché ha una emivita t1/2=48 h
- La prealbumina trasporta gli ormoni tiroidei e partecipa all’equilibrio tra frazione libera e frazione
legata; trasporta RBP (retinol binding protein), indicatore nutrizionale e nelle urine di sofferenza
renale
- PROTEINE DI FASE ACUTA
La diminuzione di prealbumina (proteina che occupa la parte più anodica della banda A) può
indicare uno squilibrio nutrizionale o la presenza di una malattia infettiva o un’infiammazione
acuta. Bisogna fare gli indicatori di fase acuta (FASE RATTIVA ACUTA: risposta aspecifica con
aumento della sintesi di alcune siero proteine).
- proteina C reattiva (CRP)
- velocità di eritrosedimentazione (VES)
- In fase acuta ↑VES riflette ↑[FIB]
- In fase cronica ↑VES riflette ↑[FIB]; ↑[Ig](indicano il passaggio a infiammazione cronica);
↑anemia (se non c’è microcitosi)
- La VES aumenta alla fine della prima settimana di malattia e nelle gammopatie monoclonali da
IgM, IgA, IgG.
Intervalli di riferimento VES
Età <60 anni
Età >60 anni
MASCHI
2-13 mm/h
2-24 mm/h
FEMMMINE
Età <40 anni
2-16 mm/h
FEGATO
(sintesi di proteine di
fase acuta)
IL-1
Età >40 anni
2-35 mm/h
CERVELLO
(febbre, sonno)
IL-1
IL-6
IL-6
FAGOCITI
TESSUTI
(stimolazione di proteolisi
muscolare, fibtoblasti, calore)
4
- CRP è la più precoce e sensibile proteina di fase acuta
- A volte è associato ↑SAA (infiammazione acuta)
- Cascata delle proteine di fase acuta
- PRECOCI: ……………….CRP e AAC
- INTERMEDIE: …………..HPT, AAG, AAT, C4, FIB
- TARDIVE: ……………….C3, CER
RISPOSTA di FASE ACUTA
Figura 1: PCR = proteina C reattiva (precoce); PFAN = proteine di fase acuta negativa
Nell’epatopatico e parzialmente nel nefropatico la reazione di fase acuta è soppressa.
5
- ALB (albumina)
Figura 2: rappresentazione di una molecola di albumina con siti di legame per molecole e ioni trasportati
-Proteina di 580 aa; sintetizzata dal fegato (ne basta il 25%)
-Livello ematico normale: 3,5-5,0 g/dl
-Indicatore di stato nutrizionale (ma t1/2=15-19gg)
-Carrier di anioni, soprattutto bilirubina (che nei neonati può ledere i nuclei della base); acidi grassi
liberi; ormoni steroidei; cationi (Ca2+; Cu+/2+)
-Sorgente di aa per i tessuti periferici
-Agisce come tampone
-Proteina di fase acuta negativa (diminuisce nella flogosi)
Acidi grassi liberi si formano nel digiuno. l’albumina li porta al fegato che sintetizza nuovi
trigliceridi e li lega alle VLDL (utili per il miocardio).
Ci sono analbuminemie congenite senza edema (la sintesi di altre globuline plasmatiche mantiene la
pressione oncotica) ma con alterazione del metabolismo dei grassi.
Ca2+: 10 mg/% o 5 mEq/l legati per metà all’albumina. Questa metà è in effettiva; importante è la
componente libera. Il rapporto tra Ca2+ libero e legato dipende dal pH. Alterazioni dell’equilibrio
acido-base possono far associare Ca2+ e albumina portando ipocalcemia.
Cu+: 80 mg/l legato per il 10% all’albumina e per il 90% alla cerulo plasmina. Si lega a residui di
istidina (Hys). Dalla velocità di legame e dall’affinità dipende la biodisponibilità.
Iperalbuminemia, rara, dovuta a disidratazione
Ipoalbuminemia: (<3,2 g/dl) -epatopatie croniche
-malnutrizione
-edema (<2,5g/dl), ascite
-perdite intestinali
-malattie renali
-malattie cutanee secernenti
-ustioni
Bisalbuminemia: banda dell’albumina sdoppiata.
-Il paziente può averla parchè il fegato produce il 50% dell’albumina con 1aa diverso
(alloalbuminemia)
-Può essere indotta da farmaci in caso di superdosaggio o da patologie quali ipotiroidismo e
pseudo cisti pancreatica.
6
2) zona elettroforicamente poco rilevante
- AAT (α1antitripsina)
- Responsabile del picco delle α1.
- E’ un inibitore delle proteasi seriche:
- collagenasi ed elastasi nei processi infiammatori del
polmone (si può arrivare anche all’enfisema); funzione
primaria
- fattori della coagulazione; funzione secondaria
- Se il picco delle α1 è basso si richiede l’esame per sapere se c’è una mancanza congenita di AAT
(omozigosi per allele Z); α1antitripsina inferiore a 15% del normale.
- Livello ematico normale: 0,8-2 g/l
- ↑ in situazioni di flogosi causate da infezioni e necrosi dei tessuti.
- AAG (α1glicoproteina acida)
- Costituita per il 50% da glucidi e per il 50% da aa; particolarissima
- Non si conosce la sua esatta funzione.
- E’ un indicatore di fase acuta:
- ↑ nei processi infiammatori, pare a causa della proliferazione
cellulare
- ↑ anche in gravidanza e nei tumori, non è un indice molto
sensibile
- è ↑ dai glucocorticoidi, nelle neoplasie, nelle flogosi, nello
stress chirurgico
- ↓ nelle epatopatie, nelle malattie renali, estrogeni
- AAC (α1antichimotripsina)
- Proteina che aumenta precocemente nelle reazioni di fase acuta
- α-fetoproteina
- Presente nel feto, diminuisce notevolmente dopo la nascita
- ↑Aumenta - in gravidanza, nell’epatocarcinoma e nel teratoma testicolare
- nel liquido amniotico e nel siero materno in caso di anencefalia e spina bifida
-↓Diminuisce - nel siero della madre se c’è trisomia 21 (Down)
7
3)
- HPT (aptoglobina)
- E’ una proteina di fase acuta
- ↑ nelle infiammazioni acute e croniche, nelle neoplasie e nelle nefrosi (per aumentata sintesi del
genotipo di HPT z-z che non passa il filtro renale)
- La sua principale funzione è però legare l’emoglobina libera a seguito di emolisi intravasale
(processo patologico) formando un complesso che non viene filtrato a livello glomerulare (in
corrispondenza del tubulo contorto distale e dotto collettore dove il pH si abbassa precipiterebbe
formando dei cilindri che possono danneggiare il rene). Il complesso HPT-Hb viene captato dal
fegato. se l’emolisi è eccessiva intervengono nell’ordine l’emopessina (si lega all’eme) e l’albumina
(metalbumina).
- ↓ in crisi emolitica, anemia, avvelenamento, valvole cardiache che lisano i globuli rossi.
- AMG (α2macroglobulina)
- E’ una proteina ad alto peso molecolare (fino a 1000000 Da)
- E’ un inibitore delle proteasi e controlla il C’
- Importante ad es. nella gestosi gravidica = ipertensione arteriosa in gravidanza. Renina- proteasi:
se non c’è più un inibitore la pressione arteriosa sale.
- ↑ nella sindrome nefrosica
- ↓ nella risposta di fase acuta, nelle pancreatiti, nel carcinoma della prostata.
- CER (ceruloplasmina)
- Proteina azzurra, se purificata, perché trasportatore di rame e responsabile della cupremia. Una
molecola lega 8 atomi di Cu (4Cu2+ o 4 Cu+).
- Ossida il ferro ferroso Fe2+ a ferro ferrico Fe3+ e altre molecole come ad es. neurotrasmettitori
(amine biologiche); è uno “scavenger” dell’O2¯.
- ↑ in gravidanza (bersaglio di estrogeni); nelle infiammazioni; neoplasie e leucemie come linfoma
di Hodgkin
- ↓ nel morbo di Wilson (alterazione del metabolismo del Cu con suo accumulo in rene, fegato,
cervello e degenerazione epatolenticolare) e in cirrosi giovanile.
- Se la cupremia è 30 mg/l (e CER è quindi nei limiti della norma) richiedere la cupruria (ricerca di
Cu nelle urine)
8
4)
- TRF (transferrina)
- METABOLISMO DEL FERRO:
Il ferro è introdotto con la dieta sotto forma di Fe alimentare.
Si lega a una FERRITINA intestinale (1 apoferritina lega 8 atomi di Fe) che lo trasporta
nell’eritrocita.
Sulla membrana basolaterale dell’eritrocita si trova la TRANSFERRINA, una proteina
abbondante (240 – 250 mg/dl).
Il Fe3+ lega la transferrina saturandola; essa lo trasporta nel torrente ematico.
In questi passaggi il ferro cambia valenza da Fe2+ a Fe3+.
- La ceruloplasmina ossida il ferro e permette che venga legato alla transferrina.
TRF + 2 atomi di Fe3+ → TRF diferrica (1/3 delle molecole)
TRF + 1 atomo di Fe3+ → TRF monoferrica (2/3 delle molecole)
TRF diferrica ha maggior attività nei confronti dei recettori periferici.
Tramite la circolazione sanguigna il ferro giunge al fegato.
- Nel fegato c’è lo scambio di Fe tra transferrina e ferritina epatica (di deposito); essa è responsabile
del mantenimento del 30% di saturazione della TRF, perché cede o acquista Fe a seconda che il
livello di saturazione sia minore o maggiore del 30%.
- Il midollo osseo è il principale bersaglio del ferro
- Tutte le cellule necessitano ferro per la sintesi di DNA e RNA (enzima ributile reduttasi riduce il
ribosio a desossiribosio)
- I recettori della TRF, presenti su tutte le cellule, captano il Fe ed entrano nella cellula dove
liberano il Fe per poi tornare al loro posto sulla membrana.
- Esiste a questo livello un meccanismo a feedback:
- Se nella cellula c’è poco ferro viene sintetizzato più recettore; i componenti del recettore
vanno in circolo e con gli esami si dimostra carenza di ferro
- se c’è troppo ferro il recettore è più lento nel trasportarlo all’interno della cellula.
- Sideremia normale: 50-100μg/dl
- Eritrociti anomali, diminuzione della sideremia, aumento della transferrina (con saturazione
<30%); verificare la ferritina circolante che rispecchia il livello di ferritina di deposito
- La ferritina si alza quando c’è un’infezione (come proteina di fase acuta); perciò si procede al
dosaggio dei recettori solubili della transferrina.
- Nelle malattie infettive la transferrina tende a diminuire
ANEMIA: condizione che si verifica quando:
- ↓ sideremia → < 30 – 40 μg/dl
- ↓ [Hb] di un globulo rosso → piccolo con volume < 80 MCV (volume corpuscolare medio)
- ↓ [Hb] totale del sangue
La situazione opposta è l’emosiderosi e si verifica se la sideremia è > 150 μg/dl.
La principale causa di anemia è la carenza di ferro; in questo caso si ha: - ↓ sideremia
- ↑ TRF
- ↓ saturazione TRF %
Non è però l’unica causa, anche infezioni croniche e neoplasia possono dare anemia, senza che ci
sia carenza di ferro: - ↓ sideremia
- ↓ TRF
- ↓ saturazione di TRF %
9
Per verificare se ci sia un’anemia ci sono 3 livelli di indagine:
-1- Valutare TRF
- TFR aumenta in stati ferrocarenziali, in gravidanza, nella terapia estroprogestinica, anemia metaemorragica
- TFR diminuisce nelle sindromi protido-disperdenti, nelle anemie delle
malattie croniche (processi infiammatori e neoplastici), nelle epatopatie (per
diminuita sintesi epatica), malnutrizione, atransferrinemia congenita
-2- Valutare la [C] della ferritina circolante che rispecchia la [C] della ferritina di deposito. Se è
diminuita c’è anemia. Tuttavia essendo una proteina di fase acuta essa sarà
aumentata se c’è un’infiammazione, anche questa è accompagnata da anemia
-3- Ricercare i recettori solubili della TRF. Essi consentono di valutare il deficit di ferro a livello
cellulare. Riflettono il numero dei recettori cellulari. E’ un indice precoce
dello sviluppo di deficit funzionale di ferro rispetto ad altri indici quali la
ferritina. A differenza di quest’ultima si mantiene normale (3 -9 μg/l) nei
pazienti con infiammazioni, neoplasie e epatopatie ed è quindi un buon indice
di discriminazione tra anemia sideropenia e anemia delle condizioni croniche.
ANEMIA EMOLITICA: abnorme distruzione dei globuli rossi con:
- ↑ sideremia,
- ↓ TFR,
- ↑ % saturazione di TRF (tutta la TRF si satura)
C’è un sovraccarico di ferro e emosiderosi
SATURAZIONE TRF
Saturazione % = (ferro μg/dl / max[Fe] trasportabile dalle proteine) x 100
- 1 mg di transferrina lega 1,26 μg di ferro (total iron binding capacity)
- 300 mg TFR lega 375 μg di Fe (bisogna vedere la percentuale di saturazione)
- Valori di riferimento: 2-3,5 g/l
- Hb: definisce il grado di anemia e esprime a posteriori una misura quantitativa della gravità
della sideropenia. da solo è un dato poco specifico
- Sideremia: rappresenta il Fe3+ legato alla TRF. Indice sensibile negli stati di lieve
sideropenia 8deplezione totale delle riserve senza però ancora anemia). Ha però ritmo circadiano e
alta variabilità individuale (maschi: 70 – 200 μg/dl; femmine: 50 - 170 μg/dl)
↑ sideremia: condizioni iperemolitiche, epatopatie con citolisi, anemia sideroblastica,
siderocromatosi ereditaria
↓ sideremia: aumentata perdita (es. mestruazioni), diminuito apporto o assorbimento.
10
- C’ (complemento)
- Il complemento è un sistema di diverse proteine di cui 9 sono le principali
- La frazione più abbondante è C3
- Il complemento si attiva per 2 vie: - classica: Ag+Ab+C1→C4+C2→C3(amplificazione)
↓
C5C6C7(MAC)
↓
C9(lisi cellulare)
- alternativa: parte dal C3b (con partecipazione di fattori B e D)
- Esami:
- diminuzione di C3 e diminuzione di C4 → via classica
- diminuzione di C3 ma C4 normale → via alternativa
- Per attivare il C’ ci vogliono 2 IgG o 1 IgM;
CASCATA del COMPLEMENTO:
C1 si lega al complesso immune e si attiva (C1s) ad esterasi; scinde C4 in C4a (inattivo) e C4b che
lega C2 facendolo diventare substrato di C1s che lo scinde in C2b (inattivo) e C2a. Il complesso
C4b2a è l’enzima C3 convertasi (esterasi) che scinde C3 in C3a (talvolta dosato come espressione
di scissione di C3) e C3b che unito alle precedenti frazioni dà vita all’enzima C5- convertasi della
via classica (C4b2a3b). La C5-convertasi scinde C5 in C5a (inattiva) e C5b.
Il complesso C4b2a3b5b per via non enzimatica lega in successione C6, C7 con passaggio del
complesso da stato idrofilo a idrofobo rendendolo adatto a inserirsi nel doppio strato lipidico della
membrana cellulare. L’ingresso di C8 e C9 permette la formazione del poro sulla membrana e
successiva lisi cellulare.
- La concentrazione del terzo componente del complemento (C3), determinata nel siero, è
considerata un indicatore di rischio dell’infarto del miocardio; infatti, esso si correla positivamente
con il colesterolo-LDL ed è prodotto dai macrofagi probabilmente durante la captazione di
lipoproteine LDL ossidate.
- C3 aumenta per blocco del suo catabolismo (blocco C3 e C3b); nella cirrosi biliare primitiva e
nelle colestasi gravi; in reazione di fase acuta
- C3 e C4 diminuisce (per attivazione del C’ per via classica) in lupus eritematoso sistemico;
poliartrite cronica primaria; anemie emolitiche autoimmuni; gastrite atrofica; glomerulonefrite
membranosa
- C3 diminuisce e C4 normale (C’ attivato per via alternativa) indice di malattie infettive
- Valori di riferimento: C3: 0,90-1,80g/l
C4: 0,10-0,40g/l
- Nell’elettroforesi su plasma tra β e γ si forma la banda del fibrinogeno;
nell’elettroforesi su siero no.
- FIB (fibrinogeno)
- molecola complessa costituita da 2 coppie di 3 catene α, β, γ.
- implicata nell’emostasi
11
5)
- Ig (immunoglobuline)
- Le immunoglobuline sono un gruppo di proteine eterogenee, che migrano principalmente nella
zona γ, ma anche nella zona β e più raramente nella zona α; costituiscono gli anticorpi umorali,
prodotti dalle plasmacellule che derivano dai linfociti B attivati.
- Esistono 5 classi di immunoglobuline (IgG, IgA, IgM, IgE, IgD) con struttura molecolare simile: 2
catene pesanti (γ,α,μ,ε,δ) e 2 catene leggere (κ,λ).
- Le IgG sono quelle a maggiore concentrazione nel siero
- IgG: 0,6 – 1,8 g/dl
- IgA: 0,08 – 1,9 g/dl
- IgM: 0,09 – 0,4 g/dl
- Se sono aumentate le IgM l’infezione è in atto o recente
- Se sono aumentate le IgG l’infezione è pregressa (cicatrice sierologica)
- Le IgM sono pentameri; le IgA dimeri (uniche Ig secretorie, presenti nel latte, nella saliva, nel
muco, nelle secrezioni intestinali); le IgG sono le uniche Ig che passano dalla madre al feto
attraverso la placenta (il bambino nasce con le IgG materne e assume le IgA del latte); le IgE sono
usate per quantizzare le allergie di I tipo (ipersensibilità di tipo I): il frammento Fc delle IgE si lega
alle mastcellule piene di granuli di istamina.
Esistono 3 principali tipi di allergia: - allergie alimentari
- allergie da contatto (polline, via cutanea)
- allergie ai farmaci (es. alla lidocaina - anestetico – non
prevedibile)
- Test che identificano prima le IgE generali, poi le IgE specifiche.
- Dalla ventesima settimana c’è un brusco aumento delle IgG materne che passano la barriera
placentare.
Comincia la sintesi da parte del feto delle IgM.
Al momento del parto le IgG materne diminuiscono e scompaiono all’ottavo mese.
Aumentano le IgM, IgG e IgA del bambino, ma fondamentali sono le IgA materne trasmesse con il
latte.
Se c’è infezione intrauterina le IgM alla nascita sono elevate.
Figura 3: sviluppo sistema immunitario dal concepimento a 6 mesi di vita
12
- In condizioni normali la proporzione nella produzione di catena pesante e leggera è 1:1.
- Nel mieloma la plasmacellula sintetizza più catene leggere di quelle pesanti; catene leggere libere
in forma dimerica→proteinuria dio Bence-Jones (catene leggere-140aa-di IgG precipita a 60°-80°)
- γ-patie policlonali: l’aumento delle proteine della zona γ si estende a tutto il tratto della zona
- epatopatie
- malattie del collageno
- infezioni
- γ-patie monoclonali: si osserva un picco ristretto nella zona γ
QUADRI CLINICI TIPICI:
- LES (Lupus Eritematoso Sistemico), malattia autoimmune
-↓C3,C4;
↑PCR;
γ-patia policlonale
- IMMUNODEFICIENZA
-alta la banda α1 e α2
basse o in tracce IgG, IgA, IgM
- SINDROME NEFROSICA
-alta la α-macroglobulina
La terapia sostitutiva con estrogeni (sia terapeutica che anticoncezionale) simula una reazione di
fase acuta:
-↑TFR, HPT, α1, α2, AAT, CER.
-MIELOMA MULTIPLO
-es. ↑IgG e soppressione di IgM e IgA
γ-patia monoclonale
- Il siero del neonato ha elevati livelli di PCR, α-macroglobulina, α-antitripsina; se sono elevate
anche IgM e IgA è in corso un’infezione.
INDICAZIONI allo STUDIO delle PLASMAPROTEINE
123456-
Presenza componenti monoclonali
Presenza e severità di un processo flogistico (se ↑ PCR)
Aumento turnover eritrocitario (vedere TRF, saturazione, HPT- anemia emolitica)
Attivazione del complemento (dosare C3 e C4 → malattie autoimmuni)
Perché la VES è aumentata (associata a ↑ FIB o ↑ proteine di fase acuta)
Stato nutrizionale (se l’albumina scende c’è un grave carente stato nutrizionale, doso ALB,
pre-ALB, RBP, TRF))
7- Patologie da deficit di proteine specifiche (AAT → enfisema, CER → morbo di Wilson)
8- Follow-up e controllo dell’efficacia della terapia
13
Capitolo 1.1
COMPONENTE
MONOCLONALE
14
COMPONENTE MONOCLONALE
Picco γ causato da:
- iperproliferazione di un clone di plasmacellule
- sintesi di Ig omogenee per struttura e specificità
- deficit a carico delle altre Ig
Più del 95% dei soggetti ha una componente monoclonale <15 g/l
Il 92% dei soggetti ha una componente monoclonale <10 g/l
Il rischio di progressione è strettamente associato con la componente monoclonale.
CONDIZIONI ANOMALE ASSOCIAT E alle Ig
- MGUS: gammopatia monoclonale di incerto significato
Benigno. Si ha nel 99% dei casi (IgM, IgG, IgA o IgD)
- MIELOMA MULTIPLO: riguarda IgA e IgG. Nel MM il rapporto tra catene H e L è >1:1.
Ci sono catene L singole o dimeriche libere nel sangue. Nelle urine si ritrovano le proteine
di Bence-Jones. Il clone invade il midollo osseo provocando anemia, leucopenia e difficoltà
alla coagulazione.
- MACROGLOBULINEMIA di WALDENSTRÖM: linfoma che riguarda le IgM
MALATTIE CAUSATE da Ig
- CRIOGLOBULINEMIA I e II: sono Ig che precipitano ad una temperatura compresa tra 4
e 37 °C. Possono essere costituite da Ig singole monoclonali, Ig monoclonali con attività
anticorpale verso Ig policlonali, Ig policlonali miste. causa della precipitabilità: forse
contenuto ridotto in carboidrati.
- AMILOIDOSI: deposizione
IMMUNODEFICIENZE
- AIDS è la più comune
STIMOLAZIONE CRONICA
- Malattie autoimmuni (LES, artrite reumatoide)
- Infezioni croniche
TRANSIENTI
- Infezioni pediatriche
- Passaggi neonatali dalla madre
- Infezioni virali
- A seguito di un trapianto di midollo
- Ipersensibilità ai farmaci (soprattutto sulfamidici)
- MGUS è l’unica condizione benigna; come differenziarla dalle altre e specialmente dal MM
(mieloma multiplo)?
3 parametri: - % di plasmacellule nel midollo
- proteine circolanti nel siero
- manifestazioni cliniche
MGUS
MIELOMA
MACROGLOB. di
AMILOIDOSI
MULTIPLO
PRIMARIA
WALDENSTRÖM
% plasmacellule
≥10
≥10
<10
<10
% proteine
≥3
≥3
<3
<3
sintomatico
NO
SI
SI
SI
15
Secondo uno studio americano i soggetti con MGUS sono a rischio per lo sviluppo del mieloma.
Qual è il rischio reale?
L’unico fattore di rischio accertato per la progressione di MGUS a MM è la [C] di CM:
↑ CM → ↑ rischio
Sospetto di MGUS; TEST RACCOMANDATI:
- Visita
- Emocromo
- Siero, calcio, creatinina
- Elettroforesi del siero → proteine totali
- Elettroforesi delle urine → secrezione proteine nelle urine delle 24h
- Immunofissazione del siero e delle urine → per discriminare CM
- Catene L (κ e λ); non è un esame standard
- Esame del midollo osseo
Non si eseguono se CM<1,5 g/dl perché troppo invasivi
- Biopsia dello scheletro
Se la componente monoclonale è >15 g/l si proceda con: → biopsia ossea
→ radiografia dello scheletro
PATOLOGIA
MGUS (> o = 50 anni)
Mieloma multiplo
AL amiloidosi
Waldenström (maschi)
Waldenström (femmine)
INCIDENZA
3,2%
40 /(milione di persone per anno)
8,9 /(milione di persone per anno)
3,4 /(milione di persone per anno)
1,7 /(milione di persone per anno)
Per diagnosticare mieloma: - CM in siero e/o urine + plasmacellule nel midollo
e uno dei seguenti:
- Calcium elevation
- Renal insufficiency
- Anemia
- Bone desease
- MIELOMA MULTIPLO (MM)
Massa clonale
- anemia
- citopenia
- plasmocitoma
- immunodeficienza
Citochine
- anemia
- distruzione osso
- reazione di fase acuta
- immunodeficienza
Componente M
- rene da mieloma
- iperviscosità
- immunodeficienza
Il soggetto con mieloma deve essere trattato solo se sintomatico
16
AMILOIDOSI
- Clone molto piccolo che produce una proteina molto tossica.
- Amiloidosi: deposito extracellulare di proteine autologhe che si riuniscono in fibrille con struttura
a foglietto β causando un danno funzionale e strutturale dell’organo coinvolto. Le proteine tendono
ad aggregare perché nella struttura β sono termodinamicamente meno stabili rispetto alle proteine
normali. Stimoli principali: T°C, pH, ioni metallici, ossidazione.
- Amiloidosi più diffusa è l’Alzheimer
- L’amiloidosi deriva dall’azione proteolitica su un precursore che nel caso delle gammopatie sono
le catene L prodotte dalle plasmacellule
CAUSA BASILARE:
- La amiloidosi si basa sul fatto che una proteina può assumere 2 conformazioni diverse: una ad α
elica (non tossica) e una a β foglietto ripiegato (tossica); la quale provoca una malattia simile a
quella dei prioni (PrP) per eziologia.
- Birifrangenza verde mela con luce polarizzata dopo colorazione rosso congo; fibre non ramificate
con diametro di 10 nm
- Alcune forme di amiloidosi sono localizzate, altre sistemiche. si classificano sulla base della
proteina coinvolta:
- Proteine amiloidi: - β → Alzheimer
- PrP → encefalopatie spongiformi
- L (catene leggere immunoglobuline monoclonali) → sistemica
- Nell’80% dei casi catene libere leggere λ che si depositano nei tessuti tranne il cervello
- Macroglossia (12% dei pazienti con amiloidosi)
- Porpora periorbitaria (6%); aspetto tipo procione (lesione periorbitaria, rottura di piccoli vasi)
- Pseudoipertrofia muscolare (<1%)
- Lesioni alle unghie (2-3%)
- Shoulder pad
DIAGNOSI
- Aspirato in regione periombelicale con ago sottile e colorazione.
- Identificare e caratterizzare CM con elettroforesi ad alta definizione su agarosio o capillare
associata a immunofissazione.
Nel 56% dei pazienti con AL non si vede niente sul tracciato elettroforetico. L’immunofissazione
aumenta di 10 volte la sensibilità dell’elettroforesi
17
PROTEINA di BENCE-JONES (BJ)
Proteina costituita da catene leggere libere monoclonali secrete da cellule B. E’ stato il primo
marcatore di neoplasia scoperto. Il clone può essere sia maligno (solitamente associato a MM) che
benigno (associato a MGUS)
Cenni storici. La proteina di BJ fu osservata per la prima volta da un medico inglese (Watson) in
urine riscaldate. Il calore denatura le proteine le quali precipitano. L’ALB forma un precipitato che
non si scioglie mai; la proteina di BJ ha, invece, un comportamento particolare: verso la
temperatura di 60°C sii forma il precipitato, che però si scioglie se continuiamo a riscaldare
(T≈90°C) per poi riformarsi nuovamente durante il raffreddamento. Il dottore parlò di questa sua
scoperta al dr Bence-Jones che se ne attribuì il merito in una pubblicazione.
Le catene leggere possono essere di tipo κ o λ. si ritrovano entrambe in queste proporzioni 2/3 di
catene κ e 1/3 di catene λ. Le catene λ formano dei dimeri che filtrano meno facilmente dei cloni κ
nelle urine. Come risultato si avrà - una % maggiore di cloni λ nel siero
- una % maggiore di cloni κ nelle urine
Tutti gli individui producono catene leggere in eccesso. Si ha quindi una perdita giornaliera
fisiologica di catene libere policlonali (PELC) di circa 5-10 mg/die. Esse formano piccole bande
oligoclonali sul tracciato elettroforetico delle urine. Si parla anche di tracciato a scala.
MALATTIE ASSOCIATE a BJ-P
- Comuni:
- mieloma multiplo
- amiloidosi AL
- morbo di Waldenström
- malattia da deposito
- Rare
- linfoma
- leucemia linfatica cronica
- idiopatie (benigne o di incerto significato)
Le proteine di BJ vanno ricercate nelle seconde urine del mattino tramite un’elettroforesi seguita da
immunofissazione. Gli antisieri utilizzati sono anti-κ, anti-λ totali con l’aggiunta dell’antisiero antiCH della CM.
Da 3 anni esiste un test, chiamato FREELITE, che consente di valutare il rapporto κ/λ delle catene
leggere libere nel siero. E’ un test di routine per pazienti con gammopatie monoclonali.
TEST da SCORAGGIARE (inadatti per la ricerca di proteine di BJ)
- proteine totali nelle urine (precipitazione, legame col colorante [dye binding]; test poco
sensibile)
- stick delle urine (sostanza che cambia colore in presenza di proteine acide come l’ALB e
non “vede” le proteine di BJ)
- test al calore (heat test); poco sensibile e poco specifico.
Sensibilità dei diversi metodi
- IFE: 1 proteina su 102- 103 ← STANDARD
- citogenetica e southern blot: 1 su 102
- FISH in interfase: 1-5 su 103
- citofluorimetria: 1-5 su 103 - 104
- PCR: 1 su 105- 106
18
Capitolo 1.2
TECNICHE
ELETTROFORETICHE
19
ELETTROFORESI
L’elettroforesi consiste nella migrazione di particelle elettricamente cariche in un campo elettrico E.
Nel plasma a pH 7,4 le proteine che hanno punto isoelettrico minore del pH fisiologico si
dissociano come anioni. Poste in E migrano verso il polo + con velocità che dipende:
- dalla carica elettrica
direttamente proporzionali alla v di
- dalla forza di E
migrazione
- dimensione e forma della molecola
- proprietà del mezzo di supporto
inversamente proporzionali alla
v di migrazione
TIPI di SUPPORTO: sono vari; i principali sono agarosio, gel di poliacrilamide o soluzioni.
Permettono la separazione in base a carica e dimensione. Spesso si aggiunge un detergente carico
negativamente (sodio dodecilsolfato) che eguaglia le cariche di superficie e consente la separazione
solo sulla base della dimensione molecolare.
Dopo la separazione le proteine vengono evidenziate con opportune colorazioni.
Un particolare tipo di elettroforesi è l’ELETTROFORESI CAPILLARE. In essa la separazione
elettroforetica avviene in un tubo di silice fusa lungo 30-50 cm e diametro compreso tra 10 e 75 μm.
Il tubo è riempito con una soluzione tampone. Le due estremità del capillare sono immerse in due
provette contenenti lo stesso tampone. la separazione avviene in seguito all’applicazione di una
differenza di potenziale tra le due estremità. La v delle particelle è in funzione del rapporto
carica/massa. Le proteine cariche negativamente sono attratte dall’anodo (+). Tuttavia all’interno
del capillare si sviluppa anche un flusso del tampone in direzione del catodo (‒). Tale fenomeno è
chiamato ELETTROENDOSMOSI. Esso è dovuto alla presenza di gruppi carichi negativamente
sulla superficie del capillare (neutralizzati da una “nuvola” di cariche positive. Quando si applica
una d.d.p. ioni positivi sono attratti dal catodo e, migrando, trascinano con sé la soluzione in cui
sono immersi.
- il capillare è in silice e ha cariche negative che vengono neutralizzate da ioni positivi
- applicando una differenza di potenziale (V) gli ioni vanno verso il catodo (flusso osmotico,
trasporto di acqua) e le proteine verso l’anodo
- Il flusso endosmotico vince sulla forza elettroforetica perciò tutte le proteine vanno verso il catodo
(negativo)
- Ig → carica + migrano verso il catodo
- ALB → carica ‒ trascinata dal flusso endosmotico verso il catodo
VANTAGGI: è un metodo automatizzabile; limite CM>0,5 g/l; utile nel monitoraggio dopo una
terapia.
SVANTAGGI: non consente l’immunofissazione; la CM può scomparire perché interagisce col
capillare. E’ un’eventualità rara, ma possibile, che può portare a una diagnosi totalmente errata.
Ricordare che CM può migrare fino a zona α2 (IgA)
20
Al posto dell’immunofissazione, dopo elettroforesi capillare è possibile applicare il metodo
dell’immunosottrazione (IF-ES) che permette di valutare il contributo di ciascuna Ig al picco γ:
classi e tipi di Ig sono rimossi dal campione usando Ab anti-Ig specifici per IgG, IgA, IgM, λ e κ.
Dopo l’aggiunta di ogni Ab si ripete l’elettroforesi per valutare come si è modificato il tracciato.
Campione da testare → aggiungo Ab-anti-IgG
Figura 4: immunosottrazione (IF-ES)
Campione senza IgG +
precipitato IgG-anti-IgG
IMMUNOFISSAZIONE (IFE): rende 10 volte più sensibile l’elettroforesi (perché aumenta la
quantità di proteina presente). tecnica usata per caratterizzare e quantificare una proteina.
Procedimento:
- elettroforesi
- aggiunta di un Ab specifico per un CM, incubazione
- eseguire ripetuti lavaggi delle proteine che non hanno reagito
- evidenziare la banda di immunoprecipitazione con opportuna colorazione
La quantificazione della banda è eseguita con tecniche di densiometria
21
Capitolo 2
LIPIDI SIERICI
22
LIPIDI SIERICI E RISCHIO ATEROSCLEROSI
Attualmente la principale causa di mortalità nei paesi sviluppati sono le malattie cardiovascolari.
Esse sono un disordine generalizzato delle arterie caratterizzato dalla formazione e progressivo
accrescimento di placche ateromasiche culminanti con l’occlusione parziale o totale del lume
vasale.
A seguito dell’occlusione si forma un danno ischemico la cui gravità è proporzionale alla natura
dell’arteria coinvolta.
I distretti più frequentemente coinvolti sono:
- le coronarie
- le carotidi e il circolo cerebrale
- arterie degli arti inferiori
L’aterosclerosi interessa l’intima e la media delle arterie e consiste in accumulo vascolare di lipidi,
danno e attivazione endoteliale, attivazione e adesione piastrinica, infiltrazione infiammatoria,
proliferazione di cellule muscolari lisce e loro degenerazione in “cellule schiumose” (cappello
fibroso + core lipido-necrotico) e sovrapposizione di complicanze trombotico-occlusive. C’è una
correlazione tra il fenomeno infiammatorio (quantificato dosando la CRP) e l’infarto. La placca da
sola è asintomatica.
I lipidi sierici - aumentano nelle patologie degenerative (neoplasie e aterosclerosi)
- sono diminuiti ma stanno riaumentando nelle patologie infettive
ATEROSCLEROSI:
FATTORI di RISCHIO:
- MAGGIORI- iperlipidemia
- fumo di sigaretta
- ipertensione
- diabete
-età avanzata
- gotta e iperuricemia
- angina pectoris
- morte cardiaca acuta
- infarto del miocardio
-PREDISPONENTI- sovrappeso
- inattività fisica
- storia familiare
-CONDIZIONALI- ipertrigliceridemia
- elevati livelli di Lp(a)
- elevati livelli di
omocisteina
- elevati livelli di
fibrinogeno
- marcatori infiammatori
23
LIPIDI di INTERESSE CLINICO
--COLESTEROLO TOTALE
≤200 mg/dl ; se colesterolo >240 mg/dl → rischio elevato
se colesterolo <150 mg/dl è basso;
> 350 mg/dl è aterogeno
per valori compresi tra 150 e 350 il rischio è determinato dalla quantità di HDL
disponibile (importante per sequestrare il colesterolo trasportato dalle LDL)
--HDL
La [HDL] plasmatica è inversamente correlata all’insorgenza di malattie cardiovascolari.
HDL ha un ruolo nel trasporto retrogrado del colesterolo, forse ha proprietà antiossidanti e
antiinfiammatorie.
VALORI di HDL
basso
medio
alto
maschi
<35
35-55
>55
femmine
<45
45-65
>65
Nelle donne la stimolazione da parte degli estrogeni promuove un aumento delle lipoproteine HDL;
effetto analogo è dato dall’assunzione di livelli moderati di vino rosso (paradosso francese)
--LDL
Elevate concentrazioni di colesterolo LDL producono un aggravamento del rischio cardiovascolare.
- LDL > 130 mg/dl → valore di ALLARME
- LDL < 100 mg/dl → se ci sono già stati problemi coronarici
Valori molto elevati di LDL si riscontrano nelle varie forme di iperlipidemia, ipercolesterolemia
familiare, ipotiroidismo, sindrome nefrosica, ostruzione biliare, gravidanza.
Esistono due differenti forme di LDL che hanno potenzialità aterogene diverse.
- Fenotipo A: lipoproteine grandi e poco dense
- Fenotipo B: lipoproteine piccole e dense
Il fenotipo B ha un rischio aterogeno 3 volte superiore al fenotipo A.
la predominanza del fenotipo B è ereditaria ed è una condizione denominata
PROFILO LIPOPROTEICO ATEROGENO (PLA); è un quadro caratterizzato da:
- LDL a fenotipo B che si accumulano più facilmente delle A nell’intima delle arterie
- LDL più ricche in fosfolipasi AL e più suscettibili all’ossidazione
- ridotta concentrazione di HDL soprattutto fenotipo 2b, che sono le più efficienti nel
trasporto inverso del colesterolo
- ridotto potenziale fibrinolitico
- maggiore incidenza di diabete di tipo 2
- ipertrigliceridemia
Questo quadro è presente almeno nel 50% dei soggetti con malattie cardiovascolari.
La valutazione del fenotipo LDL non è un esame esteso a tutta la popolazione e non è eseguibile in
tutti i laboratori, ma solo in centri altamente specializzati.
24
--TRIGLICERIDI
Tra ipertrigliceridemia e rischio di malattie cardiovascolari esiste un’associazione; tuttavia non è
chiaro se essa è imputabile ai trigliceridi stessi e alle lipoproteine che li trasportano o ai disordini
metabolici associati all’ipertrigliceridemia.
- trigliceridi > 150 mg/dl → soglia di rischio (spia di altre alterazioni metaboliche
potenzialmente aterogene come ↑ LDL
- trigliceridi > 200 mg/dl → rischio indipendente
Esiste un dimorfismo sessuale nella concentrazione dei trigliceridi:
- fino ai 20 anni uguale nei 2 sessi
- nella vita adulta è superiore nell’uomo
- dopo la menopausa uomo e donna tornano ad avere gli stessi valori
L’ipertrigliceridemia è presente più facilmente in obesi, sedentari, iperlipidemie familiari,
pancreatiti, diabete di tipo 2, insufficienza renale cronica, abuso di alcool, fumo di sigaretta,
gravidanza.
25
Capitolo 2.1
LIPOPROTEINE
e
DISLIPIDEMIE
26
METABOLISMO e STRUTTURA delle LIPOPROTEINE
I lipidi sono sostanze apolari, non solubili nel plasma. Vengono trasportati dalle lipoproteine,
molecole sferiche che presentano un involucro esterno composto da fosfolipidi (bipolari),
apoproteine e colesterolo libero (dà stabilità alla struttura). La struttura delle lipoproteine ricorda
quella della membrana cellulare. Il core della molecola è costituito da colesterolo esterificato e
trigliceridi. Esistono differenti classi di lipoproteine suddivise in base alla composizione chemica e
alla densità.
- CHILOMICRONI: lipoproteine sintetizzate nella mucosa intestinale costituite da una
piccola frazione proteica di apoB48, apoAI, apoAIV, apoCI, apoCII, apoCIII. trasporta trigliceridi
alimentari e vitamine liposolubili.
la proteina ApoB (proteina principale del metabolismo lipidico) consta di due isoforme:
- ApoB48: di origine intestinale per trasporto di lipidi di provenienza alimentare
- ApoB100: sintetizzata nel fegato, si trova nelle LDL per trasporto dei lipidi
endogeni
Derivano dalla trascrizione di un singolo gene, per modificazione post-trascrizionale si
differenziano.
dal lume intestinale i chilomicroni passano nel sistema linfatico e da qui nella circolazione
sanguigna tramite il dotto toracico. Così facendo assicurano la disponibilità di grassi ai tessuti
periferici.
in circolo subiscono due modificazioni principali:
-1-IDROLISI dei trigliceridi ad acidi grassi e glicerolo (gli ac. grassi sono la forma in cui i
lipidi sono ceduti ai tessuti) ad opera della lipoproteinlipasi (LPL) endoteliale.
-2-SCAMBIO di alcune apolipoproteine: rilasciano apoAI e apoAIV e si arricchiscono di
apoC e apoE
Il complessivo impoverimento di trigliceridi dei chilomicroni si associa a una serie di
trasformazioni biochimiche che portano a due prodotti di degradazione:
-1-RENMANTS: molecole con core centrale di natura lipidica captati e distrutti dal fegato
(recettore per le LDL legato ad apoE del chilomicrone)
-2-HDL NASCENTI: precursori delle HDL plasmatiche
27
- VLDL, IDL, LDL: le VLDL sono precursori di tutte le lipoproteine a bassa densità
circolanti. Sono sintetizzate dal fegato e costituite principalmente da trigliceridi e colesterolo
endogeno. il dominio proteico è quasi esclusivamente rappresentato da ApoB100. Se si squilibra il
processo di idrolisi dei chilomicroni e sintesi delle VLDL si ha la steatosi. le VLDL sono secrete nel
torrente ematico dove subiscono due modifiche:
-1-azione dell’enzima CEPT (proteina di trasporto specifica per il colesterolo esterificato)
che catalizza il trasferimento dei trigliceridi alle HDL in scambio con colesterolo
esterificato. VLDL si trasformano in particelle più piccole e dense.
-2-scambio di apolipoproteine: ApoE e ApoC sono trasferite alle VLDL dalle HDL. ApoCII
attiva la LPL che idrolizza i trigliceridi ancora presenti trasformando le VLDL in molecole
più dense, le IDL (intermediate density lipoproteins)
Le IDL sono molecole molto instabili; per questo motivo devono essere presenti in quantità molto
bassa e rapidamente convertite in LDL. Il processo di conversione in LDL coinvolge CEPT o in
alternativa l’enzima LIPASI EPATCA, che eliminano i trigliceridi rimasti e la cessione di ApoE e
ApoC alle HDL2.
Le LDL sono quindi lipoproteine contenenti colesterolo esterificato e con un dominio proteico
costituito prevalentemente da ApoB100. Le LDL hanno un recettore periferico che al legame con
LDL la interna lizza e prende il colesterolo in essa contenuto (che viene esterificato;
contemporaneamente si blocca la sintesi di colesterolo endogeno e dei recettori per le LDL). Se le
LDL sono troppe esse si legano anche a recettori non specifici (scavenger) e nella cellula si
accumula colesterolo (cellula schiumosa)
- LPL: la sua attività è dipendente da ApoCII (fegato, endotelio, muscolo, tessuto
adiposo)
- LIPASI EPATICA: la sua attività è indipendente da ApoCII (fegato, surrene, ovaie)
- HDL: complesso costituito da un eterogeneo gruppo di particelle adibite al trasporto di
colesterolo libero, esteri del colesterolo e trigliceridi. Presentano apolipoproteine interscambiabili
(tipi A, C, D, E).
Ci sono due classi principali suddivise sulla base della componente apolipoproteica:
- HDL2: contengono ApoAI e ApoAII
- HDL3: contengono ApoAI
Sono sintetizzate prevalentemente nel fegato e nell’intestino. La loro funzione fondamentale è
opposta a quella delle LDL: trasportano lipidi dalla periferia al fegato.
Esse si legano alla superficie cellulare tramite un recettore scavenger (non specifico) che interagisce
con ApoAI e assumono il colesterolo in eccesso nella cellula.
Ci sono due enzimi fondamentali nel metabolismo delle HDL:
- LCAT (lecitina-colesterolo-acil-transferasi): trasferisce un gruppo acilico
(ac.grasso) dalla lecitina sierica al colesterolo con formazione di lisolecitina e esteri
del colesterolo
- CEPT: trasferisce esteri del colesterolo da HDL2 a VLDL in cambio di trigliceridi,
con contemporanea cessione di ApoC e ApoE alle VLDL
28
L’azione di questi due enzimi è responsabile di un metabolismo delle HDL che assume una forma
ciclica:
pre-β-HDL
(proteina nascente)
CEPT
LCAT
HDL2
HDL3
LCAT
L’HDL nascente è sottoforma di pre-β-HDL di forma discoidale; LCAT, favorendo l’ingresso di
colesterolo esterificato nella molecola, ne permette l’accrescimento (abbandono della struttura
discoidale per quella sferica) con trasformazione in HDL3 e HDL2. CEPT, invece, rimuovendo
colesterolo fa assumere a HDL2 una struttura più simile a quella delle pre-β-HDL.
Il fegato capta il colesterolo delle HDL in tre modi:
- capta le VLDL; è il colesterolo che esse hanno assunto dalle HDL2
- capta le HDL tramite recettori specifici
- capta le HDL che contengono ApoE per la stessa via dei chilomicroni
E’ importante studiare il rapporto HDL/LDL e in particolare ApoAI/ApoB100 per quantizzare il
flusso di colesterolo in ingresso e in uscita dalla cellula
-ApoAI = 20 mg
persona normale
-ApoB100 = 80 mg
persona a rischio
Tabella riassuntiva
PROTEINA
ApoAI
ApoAII
ApoB48
ApoB100
ApoCI
ApoCII
ApoCIII
ApoD
ApoE
DOVE SI TROVA
HDL
HDL
Chilomicroni
VLDL, IDL, LDL
Chilomicroni, VLDL, HDL
Chilomicroni, VLDL, HDL
Chilomicroni, VLDL
HDL, VLDL
Chilomicroni, VLDL, LDL,
HDL
FUNZIONE
Attiva LCAT
Attiva LPL
Attiva LPL
Attiva LPL
29
- Lipoproteina (a) [Lp(a)]: variante genetica delle LDL da cui differisce per la presenza di
una molecola denomina apolipoproteina(a) (apo-a) legata mediante un ponte disolfuro al dominio
proteico della ApoB100. E’ prodotta dal fegato e immessa nel circolo ematico. A causa di apo-a la
sua affinità per il recettore delle LDL è pari al 25% e quindi rimane in circolo più a lungo rispetto
alle LDL con maggiore probabilità di:
- essere ossidata
- essere captata da recettori scavenger (i più pericolosi nella
patogenesi dell’aterosclerosi perché non regolati)
La Lp(a) può indurre danno endoteliale, favorisce l’accumulo di colesterolo, promuove
complicanze trombotiche nella placca poichè ha un’azione anti-fibrinolitica in quanto è un analogo
strutturale del plasminogeno e compete con quast’ultimo per i recettori sulla fibrina.
-Lp(a) = 25-30 mg/dl
soggetto normale
-Lp(a) > 30 mg/dl
soggetto a rischio
Pare che la [Lp(a)] sia geneticamente determinata e poco modificabile con interventi dietetici e
farmacologici.
Non consigliato lo screening di massa, ma il dosaggio è raccomandato per i pazienti ad alto rischio,
in modo tale da impostare una terapia più aggressiva nei confronti di altri fattori di rischio
modificabili con un trattamento.
OSSIDAZIONE LDL
Le LDL in circolo possono subire una reazione di ossidazione da parte di MIELOOSSIDASI
circolanti o CERULOPLASMINA. La LDL ossidata ha un elevatissimo potenziale aterosclerotico
in quanto si lega unicamente ai recettori scavenger (che non hanno il meccanismo a feedback di
regolazione). E’ un meccanismo privo di controllo, che non può essere arginato dalle HDL. Il
laboratorio ancora non dosa le LDL ossidate.
- OMOCISTEINA: è un amminoacido contenente zolfo derivante dal metabolismo della
metionina. Elevati livelli di omocisteina nel sangue sono correlati positivamente con un’incidenza
maggiore di eventi cardiovascolari precoci. Essa infatti è in grado di promuovere danno endoteliale,
proliferazione della componente cellulare del vaso, innalzamento del potere aterogeno delle
lipoproteine (specialmente Lp(a)).
I principali determinanti della [omocisteina] nel sangue sono la VITAMINA B e i FOLATI, enzimi
indispensabili nel suo metabolismo. Particolare attenzione meritano quindi gli stati di carenza.
-[omocisteina] < 10 μmol/l
soggetto normale
-[omocisteina] tra 16 e 30 μmol/l
moderata iperomocisteinemia
-[omocisteina] tra 31 e 100 μmol/l
intermedia iperomocisteinemia
-[omocisteina] > 100 μmol/l
severa iperomocisteinemia
30
- FIBRIONGENO: Elevati livelli di fibrinogeno nel sangue sono correlati positivamente
con un aumento di rischio di malattie cardiovascolari. Molteplici le cause: maggiore è il fibrinogeno
presente, maggiori le dimensioni del trombo; il fibrinogeno inoltre promuove la proliferazione della
componente cellulare dei vasi, l’accumulo di lipoproteine nella sede del danno endoteliale,
l’aggregazione piastrinica. Ci sono perplessità nell’uso del fibrinogeno quale indicatore di danno
cardiovascolare.
-fibrinogeno compreso tra 150 e 400 mg/dl
normale
DISLIPIDEMIE
Le dislipidemie possono essere di 5 tipi:
- I tipo: caratterizzato da ↑ trigliceridi, colesterolo normale perché i chilomicroni non sono
idrolizzati. I pazienti si questo tipo non sono ad alto rischio.
- II tipo: dislipoproteinemia
- tipo 2a: ↑↑colesterolo; trigliceridi normali
- tipo 2b: ↑↑colesterolo; ↑ trigliceridi
Sono pazienti ad alto rischio
- III tipo: ↑colesterolo; ↑trigliceridi; mancanza o malfunzionamento dei recettori per le
ApoE. Parziale demolizione delle VLDL con formazione delle IDL.
Pazienti ad alto rischio
- IV tipo: colesterolo normale; ↑↑trigliceridi; accumulo di trigliceridi dovuto alle VLDL.
Sono pazienti che solitamente diventano diabetici. Nella terapia togliere i carboidrati
Importante distinguere tra tipo I e tipo IV
-V tipo: ↑ o normalità colesterolo; ↑↑↑trigliceridi; somma dei difetti I e IV = accumulo di
chilomicroni e VLDL. La dieta deve coinvolgere sia i lipidi che i carboidrati.
ELETTROFORESI delle LIPOPROTEINE
E’ possibile avere un tracciato elettroforetico delle lipoproteine che permette di distinguere le
dislipidemie di tipo I, IV e V.
31
Capitolo 3
ENZIMI
nella
DIAGNOSTICA
32
ENZIMI NELLA DIAGNOSTICA
Alcuni enzimi sono importanti segnali di malattia. Essi hanno, in condizioni normali, una precisa
ubicazione all’interno della cellula:
- enzimi mitocondriali (es. GLDH)
- enzimi citoplasmatici (es. GPT, LDH)
- enzimi ubiquitari (es. GOT, MDH)
La perdita di enzimi dalla cellula e il loro riversamento nel torrente circolatorio possono essere
causate da due situazioni:
- lisi cellulare conseguente a necrosi (ad es. in epatiti e pancreatiti e infarti del
miocardio)
- epatite: ↑transaminasi
- pancreatite: ↑amilasi
- infarto: ↑creatina fosfochinasi
- forme lievi e reversibili di danno cellulare (ipossia, alterazione del pH) che alterano
la permeabilità della membrana.
Ogni enzima ha una propria vita media e un certo andamento in circolo. Solitamente più è severo il
processo patologico, più i livelli enzimatici sono elevati. Ciò però non vale per tutti gli enzimi:
- enzimi tipo A: sono gli enzimi della coagulazione, la pseudo colinesterasi e altri; essi
diminuiscono la loro attività in caso di patologia. Li troveremo quindi ↓ che nella norma.
- enzimi tipo B: sono lipasi, amilasi e gli altri enzimi del tratto digestivo. Essi aumentano in
caso di patologia.
Altre situazioni importanti da verificare sono:
- escrezione urinaria di enzimi: è un processo che riguarda solo alcuni enzimi, come
l’amilasi, che passano attraverso la barriera renale per le loro caratteristiche
molecolari
- carenze congenite di enzimi.
33
ASPETTO ENZIMATICO DEI VARI TESSUTI
- GPT = glutammico-piruvico-transaminasi
o
ALT = alanina-transaminasi
ORGANO
fegato
muscolo
ENZIMA (unita/grammo d’organo)
35
3,5
Enzima specifico per il fegato.
E’ il miglior indice di citolisi epatica. E’ più alto nell’uomo e varia con l’età.
↑GPT: epatite virale acuta, necrosi epatica su base tossica, epatite autoimmune
↑GPT di minore entità: cirrosi epatica, ittero colestatico, stasi epatica da insufficienza cardiaca,
mononucleosi infettiva
- GOT = glutammico-ossalacetico-transaminasi
o
AST = aspartato-transaminasi
ORGANO
fegato
cuore
muscolo
cervello
rene
pancreas
polmone
ENZIMA (U/gr. organo)
59
52
36
15
10
3
1
Enzima di citolisi aspecifico.
Enzima presente in molti tessuti sia a livello citoplasmatico che mitocondriale.
↑GOT marcato: fisiologico nel neonato, epatite virale acuta, necrosi epatica su base tossica, infarto
del miocardio, traumi muscolari, ipossia tissutale, epatite autoimmune
↑GOT moderato: cirrosi epatica, ittero colestatico, carcinoma epatico, insufficienza cardiaca,
mononucleosi infettiva, malattie muscolari, emolisi
34
- GLDH = glutammato-deidrogenasi
ORGANO
fegato
rene
cervello
polmone
ENZIMA (U/gr. organo)
38
4,4
3,2
2,5
Enzima specifico per il fegato. Enzima di citolisi specifico come il GPT.
Il rapporto ALT/AST è importante per la diagnosi di alcune malattie:
Danno lieve del fegato
(lesa la membrana)
Danno severo del fegato
(lesi i mitocondri)
GPT>GOT>GLDH
GOT>GPT>GLDH
epatiti acute e quasi tutte le
patologie epatiche
epatite alcolica, sindrome di
Reye
Solitamente GPT>GOT perché GOT è inattivata più rapidamente (t1/2 minore) e GPT (contenuto nel
citoplasma diffonde più velocemente di GOT.
- LDH = lattico-deidrogenasi
ORGANO
muscolo scheletrico
fegato
cuore
rene
linfonodi
pancreas
globuli rossi
polmone
ENZIMA (U/gr. organo)
147
145
124
106
83
50
36
27
Enzima della glicolisi che si libera dopo necrosi cellulare.
Enzima aspecifico di citolisi.
↑LDH: anemie emolitiche, epatopatie, infarto del miocardio (tardivamente), neoplasie, distrofie
muscolari.
L’enzima è costituito da quattro catene polipeptidi che di due tipi:
- H (heart)
la loro combinazione dà origine a 5 isoenzimi (LD-1→LD-5)
- M (muscle)
H4
M4
LD1 e LD2 → isoenzimi cardiaci → non totalmente specifici però
LD4 e LD5 → isoenzimi epatici
Nell’infarto LDH serve per monitorarne il decorso:
se ↓LDH l’infarto sta guarendo → ciò ha oggi perso molta importanza clinica perché si usano le
troponine
35
Nelle neoplasie aumentano tutti gli isoenzimi con extrabande
- ALD = aldolasi
ORGANO
muscolo
fegato
cuore
muscolo liscio
rene
globuli rossi
ENZIMA (U/gr. organo)
48
5,7
4,9
2,6
1,1
1
Indice non totalmente specifico del muscolo
↑ALD: miopatie, epatite acuta, infarto del miocardio
36
- CPK o CK = creatin-fosfochinasi
ORGANO
muscolo
cervello
cuore
muscolo liscio
rene
fegato
ENZIMA (U/gr. organo)
2030
670
350
12
2
0,7
Enzima non specifico
L’enzima è costituito da due subunità:
- M (muscle)
la loro combinazione dà origine a 3 isoenzimi
- B (brain)
MM
MB
(muscolo)
(cuore)
↓
(5-30% dell’attività
totale della CK)
-
BB
(cervello)
↑CK: distrofia muscolare, polimiositi, infarto del miocardio, esercizio fisico intenso, ictus,…
In caso di infarto si dosa l’isoenzima CK-MB in prima giornata.
Ci possono essere 2 tipi di misurazione:
- CK-MB/CK(%) → misura l’attività di CKMB rispetto a quella di CKtot.
In condizioni normali è <6%
↑ in caso di infarto. Non è attendibile però se oltre all’infarto di sono dei danni muscolari
MISURA DEI CK-MB FUNZIONANTI
- CK-MB massa → misura la concentrazione di massa dell’enzima. Importante per diagnosi
precoce
MISURA DEL N° DI CK-MB
37
- ALP = fosfatasi-alcalina
enzima aspecifico
Viene prodotto da molte cellule, ma principalmente da:
- epatociti e cellule dei dotti biliari
- osteoblasti
- epitelio intestinale
↑ALP fisiologico: durante la crescita, nel 3° trimestre di gravidanza, negli anziani (specialmente le
donne)
↑ALP patologico: - malattie ossee (fratture, rachitismo, tumori degli osteoblasti, morbo di Paget)
- malattie epatiche: il fegato ha 2 isoenzimi L1 e L2. Se ↑L1 (compare in
elettroforesi) ci sono malattie epatiche maligne come sarcoidosi, tumori,
metastasi, malattie granulomatose. Se ↑L2 può essere un’epatite complicata
da colestasi o una colestasi cronica (colangite, colica biliare).
Se l’ALP è di origine epatica solitamente è accompagnato da ↑γGT
-FOSFATASI ACIDA = enzima che idrolizza un estere fosforico liberando Pi (fosfato inorganico)
a pH = 4 o 5. MARKER ASPECIFICO di CARCINOMA PROSTATICO
E’ prodotto dalla prostata e dall’osso (principalmente) ma anche da rene, piastrine, stomaco e fegato
↑patologico: carcinoma della prostata, ipertrofia prostatica, malattie ossee specialmente pediatriche,
morbo di Paget.
L’enzima è presente in 2 frazioni: 5a
e
5b
↓
↓
prostata
solo nell’osso
La frazione 5b è inibita dall’1-tartrato. Aggiungendolo si può isolare la frazione prostatica. Non è
un test molto specifico e rivela il carcinoma solo quando è in fase già avanzata. Sono preferibili altri
test.
- γGT = gamma-glutamil-transpeptidasi → usa cisteinil-glicina come substrato a cui attacca il
glutatione. Importante per recupero aminoacidi
Mai trascurarlo se > 40
Enzima prodotto specialmente dal fegato, ma presente in quantità più modeste anche in rene e
pancreas.
E’ localizzato a livello dei microsomi e dei dotti biliari.
↑γGT: disturbo enterobiliare con microstasi, somministrazione di farmaci (benzodiazepine,
antidepressivi e tranquillanti), abuso di alcool, pancreatiti (acuta e alcolica), tumori, colecistiti,
cirrosi, ittero ostruttivo intraepatico, metastasi, insufficienza cardiaca (cuore dx →stasi epatica)
E’ un indice di microstasi e di intossicazione epatica. E’ specifico ma bisogna stare attenti perché è
inibito da estrogeni (gravidanza, contraccettivi orali) e dalla bilirubina.
38
- AMY = amilasi
Enzima che idrolizza amido e glicogeno rompendo i legami 1-4α-glicosidici.
enzima aspecifico
E’ prodotto da pancreas, ghiandole salivari e tube di falloppio.
↑AMY: pancreatite acuta e cronica, occlusione intestinale alta, coliche biliari, ulcera, neoplasia
pancreatica, appendicite e interessamento peritoneale, parotite, gravidanza extrauterina,
insufficienza renale, macroamilasemia (nella macroamilasemia l’amilasi si lega a una IgG formando
un complesso ad alto peso molecolare che no filtra nelle urine (↑amilasemia e ↓amilasuria))
Se è ↑amilasuria significa che c’è anche un’amilasemia patologica. Importante quindi un suo
dosaggio
↑AMY: può essere indice di un’insufficienza renale in stadio molto avanzato.
Importante di stinguere tra gli isoenzimi
P3
e
S
↓
↓
pancreas
ghiandole salivari e tube
- LIPASI, TRIPSINA, CHIMOTRIPSINA
La lipasi pare essere un segno più specifico dell’amilasi per la diagnosi di pancreatite acuta.
La chimotripsina misura la funzione pancreatica esogena ed è importante per la diagnosi di
pancreatite cronica.
- CHE = colinesterasi (4 isoforme) o pseudocolinesterasi (11 isoforme)
Enzima che idrolizza la colina e i suoi esteri tra cui la succinilcolina che è responsabile della
trasmissione sinaptica. E’ in circolo in quantità abbastanza elevate in quanto indice dell’attività di
sintesi proteica del fegato.
↓CHE: epatopatie di secrezione (epatite, neoplasia), condizioni in cui l’ALB è bassa,
avvelenamento da esteri fosforici.
↑CHE: tireotossicosi, sindrome nefrosica.
Esiste 2 forme genetiche di CHE: - normale
- atipica (omozigote recessiva)
Gli individui con CHE atipica non sono in grado di idrolizzare alcune anestetici (come la
succinilcolina) che bloccano la respirazione. Perciò si svilupperà un’apnea prolungata.
Inoltre la CHE atipica non è inibita dalla dibucaina perché il legame ha un’affinità minore del 50100% rispetto a CHE normale.
39
Capitolo 3.1
INFARTO
del
MIOCARDIO
40
INFARTO DEL MIOCARDIO
Nel corso degli ultimi 20 anni l’aumento dei fattori di rischio e l’allungamento della vita media
hanno causato un aumento del numero di patologie cardiache legate a ischemia coronarica.
La principale causa di eventi ischemici cardiaci è l’aterosclerosi coronarica, malattia che porta
progressivamente all’occlusione parziale o totale delle arterie con conseguente ischemia. In questo
contesto i quadri anatomopatologici dei vari pazienti sono molto diversi tra loro a seconda
dell’estensione dell’infarto (transmurale o subendocardico). Analogamente le manifestazioni
cliniche spaziano dall’angina da sforzo, all’angina instabile, all’infarto con o senza
sottoslivellamento del tratto ST.
Principali parametri da cui dipende la comparsa di danni:
- n° di vasi occlusi
- sede dell’occlusione
- presenza di circoli collaterali
- durata dell’evento occlusivo
-1<20 min: generalmente la riperfusione non comporta necrosi del
tessuto o danni permanenti, ma solo una modesta alterazione funzionale
-2>20 min: danni da riperfusione permanenti con necrosi, edema,
rigonfiamento cellulare, deposizione di Ca2+
Come si è visto le lesioni maggiori compaiono a seguito della RIPERFUSIONE del tessuto, non
durante l’ischemia vera e propria.
Le principali cause del danno da riperfusione sono:
- l’ossigeno, che porta alla formazione di radicali liberi (ROS) che interagiscono con la
membrana cellulare determinando un danno ossidativo;
- l’alterazione dell’omeostasi del Ca2+ intracellulare con suo accumulo citoplasmatico (a ciò
consegue la morte cellulare perché Ca2+ attiva proteasi e endonucleasi);
- l’alterazione endoteliale con formazione di un essudato infiammatorio (accumulo di
neutrofili, attivazione C’…).
A seguito di questi eventi le cellule lesionate liberano in circolo una serie di molecole che possono
assumere il ruolo di MARCATORI più o meno specifici dell’evento. In generale: quanto più il
marcatore è specifico, tanto più tardivamente compare in circolo.
41
DIAGNOSI
La diagnosi di infarto del miocardio acuto (IMA) presenta delle problematiche ancora irrisolte.
IMA: necrosi di cellule miocardiche a seguito di ischemia prolungata.
Nel passato la diagnosi di IMA presupponeva il riscontro contemporaneo di almeno 2 delle seguenti
condizioni:
- angina
- alterazione ECG
triade
- ↑enzimi marcatori di danno miocardico
Questo permette di diagnosticare solo le lesioni maggiori, non tutti gli eventi che caratterizzano la
progressione della sindrome coronarica acuta. Con le moderne tecniche è possibile identificare aree
di necrosi inferiori a 1g di tessuto (con ECG normale) ciò è importante perché piccoli infarti
possono dare origine ad aritmie con gravi conseguenze. la diagnosi di IMA oggi si fa dosando
l’aumento della [C] in circolo di marcatori specifici e sensibili di danno miocardico.
Un marcatore ideale di danno miocardico deve avere le seguenti caratteristiche:
- essere presente solo nel tessuto miocardico in elevata concentrazione
- essere indosabile nel sangue in assenza di danno miocardico
- essere rilasciato rapidamente e in quantità rilevante in presenza di danno miocardico
- aumentare proporzionalmente all’entità del danno
- persistere in circolo per un periodo di tempo sufficiente per consentire la diagnosi
(BUONA FINESTRA DIAGNOSTICA)
- essere dosato con metodi rapidi, accurati, precisi, efficienti ed economici.
Secondo le più recenti linee-guida i migliori marcatori sono il complesso delle troponine e la
CK-MB massa.
Sono sconsigliati i dosaggi di alcuni enzimi tradizionali quali CKtot, LDH, GPT, GOT per la
considerevole specificità nella localizzazione tissutale.
Figura 5: Prima di 4-8h non si alza nessuno degli enzimi tradizionali.
HBDH: α-butinato-deidrogenasi →esprime l’attività di LD1 e LD2 in quanto aggiungendo
α-butinato come substrato LD1 lo ossida.
42
- LDH si normalizza in 7-15gg
- HBDH si normalizza dopo 10-20gg
- CPK e GOT dopo 3-6gg
L’utilizzo dei marcatori di danno miocardico può portare a 2 strategie diagnostiche alternative:
-1-dosaggio di 2 marcatori diversi, uno molto precoce e aspecifico e uno tardivo e altamente
specifico:
- enzima precoce: MIOGLOBINA (aumenta entro 2-3h) alto valore predittivo
negativo
- enzima tardivo: TROPONINE
-2-dosaggio di un solo enzima specifico (TROPONINA). Si usa se la prevalenza di malattia
coronarica è significativamente più elevata.
- MIOGLOBINA
<110μg/l
normale
Presente nel muscolo cardiaco e scheletrico. E’ un marker precoce in quanto ↑entro 1-2h
dall’esordio del dolore.
E’ importante per:
- escludere dalle prime ore la presenza di infarto (valore predittivo
negativo>95%)
- valutare se la riperfusione del tessuto è stata ottenuta
- valutare la comparsa di reinfarti (la troponina rimane elevata a lungo
mascherando i reinfarti).
E’ un marcatore aspecifico perché aumenta anche in caso di danno muscolare, traumi e
insufficienza renale.
-CK-MB massa
<5μg/l
normale
Misura la concentrazione della proteina CK-MB con Ab monoclonali specifici.
GRAFICO
CK-MM + Ab monoclonale → si blocca
CK-MB + Ab monoclonale → non si blocca
Entro 3 h dall’infarto la CK-MB massa aumenta significativamente nel 50% dei pazienti. Entro 6h
nell’80-100% dei pazienti. Ritorna normale in 48-72 h. Un valore normale di CK-MB dopo 6-8 h
dai sintomi ha un valore predittivo negativo del 95%.
In più la CK-MB è utile per:
- valutare la riperfusione
- valutare eventuali reinfarti
E’ un marcatore non completamente specifico perché aumenta nelle malattie e nei traumi muscolari
e ha scarsa sensibilità per danni miocardici minimi ( rilevati dalle troponine)
La CK-MB ha 2 isoforme:
- MB1: forma sierica
si ottengono a partire da un precursore proteico comune che
- MB2: forma tissutale
subisce diverse modificazioni post-traduzionali.
MB2 ha una Lys in più di MB1.
MB2/MB1 = 1
MB2/MB1 ≥ 1,5
situazione normale
probabile infarto in atto
oggi non più molto utilizzato
43
- TROPONINE
Il complesso delle troponine ha 3 componenti:
- troponina C → lega Ca2+ non specifica
- troponina I → inibisce l’attività ATPasica dell’acto-miosina
- troponina T → lega la tropo miosina
- TROPONINA I
E’ cardiospecifica: localizzata per il 95% nelle miofibrille e la restante parte nel citosol.
E’ molto importante per la diagnosi di IMA senza modificazione dell’ECG: in questi pazienti c’è
una fluttuazione della [TnI] che, dosata, permette di stabilire quali pazienti sono più a rischio per
eventi cardivascolari a breve termine.
La TnI aumenta dopo 6 h dall’infarto (valore predittivo positivo del 95%) e resta alta per 7-10 gg.
Possono quindi sfuggire eventuali reinfarti.
Valori: - <0,1 μg/l soggetto normale
- >0,1 e <1,5 μg/l danno cardiaco minimo (non aumenta CK-MB) 1°livello decisionale
- >1,5 μg/l
INFARTO
2°livello decisionale
- TROPONINA T
<0,01 μg/l
Presente nel cuore e nel muscolo scheletrico cronicamente stressato che riesprime proteine fetali.
Oggi si usano Ab specifici con selettività per la sequenza aminoacidica del TnT cardiaco, che ne
fanno quindi un ottimo marcatore di infarto.
Il rilascio di TnT mostra un quadro bifasico con un picco maggiore a 14 h e uno minore a 3-5 gg
dall’infarto. Ciò è probabilmente dovuto alla compartimentalizzazione intracellulare della proteina.
TnT resta elevato fino a 2 settimane dopo l’esordio. Aumenta fino a 100 volte rispetto al valore
normale e mostra una sensibilità del 100% da 10 h a 5 gg dall’infarto. Come la TnI è importante per
valutare il rischio di infarto nei pazienti con angina instabile e infarto senza sottoslivellamento del
tratto ST.
Esistono oggi 3 livelli decisionali a cui corrispondono considerazioni diagnostiche e terapeutiche
differenti:
I° livello: serve a escludere la presenza di sofferenza o danno miocardico di qualsiasi natura.
E’ il valore inferiore dell’intervallo di riferimento che si ottiene integrando la [Tn] corrispondente al
99° percentile del sistema di analisi e il livello di imprecisione analitica corrispondente.
Valore prossimo allo zero
↓
si esprime come coefficiente
di variazione ed <10%
II° livello: consente di separare il danno miocardico minimo dall’IMA vero e proprio.
III° livello: consente di distinguere i danni miocardici di minore entità dai più severi
44
Figura 6: andamento markers IMA
PRINCIPALI
MARCATORI
mioglobina
CK-MB massa
TnI
TnT
AUMENTO
INIZIALE
1-4 h
2-6 h
3-12 h
3-12 h
PICCO
4-12 h
12-24 h
12-24 h
12-48 h I°picco
3-5 gg II°picco
RITORNO ALLA
NORMA
12-24 h
72 h
7-10 gg
10-14 gg
Il quadro clinico dello shock simula quello dell’infarto. ↑CPK totale, ↑GOT, ↑GPT, ↑HBDH, ↑LDH
Tuttavia CK-MB non si alza e poi livelli di CPK pari a 5000 U/l sono troppo elevati per pensare a
un infarto
45
RIASSUNTO
Dolore al petto da<6h
ECG
positivo
IMA
ricovero
negativo
fare isoforme CK-MB
positivo
negativo
ripetere dopo 6h
positivo
storia di precedenti
terapia
negativo
nessun precedente
medicina generale
VALUTAZIONE DELLA FUNZIONALITA’ CARDIACA
Si dosano gli ormoni natriuretici (ANP, BNP, CNP)
I più noti sono:
-ANP: di origine atriale → è prodotto dalle fibrocellule cardiache e immesso
in circolo
- BNP: di origine ventricolare
Stiramento dell’atrio: ANP (tanto) e BNP (poco)
Stiramento del ventricolo: ANP(poco) e BNP (tanto)
- ANP: ↓P arteriosa, ↑diuresi e natriuresi; azione anti ipertrofica
- BNP:
↑BNP nello scompenso cardiaco: risposta adattativa per mantenere gettata cardiaca e P venosa
danno cardiaco disfunzionale→attivazione del sistema neuroendocrino→ipertrofia→↑BNP-↑ANP
contrasto
Anche lo stress distende il cuore.
Utile il dosaggio di BNP e NT-proBNP per seguire i pazienti con scompenso cardiaco nel followup, per classificarli e screenarli e sono considerabili come indicatori prognostici (anche nei test da
pronto soccorso)
NT-proBNP: t1/2>60min
[C] = 41 μg/ml
46
ENZIMI MUSCOLO SCHELETRICO
Degenerazione neuromuscolare → Aldolasi più bassa che nella distrofia
Test elettromiografici e aldolasi utile solo nella fase iniziale perché poi le fibre si distruggono e
sono sostituite da connettivo
Sarcoidosi ACE (↑P art.)
Quadro radiologico come TBC o neoplasia. Se progredisce c’è dispnea gravissima
ENZIMI PANCREAS
-1- Pancreatite acuta
Patologia che esordisce con addome acuto, ulcera perforante.
La diagnosi di pancreatite acuta si fa dosando alcuni enzimi:
- amilasi totale (non specifico) → sangue+amido+I →reazione
- se sangue normale la soluzione è blu
- se c’è amilasi il blu scompare
- isoamilasi pancreatica
- lipasi
→ lipasi+colipasi specifica
- tripsina
- elastasi
- fosfolipasi A2
Nelle urine si trovano:
-amilasi
- elastasi
- chimotripsina
-2- Pancreatite cronica
E’ di difficile diagnosi mentre è in corso di formazione. Talvolta è definita dispepsia, cattiva
digestione, …
Inutile il dosaggio di amilasi e lipasi per diagnosi a meno che non ci sia una fase di attivazione.
Si dosa la CHIMOTRIPSINA nelle feci perché non è demolita dalle proteasi e dalla flora batterica
intestinale. Le feci sono trattate con spettrofotometro a infrarossi (ne valuta la composizione).
L’aspetto è untuoso con gocce di grasso e fibrocellule muscolari. L’esame è un po’ in disuso.
47
Capitolo 4
FUNZIONALITA’
EPATICA
48
FEGATO
Il fegato è il principale organo metabolico del nostro organismo. Interviene in numerosi processi per
cui per valutarne la perfetta funzionalità bisogna eseguire test diversi:
- test di escrezione
- test di sintesi e capacità metabolica
- test di danno cellulare
- TEST di ESCREZIONE
Bilirubina → più noto test di escrezione
E’ un prodotto catabolico del metabolismo dell’EME. Proviene per la maggior parte dai globuli
rossi invecchiati, ma anche da mioglobina, emeproteine (citocromi) e eritropoiesi inefficace.
Ogni giorno sono gestiti circa 7 g di bilirubina.
globina
Emoglobina
apertura della proto porfirina IX
EME
ferrobiliverdina → biliverdina → bilirubina
La bilirubina viene trasportata nel sangue legata all’albumina. E’ captata dal fegato dove subisce
una reazione di glucoronazione ad opera dell’enzima UDP-glucoronil-transferasi e secreta con la
bile nell’intestino. Qui è modificata dalla flora batterica (STERCOBILINA) e in parte riassorbita
attraverso il circolo entero-epatico (UROBILINOGENO).
La bilirubina si trova in 2 forme principali:
- indiretta: non coniugata con acido glucuronico
- diretta: coniugata con acido glucuronico
BILIRUBINA TOTALE: 1 mg/dl è il valor normale
di cui
- 75% indiretta
0,1-1 mg/dl
- 25% diretta
<0,3 mg/dl
Le due forme si mettono in evidenza con la
REAZIONE PRONTA: SIERO+REATTIVO → COLORAZIONE VIOLA
(diretta)
SIERO+REATTIVO+SOLVENTE → COLRAZIONE VIOLA (indiretta)
Se bilirubina >2 mg/dl si parla di ITTERO
L’aumento di bilirubina non deve comunque superare ilo valore di 18-20 mg/dl, altrimenti passa la
barriera emato-encefalica e possono svilupparsi lesioni ai nuclei della base.
Importante in caso di ittero valutare sia la BILIRUBINA TOTALE che la BILIRUBINA
INDIRETTA.
49
Esistono diverse cause di ittero:
1) ITTERO PREEPATICO→↑bilirubina indiretta
da iperproduzione di bilirubina (emolisi, eritropoiesi inefficace, incompatibilità Rh)
2) ITTERO EPATICO→↑bilirubina diretta e indiretta (rigurgito di bile)
- da difetto di captazione (sindrome di Gilbert = valori di bilirubina totale da 1,5 a 6 mg/dl
con bilirubina indiretta fino a 5 mg/dl senza altri segni di alterazione epatica)
- da difetto di coniugazione (sindrome di Crigger-Najal, ittero fisiologico del neonato, ittero
da epatite o congenito grave) ↑bilirubina indiretta
- da difetto di eliminazione (sindrome di Dubin-Johnson) ↑bilirubina diretta
- da deficit della pompa della via biliare (ittero farmacologico dovuto al fatto che un farmaco
compete con la bilirubina per un recettore; nei neonati si può verificare durante
l’allattamento)
3) ITTERO POSTEPATICO→↑bilirubina diretta
- da stasi biliare ( epatiti, colangiti, colangioliti, cirrosi biliare, calcolosi della via biliare,
neoplasie di fegato e pancreas)
INDICATORI di COLESTASI → ALP, γGT
- ALP: aumenta sensibilmente in caso di ostruzione intraepatica ed extraepatica delle vie biliari
ALP<455 U/l femmine da 0 a 12 anni; maschi da 0 a 15 anni
ALP 34-104 U/l femmine
valori normali
ALP 45-130 U/l maschi
valori normali
- γGT: aumenta a seguito di varie patologie epatiche (microstasi, epatite, neoplasie, induzione
alcolica e altre patologie non epatiche). Si considera poco specifica per malattia epatica
γGT 11-97 U/l neonati
γGT <33 U/l femmine
γGT <50 U/l maschi
-ACIDI BILIARI: prodotti dal fegato, demolendo il colesterolo, sono l’acido colico e l’acido
chenodesossicolico poi coniugati con taurina e glicina. Sono secreti con la bile e riassorbiti per il
90% nel circolo entero-portale. ↑nel sangue in seguito a colestasi (valutano quindi la funzionalità
escretrice del fegato).
50
- TEST di SINTESI
a) INDICI FUNZIONALI di SINTESI PROTEICA
La maggior parte delle proteine del sangue, ad eccezione delle Ig, alcuni fattori del C’ e alcune
lipoproteine, è sintetizzata dal fegato. Il loro dosaggio è informativo dell’attività sintetica del fegato.
Le principali proteine studiate sono:
- ALB: un suo livello ridotto, escludendo altre cause come malnutrizione, malassorbimento,
perdita urinaria, è indice di insufficienza epatica. Se ↓ALB il fegato è compromesso per 2/3.
- pre-ALB, TRF: proteine preferite all’albumina perché hanno emivita minore, a volte si usa
anche AAG (↓in caso di epatopatie, avvelenamenti, ↑se flogosi o dialisi)
- fattori della coagulazione: hanno t1/2 <ALB e sono quindi un indice più fedele di
insufficienza epatica. Importante il dosaggio del FATTORE VII in caso di epatite
fulminante (t1/2 =2h).
- tempo di protrombina (TP): misura il tempo di coagulazione del plasma. Valuta la funzione
della via estrinseca (fattori X, VII, II prodotti dal fegato). Si ha un TP allungato nelle epatiti
tossiche, nelle cirrosi e se il fegato produce una molecola di fibrinogeno abnorme che non
polimerizza (sifibrinogenemia).
- CHE: è un indice di protidi poiesi ormai no molto usato per la scarsa sensibilità di risposta
b) INDICI FUNZIONALI di SINTESI LIPIDICA
Colesterolo: valutazione della sua formazione ed esterificazione. Prima si calcolava il rapporto tra
colesterolo libero e quello esterificato.
c) INDICI FUNZIONALI di SINTESI GLUCIDICA
Galattosio: nel fegato c’è l’enzima Gal1 fosfo-uridil-transferasi che converte il Gal in Glc. Se
manca si sviluppa una malattia grave nel neonato → GALATTOSEMIA.
per valutare la funzione di Gal-1-PUT si fa una prova da carico, si somministrano 40g di galattosio
e lo si dosa nelle urine emesse 5 h dopo. Quantità di Gal >3g sono patologiche.
- TEST di DANNO CELLULARE
Valutano l’incremento di alcuni enzimi, specialmente GPT e GOT a seguito di un danno cellulare
epatico
GPT >GOT epatopatie di tipo citolitico
GOT>GPT epatopatie alcoliche
51
EPATOPATIE ACUTE
Le epatopatie acute sono caratterizzate da un aumento delle transaminasi con:
SENSIBILITA’
SPECIFICITA’
ALT (GPT)
96
94
>300 U/l
AST (GOT)
91
95
>200 U/l
↑di bilirubina, γGT,
GLDH, LDH, ALP
EPATITE A: si avvia
verso la guarigione
quando ALP e γGT si
abbassano.
Scompare CHE.
Ittero nel 70% dei casi.
EPATITE B: complicata=
con componente
occlusiva.
La forma più grave ha
ALP e γGT alte.
Scompare CHE.
Ittero nel 30-50% dei
casi.
52
EPATITE ALCOLICA
γGT e ALP alte.
GPT e GOT nono
superano mai più di 10
volte i valori normali.
Ittero nel 60-70% dei
casi.
AVVELENAMENTO
da FUNGO
Scompare CHE
53
AVVELENAMENTO
da SOLVENTI
Caratterizzato da LDH
altissima e GOT > GPT
MORBO di WEIL:
leptospirosi emorragica
GPT > GOT
Caratterizzata da ittero
e ematuria. Diversa
dalle epatiti perché
prima si alza la
bilirubina e poi le
transaminasi (nelle
epatiti è il contrario).
GOT/GPT = quoziente di De Ritis
In condizioni normali il quoziente di De Ritis > 1.
Se > 1 (conversione del quoziente) ci può essere: epatite acuta, epatite tossica, mononucleosi,
steatosi.
54
EPATOPATIE CRONICHE
Alcune forme di epatite acuta come l’epatite B e la C tendono a cronicizzare.
Ciò avviene quando: - γGT dopo un mese dall’esordio acuto > 150 U/l
- transaminasi sono alte con GOT > GPT di circa 100 U/l
- ↑bilirubina
- ↓ALB
Ci son altre 2 forme principali di epatite cronica:
- PERSISTENTE: in cui GPT > GOT. E’ abbastanza benigna
- FORMA CRONICA: con GPT ≈ GOT, ↑γGT e CHE↓
Per la diagnosi di epatite cronica bisogna verificare una delle seguenti condizioni:
-1-↑ALT per più di 6 mesi dopo un’epatite acuta
-2-↑ALT in più di un’occasione su un periodo di 6 mesi senza un’altra spiegazione
ATTENZIONE! Non in tutti i pazienti con epatite cronica c’è ↑ALT perché le cellule del fegato
distrutte non lo producono più. Ricercare i marker di infettività.
Screening di epatopatia cronica va sempre condotto dosando ALT perché ilo test è più sensibile di
AST.
Monitoraggio nelle infezioni da HBV e HCV bisogna valutare la scomparsa dei marker virali per
monitorare l’evoluzione della malattia.
L’epatite cronica può evolvere verso la cirrosi o il carcinoma epatocellulare (HCV).
CIRROSI
Consiste nella sostituzione del tessuto epatico con fasci fibrosi e perdita della funzionalità epatica,
ipertensione portale, ascite. Può essere causata da HBV, HCV, alcol
- Da HBV, HCV: CHE bassa, modesto movimento delle transaminasi con GOT>GPT (non più di 23 volte la norma) e γGT lievemente mossa.
- Da alcol: stesso quadro con γGT molto alta.
Per valutare l’entità della fibrosi si possono eseguire alcuni test:
-1-quoziente di De Rizis CHE diventa >1 (era <1 nell’epatite cronica non alcolica)
-2-conta piastrinica
-3-tempo di protrombina
-4-ALB →marker di gravità della compromissione protidosintetica
-5-AFP (alfafetoproteina): ↑col progredire della fibrosi (ha un buon valore predittivo
positivo).
55
EPATOMA
Complicanza dell’epatopatia cronica da HBV e HCV. Si raccomanda lo screening dei portatori
cronici di HbsAg ogni 6 mesi con AFP (ma valore predittivo basso → 10-30%) e con ecografia e
AFP nei pazienti con cirrosi e storia familiare di carcinoma. Oltre alle prove funzionali ci sono dei
test che riguardano alcuni aspetti immunologici delle malattie epatiche. Si tratta della valutazione
della [Ig] nel sangue.
IgG: aumentano nell’epatite cronica aggressiva e nella cirrosi. Nella prima sono oligoclonali, nella
seconda policlonali con ponte β-γ.
IgA: aumentano nelle patologie da alcool perché sono associate a una patologia del primo tratto
digerente dove sono prodotte.
IgM: aumentano precocemente nell’epatite acuta e sono elevate nella cirrosi biliare primitiva.
METASTASI EPATICHE
Quadro con ↑ transaminasi con GOT>GPT, ↑γGT, ↑ALP, ↑LDH isoenzimi 1 e 2.
Diagnosi eseguita con TAC ed ecografia
EMIVITA dei PRINCIPALI ENZIMI di FEGATO E PANCREAS
GOT
GPT
GLDH
LDH1
LDH5
CPK
17±5h
47±10h
18±1h
113±60h
10±2h
15h
ALP
γGT
CHE
AMY
lipasi
3-7gg
3-4gg
10gg
3-6h
3-6h
56
Capitolo 5
FUNZIONALITA’
RENALE
57
RENE
I test di laboratorio che possono essere fatti sul rene si suddividono in varie categorie:
- test che valutano la funzionalità glomerulare
- test che valutano la funzionalità tubulare
- test che valutano l’insufficienza renale acuta e cronica
- test che valutano le glomerulo nefriti
- TEST per la FUNZIONALITA’ GLOMERULARE
-1-CLEARANCE della CREATININA
Per valutare l’efficienza della funzionalità renale si misura VFG=velocità di filtrazione glomerulare
che dipende: - dalla P di filtrazione Pf=P ‒(π+Pc)
- dalla superficie filtrante (numero glomeruli funzionanti)
- dalla struttura della membrana filtrante
VFG = volume di plasma (ml) filtrato in 1 minuto dai 2 reni
VFG = 125ml/min
normale riferita a una superficie corporea di 1,73m2.
La VFG è pari alla CLEARANCE se la sostanza impiegata è completamente filtrata e non viene ne
riassorbita, ne secreta dal tubulo, ma è completamente escreta con le urine.
CLEARANCE = volume di plasma depurato da una sostanza X nell’unità di tempo.
Ux = [x] nelle urine
Px = [x] nel sangue
V = flusso urinario
Nell’uso clinico la sostanza che viene utilizzata è la CREATININA, un catabolita endogeno di
origine muscolare derivante dalla creatina.
- Cl creat. = 95-140 ml/min nei maschi
- Cl creat. = 75-110 ml/min nelle femmine
Diminuisce con l’età perché ↓ il numero dei glomeruli funzionanti.
Fare attenzione al fatto che la quantità di creatinina dipende dalla massa muscolare.
La misura della Cl è però spesso inaccurata e soggetta a errore (tra 10-30%) per imprecisioni
compiute nella raccolta delle urine e nelle misure analitiche.
più spesso l’efficienza della funzionalità glomerulare è valutata con la sola CREATININEMIA,
più affidabile.
- 1 mg/dl
creatinine mia normale
- 0,8-1,3 mg/dl
nei maschi
- 0,6-1,1 mg/dl
nelle femmine
- 0,3-0,7 mg/dl
bambini<12 anni
58
La concentrazione plasmatica della creatinina è in rapporto inversamente proporzionale con la
clearance (curva iperbolica). La VFG può diminuire del 50% prima che si verifichi un ↑della
creatinina. Quando però questo si verifica è sicuro un difetto della funzionalità renale.
creatininemia
Cl%
Una nefropatia è curabile e reversibile fino a che non supera il 50% di compromissione della
funzionalità renale
E’ una formula che permette un calcolo rapido della VFG (e volume di plasma filtrato)
↑creat.: riduzione della filtrazione glomerulare, malattie del parenchima renale, nefropatie vascolari,
aumento della massa muscolare, acromegalia, traumi.
-2-CISTATINA C
E’ una proteina inibitrice di alcune cisteine-proteasi prodotte da tutte le cellule. Essa è totalmente
filtrata dal glomerulo e catabolizzata dalle cellule del tubulo prossimale (non viene perciò
riassorbita)
0,4-1,2 mg/l intervallo di riferimento normale (maschio, femmina, bambino)
E’ un marker ideale della VFG (non risente di riassorbimento, secrezione e imprecisione nella
raccolta delle urine) e inoltre è un indice più precoce dei compromissione renale rispetto alla
creatinina in quanti rileva anche LIEVI ALTERAZIONI della FUNZIONALITA’
GLOMERULARE. Purtroppo ha una grande variabilità interindividuale e ↑in alcune neoplasie e
nell’infezione da HIV.
59
-3-UREA
Urea plasmatica = azotemia in italia
L’urea è una molecola prodotta dal fegato, contenente NH3 derivante dal catabolismo degli
aminoacidi. Ogni giorno sono eliminati con le urine fino a 30 g di urea. In media 15-20 g.
L’urea viene utilizzata come indice di funzionalità glomerulare, ma la sua utilità clinica è inferiore a
quella della creatinina perché viene riassorbita per il 40% nel TP ed è influenzata dall’apporto
alimentare azotato, dallo stato di idratazione del paziente, dalla diuresi e dal catabolismo proteico.
- adulti 20-50 mg/dl
- bambini 10-50 mg/dl
valori normali AZOTEMIA
Iperazotemia è comunque da considerare perché può avere molteplici cause (anche non renali):
- pre-renale: dieta ricca di proteine, emorragia gastrointestinale, febbre, compromissione
del FER (shock, ipotensione). Di solito la creatinina è normale.
Rapporto azotemia/creatininemia>20:1
- renale: malattie glomerulari, nefropatie croniche e acute.
Rapporto azotemia/creatininemia<20:1
- post-renale: legata a impedito flusso urinario per calcoli, neoplasie, stenosi ureterali,
ipertrofia prostatica.
IPERAZOTEMIA
↓
accumulo di urea nel sangue
≠
IPERAMMONIEMIA
↓
accumulo di NH3 nel sangue
NH3
Deriva dalla deaminazione degli aminoacidi ed è convertita in urea nel fegato
↑NH3: insufficienza epatica grave, encefalopatie di origine epatica, leucemia acuta, trasfusioni,
trapianti, esercizio fisico intenso, emorragie intestinali, alcuni farmaci.
- NH3
50-80
20-60 μg/dl
valori normali
- NH3
>150μg/dl
coma epatico
C’è una correlazione positiva tra NH3 e gravità del coma epatico. Ilo coma da insufficienza renale,
invece è iperuremico, ma non iperammoniemico.
NH3 è tossico per il cervello perché sottrae ac. chetoglutarico dal ciclo di Krebs per convertirlo in
glutammato e glutammina.
AMMINOACIDI
Oltre all’urea e all’ NH3 nel sangue sono presenti altri composti azotati: gli aa (si valuta la presenza
di una quantità di –NH2 pari a 5 g). Essi sono di origine alimentare o derivanti dalla demolizione
60
delle proteine. L’AMINOACIDEMIA non ha grandi implicazioni diagnostiche. Si calcola quando si
sospettano difetti nella sintesi proteica.
↑aa insufficienza epatica quasi terminale.
DIFETTI nella SINTESI PROTEICA:
- Metabolismo della Phe: difetto più comune è la mancanza dell’enzima Phe idrossilasi che
catalizza la conversione della Phe in Tyr. L’accumulo di Phe è tossico per il cervello e nel bambino
non ne permette un completo sviluppo con conseguente ritardo mentale. E’ una condizione nota
come OLIGOFRENIA FENILPIRUVICA o FENILCHOTONURIA (malattia a carattere
autosomico recessivo). Fondamentale è una diagnosi precoce affinché al bambino sia prescritta una
dieta priva di Phe. Si fa tramite il TEST di GUTHRIE (screening su tutti i neonati) che consiste
nell’aggiungere il siero del neonato in una coltura di B.Subtilis. La crescita dei bacilli è inibita dalla
presenza di β-2-tienilalanina (antagonista della Phe). Se nel siero aggiunto è presente un accumulo
di Phe i batteri crescono; valutando la crescita batterica si può porre diagnosi di fenilchetonuria.
Più importante è la valutazione della AMINOACIDURIA. Associata al dosaggio dei fosfati e del
glucosio può essere utile per valutare la SINDROME di FANCONI. E’ una malattia autosomica
recessiva caratterizzata da una progressiva pan citopenia associata a aumentata predisposizione per
le malattie neoplastiche e a diverse anomalie congenite tra cui alcune a carico dello scheletro
(RACHITISMO resistente a Vit.D) e altre del rene (disfunzione del TP con conseguente glicosuria,
iperfosfaturia e ipofosfatemia, aminoaciduria, iperururicuria e ipouricemia, ipocaliemia).
ACIDO URICO
E’ il prodotto terminale del catabolismo delle purine. in condizioni normali ha questi valori nel
sangue:
5-6 mg% nelle femmine
5-7 mg% nei maschi
L’aumento dell’uricemia porta a una patologia che prende il nome di GOTTA. Le cause sono
principalmente 3:
-1- DIFETTO di ESCREZIONE RENALE
In condizioni normali l’acido urico è parzialmente filtrato dal glomerulo con una clearance molto
bassa ( 9 ml/min). E’ secreto nella porzione finale del TP e riassorbito per il 98-100% nel TD.
Viene escreta circa il 6-12% della quota filtrata.
↑uricemia: insufficienza renale, acido lattico e chetoacidi bloccano la secrezione tubulare di acido
urico (in caso di diabete, dislipidemia, intossicazione alcolica, digiuno, esercizio faticoso). anche
alcuni farmaci possono inibire la secrezione di acido urico.
-2- SOVRAPPRODUZIONE di ACIDO URICO
- ↑produzione dell’enzima PRPP (fosfo-ribosil-pirofosfato-sintetasi) enzima essenziale per la sintesi
dei nucleotidi.
- Difetto enzimatico di HGPRT (ipoxantina-guanina-fosfo-ribosil-transferasi)
Sindrome di Lesch-Nyhan: è una malattia ereditaria X-linked che ha come difetto più evidente
l’iperuricemia associata a ritardo mentale, atassia, automutilazioni, aggressività, iperuricuria e
[HGPRT] diminuita in eritrociti e fibroblasti.
61
-3- AUMENTATO TURNOVER degli ACIDI NUCLEICI
L’aumento della sintesi e della demolizione di purine è tipica di alcune malattie, come le leucemie,
caratterizzate da disordini mieloproliferativi. Durante la chemioterapia vengono distrutte molte
cellule con liberazione di DNA (e quindi purine).
Capitolo 5.1
ESAME URINE
62
ESAME DELLE URINE
L’analisi delle urine comprende:
-esame chimico-fisico
-esame microscopico
-1- ESAME CHIMICO-FISICO
Si esegue con lo stick urinario che mette in evidenza la presenza di varie molecole grazie a reazioni
enzimatiche. L’esame considera diversi parametri:
- COLORE: può variare entro questa gamma:
- giallo paglierino: urine normali
- giallo arancio intenso: urina concentrata con pigmenti biliari e uroblilinogeno in
eccesso
- marsala: presenza di bilirubina
- rosso limpido: emoglobina e mioglobina
- rosso torbido: presenza di sangue
- verde: presenza di biliverdina o infezioni batteriche
- nerastra: alcaptonuria, melanina, derivati della Tyr
- trasparente: urina molto diluita (es. nel diabete insipido)
- ASPETTO:
- limpido: urina normale
- torbido: presenza di fosfati, carbonati, acido urico, proteine (leucociti, batteri,
spermatozoi)
- lattescente: piuria, lipuria (nefrosi o traumi), cellule vaginali molto abbondanti
- presenza di precipitati: nelle urine mentre il principale precipitato è il fosfato
amorfo, nelle acide l’urato di ammonio, nelle alcaline il fosfato triplo o, se
flocculento, muco, leucociti, batteri e lieviti
- PESO SPECIFICO: rapporto tra il peso in grammi di 1 ml di urina e 1 ml di acqua.
E’ sempre > 1. Misura la capacità del rene di diluire o concentrare le urine
- ps = 1003-1028
adulto normale
- ps > 10023 = normale capacità di concentrazione
Il peso specifico è calcolato con lo stick urinario (ma metodo poco accurato e poco specifico) o con
un REFRATTOMETRO. Il campione viene attraversato da un raggio di luce che viene rifratto.
L’angolo di rifrazione è α alla [soluti] nell’urina.
63
- ↑ps: disidratazione, glicosuria, proteinuria, ipersecrezione di ADH
- ↓ps: diabete insipido, glomerulonefrite, pielonefrite, insufficienza renale
- OSMOLALITA’ URINARIA: numero di particelle osmoticamente attive/Kg di solvente
100-1200 mOsm/Kg
soggetto normale
Non sempre coincide con il ps. Il valore dell’osmolalità dipende dallo stato di idratazione del
paziente; non c’è quindi un “valore normale”. il principale determinante dell’osmolalità urinaria è la
quantità di H2O riassorbita dal TD e DC in risposta all’ADH. E’ la misura più esatta della capacità
del rene di concentrare le urine. Si misura con l’OSMOMETRO, strumento che valuta le variazioni
del punto di congelamento dell’urina rispetto al solvente puro.
↑osmolarità: morbo di Addison, scompenso cardiaco, shock
↓osmolarità: iperaldosteronismo, diabete insipido, eccessivo itroito di acqua, necrosi
tubulare
- pH: il rene elimina giornalmente 80-100 mmol/l di ioni H+ tramite l’acidità titolabile
(tamponi urinari) e l’ammoniogenesi (NH4+ eliminato: 30 mmol/24h)
pH
5,5-6,5
normale
pH
4,5-8
massima variabilità
↑pH: infezioni batteriche, dieta vegetariana
↓pH: durante la notte per acidosi respiratoria, dieta a base di amido, proteine, alcol e
zucchero.
pH importante nelle calcolosi (urine alcaline → calcoli di fosfato di Ca, CaCO3, NH4PO4; urine
acide → calcoli di acido urico); nelle infezioni urinarie, nelle alterazioni dell’eq. acido-base,
nell’insufficienza renale
- GLUCOSIO:
glc < 150 mg/l
normale
↑glicosuria: iperglicemia o con glicemia normale in gravidanza, tubulopatie
ereditarie (es. sindrome di Fanconi), tubulopatie da sostanze tossiche (Pb, Hg,
tetracicline), da ipossia, malattie infiammatorie.
La glicosuria si misura con le strisce reattive che sfruttano una reazione basata sulla
GLUCOSIO-OSSIDASI
Glu + O2 →glucosio ossidasi→ H2O2 + cromogeno →perossidasi→ cromogeno ossidato + H2O
- CORPI CHETONICI: non sono normalmente presenti nelle urine; la loro presenza indica
un aumento del metabolismo degli acidi grassi.
↑corpi chetonici: digiuno, diabete (associati a glicosuria), gravidanza, febbre,
ipoglicemia, stress, esercizio fisico intenso
64
- PROTEINE:
< 150 mg/24h
proteinuria normale
La proteinuria normale è costituita dal 30% di ALB, 30% mucoproteina di Tamm-Horsfall, RBP
(retinol binding protein), β2microglobulina, catene L, IgA di secrezione.
La proteinuria patologica riflette un danno renale.
Può essere di 3 tipi:
1)PROTEINURIA GLOMERULARE
Causata da un aumento di permeabilità del glomerulo (varia l’eziologia: glomerulonefriti,
alterazione dell’emodinamica glomerulare, stenosi dell’arteria renale). Compaiono nelle urine:
ALB, TNF, le α1 e le α2, poche IgG.
La proteinuria può essere:
- REVERSIBILE
- IRREVERSIBILE
- SELETTIVIA
con l’aggravarsi dell’alterazione della barriera
- NON SELETTIVA (sempre irreversibile)
di filtrazione si perdono proteine con pH sempre
maggiore fino alla perdita completa della selettività
Per distinguere una proteinuria glomerulare selettiva da una non selettiva è utile calcolare
l’INDICE di CAMERON:
< 0,2 → proteinuria selettiva
2)PROTEINURIA TUBULARE
Causata da un inadeguato riassorbimento tubulare di proteine a basso pH (normalmente filtrate e
riassorbite). Si ritrovano nelle urine: α1 microglobulina, β2 microglobulina, RBP, α1
glicoproteinaacida, catene L.
Le principali cause del danno tubulare sono: necrosi tubulare acuta, tossicità da farmaci e metalli
pesanti, trapianti, sindrome di Fanconi.
3)PROTEINURIA DA IPERAFFLUSSO
Causata dall’eccessiva produzione di proteine a basso pH che filtrano nel glomerulo e non sono
totalmente riassorbite per l’elevata quantità. Provocano gravi danni renali. Le principali sono: BJ
(MM), lisozima (leucemia monocitica), amilasi (pancreatite), mioglobulina, Hb (emolisi
intravascolare).
Nelle urine si ritrovano anche numerosi enzimi il cui dosaggio non può però essere standardizzato
dal momento che alcuni si bloccano nell’ambiente urinario. Ciò non vale ad esempio per:
- NAG→N-acetilβ D-glucosamminidasi
- α1 microglobulina
65
Esistono anche proteinurie benigne intermittenti come:
- ALBUMINURIA ORTOSTATICA: persistente, ma presente solo nella posizione
eretta.
- ALBUMINURIA da SFORZO
- PROTEINURIA da FEBBRE
Per evidenziare la proteinuria si usano le strisce reattive. Reazione semiquantitativa specifica, ma
poco sensibile. Si basa sul seguente principio: ALB a pH fisiologico sono dissociate come anioni.
Sulla striscia c’è un tampone che contiene un indicatore specifico per l’ALB, giallo a pH = 3 e blu
se pH > 4,2 (per farlo virare bastano 15mg/dl di ALB). La [ALB] è valutata sulla base dell’intensità
di colore.
- EMOGLOBINA:
La rilevazione di Hb si basa sulla seguente reazione
eme
↓
H2O2 + cromogeno →
cromogeno ossidato + H2O
Hb ha una attività perossidasica che porta al viraggio del colore del cromogeno.
- UROBILINOGENO:
Presente normalmente in tracce fino a 0,5-4 mg/24h.
L’urobilinogeno è prodotto dalla flora intestinale a partire dalla bilirubina ed è in parte escreto con
le feci, in parte riassorbito dal fegato e in parte passa nel circolo sistemico ed è escreto per via
renale. La quota di urobilinogeno urinario dipende dalla quantità di bilirubina immessa
nell’intestino e dalla quota riassorbita dal fegato.
↑urobilinogeno: emolisi, stipsi (↑tempo di transito nell’intestino), ↑crescita della
flora batterica, pH urinario alcalino (si trova in forma ionizzata a cui l’epitelio è
impermeabile).
↓urobilinogeno: ostruzione biliare, antibiotici, diminuito transito intestinale, pH
urinario molto acido, ridotta funzionalità renale.
- BILIRUBINA: è normalmente assente nelle urine; se presente è sempre in forma
coniugata. La sua presenza indica un ostacolo intra o extraepatico al passaggio della bile. Per
misurarla si dosa la AZOBILIRUBINA composto che si forma per la reazione della bilirubina con
l’ac. sulfanilico-diazotato.
- NITRITI: si formano dai nitrati nel metabolismo batterico.
- LEUCOCITI: è possibile rilevarne la presenza con lo stick.
66
-2- ESAME MICROSCOPICO
E’ possibile rilevare la presenza di globuli rossi, leucociti, cilindri, cristalli, occasionalmente batteri,
cellule epiteliali di sfaldamento, calcoli.
- EMATURIA: può essere:
- macroscopica: visibile a occhio nudo
- microscopica: presenza di più di 2 emazie per campo (400x).
E’ possibile distinguere al sedimento la microematuria di origine glomerulare da quella avente altre
cause. Infatti nel primo caso si osservano emazie piccole, dismorfiche, o tipicamente deformate con
attaccate piccole spicole (ACANTOCITI). Nel secondo caso le emazie sono uniformi a disco
biconcavo.
- Cause ematuria:
- microematuria glomerulare: nefropatia da IgA, ispessimento della membrana basale,
glomerulonefriti
- microematuria non glomerulare: pielonefrite, nefrolitiasi, infezioni, neoplasie vescicali o
della prostata.
- LEUCOCITURIA: costituita prevalentemente da polimorfonucleati. E’ espressione di un
processo infiammatorio acuto in atto.
- Cause: cistiti, prostatiti, uretriti, neoplasie vescicali, calcolosi, tubercolosi renale, pielonefriti.
- CILINDRI: derivano da proteine (tipo Tamm-Horsfall) che prendono la forma del tubulo,
precipitando a causa del pH urinario acido. All’interno dei cilindri possono rimanere intrappolati
cellule tubulari desquamate, leucociti, emazie per cui si distinguono cilindri IALINI,
GRANULOSI, LEUCOCITARI, EMATICI. Pochi cilindri ialini isolati non sono un reperto
patologico.
Cilindri ialini + granulosi→indice di sofferenza renale
- CELLULE EPITELIALI:
Provengono dallo sfaldamento della mucosa del tratto urinario.
- CRISTALLI:
La loro presenza è significativa solo se si trovano in quantità consistente. La precipitazione e il tipo
di cristallo dipendono dal volume e dal pH urinari:
- pH alcalino→sali di CaPO4
- pH acido→cristalli di acido urico.
I cristalli di fosfato di NH4+ indicano la presenza di GRAM‒ produttori di ureasi.
CONTA di ADDIS
Vengono eliminati con le urine nelle 24h
- fino a 1000000 di GR
67
- fino a 2000000 di globuli bianchi
- fino a 10000 cilindri
Capitolo 6
EMOSTASI
68
EMOSTASI
EMOSTASI: processo che arresta l’emorragia
- reazione infiammatoria locale
- reazione vascolare: vasocostrizione per
emostasi primaria
fattori locali
trombossano A2, serotonina, Epi,
NA dalle piastrine attivate
- formazione tappo emostatico: legame con endotelio danneggiato
1) Attivazione piastrinica
-1-adesione delle piastrine
-2-aggregazione delle piastrine
legame con altre
piastrine
ADESIONE: interazione tra un recettore di membrana della piastrina e un ligando espresso
dall’endotelio danneggito (fattore di von Willebrand)
LIGANDI
RECETTORI
fattore di von Willebrand
complesso glicoproteico Ib-IX
collageno
complesso glicoproteico Ia-IIa
ADP
trombina
trombossano A2
adrenalina
fattore di attivazione piastrinico
il LEGAME PORTA all’EMISSIONE di PSEUDOPODI UTILI per AGGREGAZIONE
AGGREGAZIONE: interazione tra glicoproteine IIb e IIIa e fibrinogeno e fibronectina, altra
glicoproteina, e trombospondina e fibrinogeno
Ia, IIa, IIIa, Ib, IIb → INTEGRINE
2) Reazione di rilascio
Degranulazione piastrine con rilascio di serotonina, ADP, istamina, ATP, Ca2+, fattore
piastrinico-4, fattore di crescita derivato dalle piastrine, proteine della coagulazione,
proteine di adesione (fibrinogeno, trombospondina, fattore di von Willebrand).
69
3) Coagulazione
[3) e 4) → emostasi secondaria]
Cascata di reazioni che portano alla conversione del fibrinogeno in fibrina
2 modalità di attivazione:
INTRINSECA → contatto con superfici e precallicreina
FATTORE TISSUTALE
ESTRINSECA → danno tissutale o processo infiammatorio
promuove coagulazione
4) Retrazione del coagulo
Stabilizzazione del coagulo tramite contrazione (stimolazione trombina) degli pseudopodi
di actina e miosina delle piastrine
5) Fibrinolisi → emostasi terziaria
Dissoluzione del coagulo per ripristinare il flusso sanguigno. Promossa da PLASMINA
Degrada fibrina → FRAMMENTI di FIBRINOGENO → azione anticoagulante
Degrada alcuni fattori della coagulazione 1.blocca fattore tissutale
2.ostacola aggregazione piastrinica
3.inibisce formazione fibrina
PLASMINOGENO
tipo t e tipo u
attivato dall’endotelio,
fattore XII
fattore di Hageman
inibito da endotelio PAI1),
fibroblasti (PAI1), monociti,
placenta (PAI2), epatociti (PAI3)
Collageno e LPS
Fattore XII
chinine
C’
attivano
fibrinolisi
coagulazione
C’ induce danno
tissutale e quindi attiva
coagulazione e fibrinolisi
più fagociti
70
produce IL-1, TNFα, ROS
e fattore tissutale
MECCANISMI CHE BLOCCANO L’EMOSTASI
1 plasmina
2 EPARANSOLFATO-ANTITROMBINA III
- inattiva fattori serinproteasici della coagulazione
- lega trombina all’endotelio → trombina diventa anticoagulante dopo legame con
antitrombina
L’eparina accelera la reazione di 2000 volte.
3 MECCANISMO PROTEINA C- PROTEINA S
Si attiva se la quantità di trombina supera la capacità inibitoria dell’antitrombina III → interviene
TROMBOMODULINA.
La trombina si lega alla trombomodulina → attivazione PROTEINA C
Proteina C si lega alla proteina S, a sua volta legata all’endotelio
Complesso proteinaC-proteinaS → DEGRADAZIONE FATTORI SERINPROTEASICI Va
e VIIa
4 WARFARINA
Inibisce vitamina K → no sintesi fattori coagulazione.
3)
Coagulazione: la cascata delle proteasi attiva la trombina che a sua volta attiva le piastrine
legandosi a recettori specifici della loro membrana. Dopo il legame le piastrine espongono
fosfolipidi a carica negativa e recettori come l’integrina αIIb, β3 per il legame con il fibrinogeno.
TF lega VII e VIIa (forma attivata)
TF-VII
TF-VIIa
←
attivato per danno tissutale
attivano
Xa, IXa, VIIa
X, IX
retro attivazione con
amplificazione
71
MOLECOLA DEL FIBRINOGENO
Molecola simmetrica costituita da 3 catene α, β, γ avvolte in una struttura ad α-elica, un dominio
centrale E e da 2domini laterali D
γ
α
α
γ
D
E
D
β
β
La trombina agisce sul dominio E e stacca 2 peptidi: FIBRINOPEPTIDI A e B. Tale distacco
porta alla perdita di equilibrio nella molecola e a un successivo riarrangiamento che coinvolge più
molecole di fibrinogeno che si aggregano tra loro secondo una geometria ben precisa:
D
D
E
E
D
D
D
D
E
E
D
D
Come ultima tappa nella stabilizzazione del complesso venutosi a formare, intervengono fattore
XIII e Ca2+ che formano legami crociati tra le subunità D
D
D
E
E
D
D
D
D
E
E
D
D
RIASSUNTO:
molecola fibrinogeno
proteolisi
polimerizzazione (legami semplici tra le subunità) D
D
solubilizzazione (fattore XIII fa legami crociati tra le subunità)
D
D
72
TEST CHE VALUTANO IL RISCHIO EMORRAGICO
1- CONTA PIASTRINICA
2- TEMPO di EMORRAGIA
E’ un indicatore dell’emostasi primaria (vasocostrizione e formazione del tappo piastrinico). E’ un
test che ha un’utilità clinica limitata perché è a bassa sensibilità, specificità e riproducibilità.
Esistono diversi metodi per riprodurlo:
-bucare il lobo dell’orecchio e asciugare le gocce di sangue, cronometrando in quanto
tempo si blocca l’emorragia
-disinfettare la cute dell’avambraccio con etere, attendendo la vasocostrizione.
Applicare lo sfigmomanometro al braccio e mantenerlo alla pressione di 40 mmHg.
Incidere la cute e cronometrare il tempo che intercorre fino all’arresto del
sanguinamento.
Intervalli di riferimento:
1-7 minuti
normale
>10 minuti
patologico → sospetta piastrinopenia
8-10 minuti
da chiarire (fare prova di tolleranza all’aspirina)
3- TEMPO di QUICK o TEMPO di PROTROMBINA (PT)
Test che valuta la via estrinseca: è sensibile all’attività dei fattori V, VII, X, II, ma non il IX. Il test
si basa sul cronometraggio del tempo di coagulazione del plasma dopo l’aggiunta di
TROMBOPLASTINA CALCICA.
- TROMBOPLASTINA: miscela di proteine e fosfolipidi estratta da vari tessuti (cervello,
polmone, placenta) che contiene molto fattore tissutale e fosfolipidi.
- CALCICA: presenza di ioni Ca2+ che si legano al citrato, facendolo precipitare come
citrato di Ca2+ e riattivando la coagulazione.
La velocità di formazione della fibrina in queste condizioni è direttamente proporzionale (α) alla
[VII] e dei fattori della via comune. Il PT è utile per 2 scopi:
-1-monitoraggio della terapia anticoagulante orale TAO
-2-diagnosi di anomalie della coagulazione o epatopatie.
Metodica per eseguire il test:
- Prelievo: prelevare il sangue usando citrato di Na+ come anticoagulante in un rapporto
citrato/sangue = 1:10. Solitamente 4,5 ml di sangue e 0,5 ml di citrato (provette già calibrate).
Agitare al provetta e centrifugare. I test di coagulazione si eseguono sul plasma.
73
- Test: aggiungere la tromboplastina calcica. Inclinare continuamente la provetta fino alla
formazione del coagulo di fibrina e registrare il tempo.
≈ 13 sec.
TEMPO NORMALE
Il test deve essere standardizzato affinché sia possibile un confronto tra i vari risultati ottenuti. Il
problema è che ogni laboratorio ha delle tromboplastine con sensibilità diversa. Oggi esiste una
tromboplastina con PREPARAZIONE INTERNAZIONALE di RIFERIMENTO (IRP) da
utilizzare per calibrare le altre tromboplastine in modo tale
che:
ottenuto con una tromboplastina qualsiasi possa
essere convertito in una scala comune
1) eseguo il test con la tromboplastina del mio laboratorio
2) rapporto i sec del mio pz con i secondi del valore medio normale (IRP)
3) ottengo ISI = indice di sensibilità internazionale
4) converto il rapporto ottenuto con la mia tromboplastina nel RAPPORTO
INTERNAZIONALE NORMALIZZATO (INR) = rapporto che si sarebbe ottenuto se il
PT fosse stato eseguito con la tromboplastina IRP
- INR = 1
VALORE NORMALE
- INR = 2-3 PZ in TAO
4- TEMPO di TROMBOPLASTINA PARZIALE ATTIVATO (APTT)
Test che valuta la via intrinseca. Si basa sul cronometraggio del tempo di coagulazione del plasma,
con le stesse modalità del PT, dopo l’aggiunta di un attivatore (CaCl2) che attiva i fattori della fase
di contatto e la tromboplastina parziale.
- TROMBOPLASTINA PARZIALE = non contiene TF
Limite del test: impossibile la standardizzazione. Si esegue principalmente per 3 ragioni:
-1-screening dei disordini della coagulazione (es. emofilia)
-2-monitoraggio della terapia anticoagulante con eparina
-3-individuazione di inibitori dei fattori della coagulazione
34-36 sec
TEMPO NORMALE
ANOMALIE di TP e APTT
- Allungamento APTT: deficit di un fattore della via intrinseca: precallicreina, chininogeno, fattore
XII, XI, IX e VIII
- Allungamento TP: deficit del fattore VII
- Allungamento di entrambi: deficit di un fattore della via comune: fattore X, V, II o fibrinogeno.
In caso di allungamento di APTT eseguire il TEST della MISCELA per valutare se la causa è il
deficit di un fattore della coagulazione o la presenza di un inibitore di qualche fattore. Nel primo
caso eseguire:
DOSAGGIO dei FATTORI
Fattori II, V, X, VII sono dosati determinando l’abilità del plasma del pz di correggere il PT di un
plasma carente del fattore che deve essere dosato. I fattori XII, XI, IX e VIII usano invece APTT.
ITER DIAGNOSTICO
- test globali → tempo di emorragia
↓
- test settoriali → TP, APTT
↓
- test fattoriali → dosaggio dei fattori
74
TROMBOSI
La trombosi ha un’incidenza > dell’emorragia. Si manifesta prevalentemente come trombosi venosa
profonda che può portare a embolia polmonare.
tendenza
all’emorragia
equilibrio
tendenza
alla trombosi
emostatico
CAUSE di EMORRAGIA
trombocitopenia
trombocitopatia
carenza di fattori della coagulazione
carenza di α2-antiplasmina (iperfibrinolisi)
formazione di inibitori o Ab
CAUSE di TROMBOSI
carenza di inibitori della coagulazione AT-III,
prot. C, prot. S
attivazione della coagulazione (lesione tissutale,
superfici estranee, turbolenza, tossine, chinine,
stasi, neoplasie)
aumento della viscosità del sangue
Fattori di rischio trombotico:
- diabete
- placche aterosclerotiche
- malattie virali
- protesi artificiali
- tumori
- traumi e ingessature
- fattori attivanti la coagulazione (danno vasale – contatto – adesione – aggregazione
reversibile – aggregazione irreversibile – modificazioni morfologiche - release – trombo bianco
RELEASE: ADP e TXA2 → aggreganti e vasocostrittori
75
TEST che VALUTANO il RISCHIO TROMBOTICO
1- ANTIROMBINA
Esiste un difetto congenito di antitrombina-III che può presentarsi in 2 forme:
- tipo I: riduzione [AT]
- tipo II: [AT] normale e attività ridotta
Per il dosaggio di AT si utilizza il metodo cromogenico: prendere plasma pz, aggiungere trombina
ed eparina; la trombina non inibita, misurata con un substrato cromo genico sensibile è
proporzionale all’AT presente nel plasma.
2- PROTEINA C- PROTEINA S
Esistono dei difetti congeniti delle proteine C ed S. Altra causa di deficit sono le epatopatie. i
metodi dosaggio sono coagulativi.
3- FATTORE V di LEIDEN
E’ possibile il verificarsi una resistenza alla proteina C attivata a causa di una mutazione puntiforme
del gene del fattore V geneticamente trasmissibile. Ne consegue uno stato di ipercoagulabilità.
L’APC-R è evidenziata con il rapporto tra:
La conferma è data dalla biologia molecolare.
4- DOSAGGIO del DIMERO-D
L’azione della plasmina sulla fibrina porta alla formazione di 2 prodotti terminali: i monomeri E e i
dimeri D (non può scindere i legami crociati). Il dosaggio del dimero-D può escludere una TEV
recente se sono basse le concentrazioni. Il dosaggio avviene tramite l’utilizzo di anticorpi
monoclonali e tecniche immunoenzimatiche (ELISA).
D
D
dimero-D
TROMBINA
PLASMINA
proteolisi 2 peptidi A
2 peptidi B
↓
monomeri di fibrina
↓
fibrina polimerizzata
↓ ← XIII
coagulo
2 peptidi A, 2 peptidi B, 2 peptidi C
↓
FDPX
↓
FDPY + FDPD
↓
FDPE + FDPD
76
FDP = prodotti di degradazione del fibrinogeno
5- FRAMMENTO di PROTROMBINA e FIBRINOPEPTIDE A
Al fine di valutare il rischio trombotico individuale è importante dosare nel plasma del pz anche i
marcatori di attivazione. I più importanti sono il frammento di protrombina (valuta la quantità di
trombina formata) e il fibrinopeptide A.
ALTRE RARE CAUSE di TROMBOFILIA
- anticoagulante lupico (LA): Ab che agisce contro le proteine plasmatiche con alta affinità per i
fosfolipidi (protrombina, chininogeni, proteina C, proteina S)
- iperomocisteinemia: causata da una mutazione al gene MTHFR e correlata positivamente col
rischio di trombosi
- eccessivi livelli plasmatici di F-VIII
- antagonisti della vitamina K: anticoagulanti orali
- inibitori della trombina
EMOFILIA
- inibitori del fattore Xa
COAGULAZIONE INTRAVASALE DISSEMINATA (CID)
Sindrome acquisita, caratterizzata da un’attivazione incontrollata della coagulazione nel
microcircolo che, da una parte, porta alla formazione di trombi, e dall’altra ha manifestazioni
emorragiche causate dal consumo dei fattori della coagulazione e dal calo delle piastrine.
La CID è sempre una manifestazione clinica secondaria; le principali cause scatenanti sono
infezioni batteriche, traumi e neoplasie. Indipendentemente dalla causa, il fattore scatenante della
coagulazione è l’esposizione del TF, accompagnato dall’inibizione della fibrinolisi.
In caso di CID il laboratorio documenta:
- Allungamento di PT e APTT
- Trombocitopenia
- Diminuzione degli inibitori della coagulazione AT-III, prot. C e prot. S
- Aumento del D-dimero
FIBRINOGENO
Il dosaggio del fibrinogeno è richiesto in numerose situazioni (è proteina di fase acuta, è correlato
con le cardiopatie ischemiche e le emorragie). Esistono vari sistemi per il dosaggio. I principali
sono 2:
- METODO VON CLAUSS: aggiungere al plasma un eccesso di trombina, il tempo
necessario per la formazione del coagulo è inversamente proporzionale al contenuto in fibrinogeno.
- DOSAGGIO FIB PT-DERIVATO: disegno la curva di coagulazione di un campione di
plasma. Essa riflette la differenza tra il campione prima e dopo la trasformazione del fibrinogeno in
fibrina → correlato con [FIB]
77
300-400 mg/dl
NORMALE
Capitolo 7
SCREENING
e
MONITORAGGIO
78
TEST di SCREENING per NEONATI
1- TEST per FENILCHETONURIA (PKU)
2- TEST per IPOTIROIDISMO CONGENITO (CH)
3- TEST per IPERPLASIA SURRENALE CONGENITA
Test di screening per PKU e CH sono diffusi in tutti i paesi occidentali. Analisi costo-beneficio
hanno dimostrato che portano a un risparmio di 215000 euro per paziente.
1) IPERFENILALANINEMIE
Derivano dalla mancata o ridotta conversione di Phe in Tyr. La forma più comune è la PKU
caratterizzata dalla ridotta attività della Phe-idrossilasi. Sono note più di 200 mutazioni nel gene di
questo enzima, diverse nei vari gruppi etnici. La mutazione R408W è associata a un severo quadro
clinico e richiede un’attenta restrizione dietetica della Phe, mentre la mutazione I65T è associata a
un quadro più lieve. E’ autosomica recessiva in 1/10000 nati (1:5400 in Irlanda, 1:16000 in
Svizzera)
Clinica: progressivo deficit mentale, microcefalia, iperattività, convulsioni, ritardo mentale. La
restrizione dietetica deve avvenire entro le prime 3 settimane.
DIAGNOSI
- screening di tutti i neonati con il test di Guthrie: si basa sull’impiego di un antagonista
della Phe, la β-L-tienilalanina che aggiunta a un terreno di coltura, impedisce la crescita di Bacillus
Subtilis. Tale inibizione è rimossa dalla Phe ([C] di almeno 4 mg/dl) e la crescita del batterio è tanto
più rigogliosa quanto più è alta la [C] di Phe
- altri metodi di dosaggio: fluorimetrico, GLC
- diagnosi di portatore: carico di 100 mg/kg di Phe
9 mg/dl a 1 h
NORMALE
5 mg/dl a 4 h
19 mg/dl a 1 h
PORTATORE
79
2) TIROSINEMIA e CONDIZIONI CORRELATE
- albinismo oculo-cutaneo: dovuto a una ridotta sintesi della melanina, nella maggior parte di questi
casi l’attività della tirosinasi risulta assente o ridotta.
- tirosinemia-I (tirosinosi): ridotta attività della fumarilacetoacetato-idrolasi e della acido idrossifenil-piruvico ossidasi con aumentata [C] plasmatica della tiroxina e dei suoi metaboliti (DOPA) e
della Met. Risulta in un danno epatico (epatite acuta infantile, cirrosi nell’adulto), danno tubulare
renale (sindrome di Fanconi).
- tirosinemia-II: deficit dell’enzima epatico tirosina-amino-transferasi. Risulta in danni oculari
(erosioni corneali) e lesioni alla cute del palmo delle mani e dei piedi (formazione di cristalli di Tyr
intracellulari), a volte ritardo mentale.
- tirosinemia transitoria del neonato: dovuta a immaturità epatica. La Tyr accumulata inibisce la
Phe-idrossilasi (false diagnosi di PKU).
- alcaptonuria: dovuta a deficit di acido-omogentisico (HGA)-ossidasi. HGA si accumula e lega al
collagene. Risulta in artrite e pigmentazione (acronosi).
AMINOACIDURIA
Danno TP. SE associata a rachitismo: sindrome di Fanconi (autosomica recessiva con depositi
intracellulari di Cys). Il difetto è un ostacolato efflusso di Cys dai lisosomi. Nel bambino la causa
più comune è la cistinosi.
Sindrome di Fanconi: disfunzione generalizzata del TP
- iperfosfaturia e ipofosfatemia
- glicosuria
- aminoaciduria
- ipourirecemia
- ipocaliemia
- rachitismo resistente a Vit.D
80
MONITORAGGIO dei FARMACI
BIODISPONIBILITA’: rapporto tra sostanza somministrata/dose assorbita
[CONC] STAZIONARIA: si ottiene quando la velocità di eliminazione è uguale alla velocità di
assorbimento.
Il monitoraggio dei farmaci è particolarmente importante per i farmaci con indice terapeutico
ristretto ([C] ottimale terapeutica e [C] tossica molto vicine).
FARMACI SOTTOPOSTI a MONITORAGGIO
anticonvulsivanti (fenobarbital)
immunosoppressori (ciclosporina)
antibiotici (vancomicina)
antitumorali (metotrexate)
cardioattivi (amiodarone)
antipsicotici (litio)
antiretrovirali (ritonavir)
antivirali (ganciclovir)
FARMACOGENETICA e FARMACOGENOMICA
FARMACOGENETICA: studio della relazione tra le varianti di un singolo gene e gli effetti di un
farmaco.
FARMACOGENOMICA: studio della relazione tra le varianti di vari geni, fino all’intero genoma,
e gli effetti di un farmaco.
geneticamente
predisposti
seri effetti collaterali
risposta inadeguata
pazienti in trattamento
All’interno di ogni popolazione esiste un sottogruppo di individui geneticamente predisposti a
soffrire per effetti collaterali di un farmaco o a rispondere in modo inadeguato. Ciò rimarrà celato
fino a che essi non sono esposti al farmaco. Quindi solo l’esposizione al farmaco o test eseguiti a
priori riveleranno la predisposizione genetica.
81
La FAMIGLIA del CITOCROMO P-450
Famiglia di citocromi che assorbe la luce a 450 nm con aggiunta di CO. Ci sono 10 famiglie di CYP
che comprendono più di 100 geni. Sono enzimi localizzati nel reticolo endoplasmatico
dell’epatocita. Importante per la detossificazione degli xenobiotici (es. idrossilazione del
fenobarbitale ne facilita l’escrezione). Una delle funzioni più rilevanti del citP450 è il suo ruolo nel
metabolismo dei farmaci.
gene deleto
MUTAZIONE PUNTIFORME
no enzima
enzima
instabile
enzima
normale
alterata
specificità
no metabolismo
ridotto
metabolismo
normale
metabolismo
possibilità di
nuovo metabolismo
duplicazione del gene
alti livelli di enzima
aumentato
metabolismo
Test in clinica:
CYP2D6 → per antidepressivi, antipsicotici, antiaritmici, β-bloccanti, antiipertensivi.
↓
si richiede la ricerca di mutazioni (frequenza 30% nella popolazione) per evitare episodi di tossicità.
Esempio: ISONIAZIDE (anti TBC) può dare epatite fulminante se è mutato l’N-acetil-transferasi-II.
Iniziare con una dose bassa e monitorare l’attività epatica.
2 modalità di diagnosi
DOSAGGIO ATTIVITA’
TEST GENETICO
ENZIMATICA
potenzialmente evidenzia tutti i
facile e veloce
VANTAGGI
difetti (sensibilità 100%)
consumo di tempo, non è
sensibilità limitata (≈75%),
SVANTAGGI
automatizzato, richiede
costoso e richiede tempo
esperienza, falsi negativi dopo
trsfusione
SNP: ogni individuo può avere un nucleotide o una base diversa dagli altri in una data locazione o
su un cromosoma.
Esistono delle mappe degli SNP che possono essere usate per predire la risposta a un trattamento: si
classificano i genotipi verso cui il farmaco è efficace e quelli verso cui non lo è.
ANALISI FARMACOLOGICA
- FARMACOLOGIA
- studi di farmacocinetica
- studi clinici
82
- BIOCHIMICA
- attività enzimatica, funzione recettoriale, funzione dei trasportatori
- GENETICA
- analisi SNP
- sequenziamento genico
TEST GENETICO
malattie genetiche
rare mendeliane
(geni causali)
farmaco genetica
comuni
(suscettibilità genica)
geni del
metabolismo dei
farmaci
profili SNP
per
metabolismo
dei farmaci
OTTIMA RISPOSTA
RISCHI: implicazioni etiche, legali e sociali.
ORIENTAMENTO della TECNOLOGIA nella CLINICA di LABORATORIO
-TEST GENETICI: con il mappaggio del genoma umano, il campo della diagnostica
molecolare, che include i test genetici, crescerà molto rapidamente.
-FARMACOGENOMICA: studio delle basi genetiche della differenza nella risposta ai
farmaci.
-PROTEOMICA: analisi sistematica delle proteine espresse da una cellula o un tessuto
usando una sensibile, veloce e accurata tecnica di separazione delle proteine e metodi
quantitativi e strumenti di identificazione e caratterizzazione.
- MICRODEVICES BIOMEDICI, NANOTECNOLOGIA, e BIOSENSORI: i micro e nano
devices, con componenti da centinai di micron a pochi nanometri, hanno un potenziale uso
nella diagnosi, prevenzione e trattamento delle malattie.
MEDICINA PERSONALIZZATA: UNA SFIDA PER IL LABORATORIO
L’uso di marker nella diagnosi e terapie bersaglio derivati da un profilo molecolare
individuale rivoluzionerà la cura del paziente.
Principi e conoscenze scientifiche richiesti: - accuratezza dei test e comparabilità dei
risultati tra i laboratori
83
- attenta selezione, in accordo con i colleghi, di
test che contribuiscono alla decisione clinica
- perdita di fiducia nei confronti di test
sostitutivi
- markers di superficie cellulare e sistemi di
trasduzione
- genomica del paziente, genomica della
patologia, proteo mica e farmaco genomica
- sviluppo della bioinformatica e di sistemi di
informazione medica
CITOMETRIA A FLUSSO
Capacità di misurare le proprietà delle cellule in un flusso.
SORTING o FLUORESCENCE-ACTIVATED CELL SORTING (FACS)
Capacità di separare le cellule sulla base delle loro proprietà misurate in un flusso.
ANALISI CELLULARE
CLASSICA MICROSCOPIA
- 100 o 1000 cellule/saggio
- + di 5 min/campione
- risultati soggettivi
- risultati positivi-negativi
- bassa riproducibilità
- lavoro intensivo
- non c’è controllo di qualità
- Parte fluidica
- Parte ottica
- Parte elettronica
CITOMETRIA a FLUSSO
- 10000 o 1000000 di cellule
- ‒ di 1 min/campione
- risultati oggettivi
- risultati numerici
- alta riproducibilità
- pienamente automatizzato
- controllo di qualità
BASI della CITOMETRIA A FLUSSO
cellule in sospensione
fluiscono in singole file attraverso
un volume illuminato dove loro
spargono la luce e emettono una fluorescenza
che è raccolta, filtrata e
convertita i valori digitali
che sono fissati su un computer
Le cellule sono iniettate in una camera in cui è stato creato un flusso laminare che le spinge in un
capillare una alla volta. Qui sono colpite da un laser. Se la cellula è marcata a fluorescenza i raggi
che emette sono catturati da sensori.
la luce è emessa principalmente in 2 direzioni:
FORWARD ANGLE LIGHT SCATTER (FSC) → in avanti
laser
0
sensore
84
90° LIGHT SCATTER (SSC): → angolo di deviazione
laser
sensore
0
sensore
La luce catturata a FSC è proporzionale alla dimensione delle cellule.
L’entità di SSC è proporzionale alla rugosità cellulare e alle proprietà antigeniche.
Con SSC e FSC nel sangue distinguiamo:
LINFOCITI
MONOCITI
GRANULOCITI
piccoli e lisci
medi e media rugosità
grandi e rugosi
Essi sono rappresentati con un istogramma o in DOT PLOT.
Le cellule possono essere marcate con vari fluorocromi. La fluorescenza emessa da ciascuno è
solitamente rilevata in un unico CANALE di FLUORESCENZA. La specificità della rilevazione è
controllata dalla selettività della lunghezza d’onda (λ) dei filtri ottici e degli specchi.
Ogni marcatore rileva una caratteristica diversa
florocromo
2
POSITIVO
FL2
POSITIVO
FL1 e FL2
NEGATIVO
FL1 e FL2
POSITIVO
FL1
PROCEDURA
-prendere campione biologico
-Ab monoclonali
-metterlo in soluzione
-analizzarlo
per sangue, urine, CSF, lavaggio
bronco-alveolare, liquido sinoviale.
Bastano 200 μl di materiale.
SORTING: allarga il campo della citometria a flusso con la capacità di dividere e raccogliere le
cellule che esibiscono un set di caratteristiche identificabile sia meccanicamente che tramite
strumenti elettrici. Le caratteristiche da trovare le programma l’operatore. Es: le cellule sono
caricate con un determinato Ag. Sotto ci sono 2 piastre (+/‒). Le cellule + entrano nella provetta
sotto la piastra ‒ e viceversa. Si possono isolare cellule presenti in circolo per l’1% con una purezza
del 95%.
APPLICAZIONI della CITOMETRIA A FLUSSO
85
- determinazione eterogeneità cellulare
- analisi multiparametrica
- dimensione cellulare e struttura interna
- Ag di superficie cellulare
- studio dell’attività cellulare
- attività enzimi e localizzazione
- citochine intracellulari
- attività dei fagociti
- metabolismo ossidativo
- contenuto totale DNA e RNA
- composizione del DNA
- apoptosi
- sorting
CICLO CELLULARE
Il sorting permette di valutare quante cellule sono in duplicazione. Per rilevare in quale fase del
ciclo sono si utilizza il DNA:
- cellule G0-G1 → euploidi – diploidi
- cellule G2-M → tetraploidi
- cellule ≠ G0 e G1 → aneuploidi
n° cellule
G0-G1
G2-M
S
contenuto DNA
Il sorting può essere utilizzato anche per ricerca di cellule non frequenti (es. eritroblasti fetali dopo
un mese) o per valutare come un soggetto risponde a terapia (leucemie).
86
EMOCROMO
Può essere determinato con tecniche manuali (microscopio) o automatizzate (10 volte più sensibili)
CELLULE CONTATE
ERRORE
TECNICHE MANUALI
eritrociti
globuli bianchi
piastrine
reticolociti
±11%
±16%
±22%
±33,9%
TECNICHE
AUTOMATIZZATE
±1%
±1,5%
±2%
±5%
Valori di riferimento
M
4,6-6,2
13,5-18
4,3-10,8
130-400
0,42-0,5
80-98
F
4,2-5,4
12-16
4,3-10,8
130-400
0,35-0,45→sempre<50%
81-99
Emocromo
12
n° degli eritrociti (10 /litro)
Hb(cianmetaemoglobina)(g/dl)
leucociti (109/litro)
piastrine (109/litro)
Hct (ematocrito)
MCV (femtolitri)
HCT(%)/RBC(x108/μL)x10
MASSA ERITROCITARIA ← MHC (Hb corpuscolare media) pg (10‒12 g)
valori: 26-32
MCHC (concentrazione Hb corpuscolare) g/dl
valori: 32-36
N.B. Importante perché le 2 anemie più diffuse sono la sideropenia e la talassemica
INDICE di ANISOCITOSI ← RDW (ampiezza di distribuzione del volume dei globuli rossi)
valori: 11,5-14,5
Sapere anche il valore degli elettroliti
Neutrofili
0,5x109/litro
TALASSEMIA ETEROZIGOTE: RDW normale; ↓MCV
SIDEROPENIA: ↑RDW; MCV basso-normale
87
Falso ↑MCV: agglutinine fredde, iperglicemia (già attiva nella cellula la soluzione del flusso
durante l’esame)
Falso ↑MCH: iperlipidemia.
Per la conta delle cellule a mano si usa il reticolo di Burker
METODI AUTOMATICI
PRELIEVO: minimizzare l’impiego del laccio per minimizzare l’emoconcentrazione; mescolare
bene con l’anticoagulante.
DILUIZIONE: il tipo di fluido e l’entità della diluizione dipendono dal tipo di cellula da valutare.
CONTEGGIO: sistema ad impedenza, sistema ottico, sistema misto
IMPEDENZA = resistenza
elettrodi
flusso→
→
→
Se non ci sono cellule la corrente
passa tranquillamente.
Se ci sono si calcola la resistenza.
apertura
Oggi un potente strumento per l’analisi delle cellule del sangue (specialmente globuli bianchi e
reticolociti) è COULTER 3D-VCS tecnology che mostra elevata sensibilità, specificità ed efficienza
88
APOPTOSI
Programma di morte cellulare energia-dipendente.
APOPTOSI
processo attivo
shrinkage cellulare
condensazione nucleare
membrana intatta
non flogosi
NECROSI
processo passivo
rigonfiamento cellulare
rottura membrana
reazione flogistica
L’apoptosi gioca un ruolo attivo nella regolazione della risposta immune e probabilmente nella
patogenesi di alcune malattie autoimmuni (molti autoAg sono substrati per le caspasi).
Caratteristica principale è l’autodigestione controllata della cellula per mezzo dell’attivazione di
proteasi endogene (caspasi). Queste causano la distruzione del citoscheletro (BLEBBING) con
esposizione sulla superficie cellulare esterna della FOSFATIDILSERINA, segnale per i macrofagi.
L’attivazione delle endonucleasi provoca la frammentazione del DNA con condensazione del
nucleo. La perdita della funzione mitocondriale è un evento iniziale e irreversibile.
CASPASI (almeno 10 note)
Proteasi cisteiniche aspartato-specifiche intracellulari. I proenzimi sono attivati dalla rimozione
proteolitica di un frammento N-terminale e dalla formazione di 2 subunità.
Substrati:
- proteine coinvolte nella riparazione cellulare
- proteine coinvolte nel controllo del ciclo cellulare
- proteine coinvolte nella trasduzione del segnale
- proteine coinvolte nell’integrità strutturale della cellula
PROTEINE DELLA FAMIGLIA BCL-2
Importanti regolatrici della sopravvivenza cellulare.
La famiglia comprende sia proteine anti-apoptotiche (BCL-2) sia pro-apoptotiche (BID).
Modificano la soglia di suscettibilità della cellula all’apoptosi. Possiedono una regione C-terminale
idrofobca che permette l’ancoraggio alla membrana del RE, del mitocondrio e del nucleo ( di cui
regolano la permeabilità). → impediscono il rigonfiamento del mitocondrio con fuoriuscita del cytC
Legano inoltre APAF-1, proteina coinvolta nell’attivazione delle caspasi.
CITOCROMO C
89
Normalmente localizzato nello spazio intermembrana mitocondriale. Nelle fasi precoci
dell’apoptosi esce nel citosol. Si lega a APAF attivando la caspasi 9.
PROTEINA FAS TNF RECETTORE-RELATA→ SEGNALE ESTERNO
Il ligando FAS è una proteina trimerica, che legando al suo recettore lo trimerizza (è omotrimero),
attivandolo. Ciò porta al reclutamento della proteina FADD che contiene un dominio della morte in
grado di attivare le caspasi 8, per clivaggio autocatalitico. La caspasi 8 attivata determina
l’attivazione a cascara delle altre caspasi. Questo processo può essere modulato da proteine della
famiglia BCL-2.
METODI di STUDIO dell’APOPTOSI
1- Metodo più chiaro e indiscusso: microscopia elettronica
2- Valutazione della frammentazione della cromatina nucleare mediante:
-elettroforesi del DNA estratto produce una scala caratteristica di frammenti
di oligonucleosomi
-metodi di citometria a flusso che combinano la frammentazione specifica del
DNA e l’integrità della membrana cellulare per distinguere l’apoptosi dalla
necrosi
TUNEL: tecnica che rileva le rotture del DNA marcando l’estremità 3’OH con nucleotidi coniugati
a fluorocromi o a biotina per mezzo di una reazione catalizzata da DNA-polimerasi. Può dare però
risultati falsamente positivi in cellule che sono andate incontro a rotture del DNA non apoptotiche.
Metodo complesso e difficilmente automatizzabile.
3- Annexina V (metodo semplice e robusto, probabilmente il migliore). Durante le fasi precoci
dell’apoptosi la fosfatidilserina (PS) è esposta sulla membrana cellulare esterna. L’annessina
V è una proteina legante i fosfolipidi in presenza di Ca2+ con alta affinità per la PS (è
unasonda sensibile per l’apoptosi). Si usa citometria a flusso con doppia colorazione e 2
markers:
- FITC-annessina V
- ioduro di propidio che colora le cellule necrotiche (valuta integrità cellulare)
ioduro di
propidio
NESSUNA
CELLULE
CELLULA
NECROTICHE
CELLULE
SANE
CELLULE
APOPTOTICHE
annessina V
4- Metodo dell’Apo2.7
L’Ab apo2.7 riconosce una proteina di membrana mitocondriale che è esposta nelle cellule
nelle prime fasi dell’apoptosi. E’ possibile valutare questo Ag in citofluorimetria.
5- Determinazione dell’attività delle caspasi
90
Utilizzo di un substrato caspasi-sensibile e misurazione fluorimetrica
Capitolo 8
EQUILIBRIO
ACIDO-BASE
91
EQUILIBRIO ACIDO-BASE
ACIDO: sostanza in grado di cedere protoni
BASE: sostanza in grado di accettare protoni
Il pH del sangue arterioso è determinato dal rapporto tra la [HCO3‒] e la pCO2
Il rapporto intercorrente tra queste variabili è espresso dall’equazione di Henderson-Hasselbach
HCO3‒]/[H2CO3]
Ricordando l’equilibrio tra queste reazioni:
CO2 + H2O
H2CO3
H+ + HCO3‒
L’equazione può essere espresso in questo modo:
pH = pK + Log [HCO3‒]/(pCO2⋅0,03)
- [HCO3‒] = 24 mMoli/L
- pCO2 = 40 mmHg
-pK = 6,1 per il sistema tampone H2CO3/ HCO3‒
Da qui si ricava che
pH(sangue) = 6,1 + Log 20 = 7,4
pH 7,35-7,45 → normale
6,8-7,8 → compatibile con la vita
[HCO3‒]/pCO2 = 20
pCO2: componente respiratoria dell’equilibrio acido-base. Il suo valore dipende dalla funzione
polmonare.
HCO3‒: componente metabolico dell’equilibrio acido-base. Il suo valore dipende dalla funzionalità
renale e da quella epatica ( la produzione di urea avviene a partire da NH4+ e HCO3‒).
Il controllo della ventilazione è effettuato dal centro respiratorio bulbare che è attivato dall’↑ di
pCO2.
Il rene rigenera HCO3‒ con 3 meccanismi principali:
- riassorbimento di HCO3‒ nel TD e DC con il sodio
- scambio di HCO3‒ con H+ (acido titolabile)
92
- formazione di HCO3‒ ex novo a partire dalla glutammina.
Le cause che modificano il pH sono:
METABOLICHE → compenso respiratorio (rapido 3-6 h)
RESPIRATORIE → compenso metabolico (lento, anche giorni).
1. ACIDOSI METABOLICA
Causa dell’acidosi è l’aumento degli ioni H+, che vebgono tamponati da HCO3-, la cui [C]↓
nel plasma. La base HCO3- è sostituita da Cl- (acidosi IPERCLOREMICHE) o con anioni
patologici quali ac. lattico, corpi chetonici (es. cheto acidosi diabetica) (acidosi
IPOCLOREMICHE con ALTO GAP ANIONICO). Compenso respiratorio (↑VP con
↓pCO2) e infine compenso renale con escrezione di ioni H+
- CARATTERISTICHE PRINCIPALI
- ↓pH
- ↑H+
- ↓pCO2
- ↓HCO3- ↑Cl o normale
2. ALCALOSI METABOLICA
Causa dell’alcalosi è l’↑ [HCO3-] nel plasma per vomito prolungato, somministrazione di
mezzi di contrasto,… Il compenso è respiratorio (↓VP con ↑pCO2); in seguito si attiva il
compenso renale che ↑ l’escrezione di HCO3-.
- CARATTERISTICHE PRINCIPALI
- ↑pH
- ↓H+
- ↑HCO3- ↑pCO2
3. ACIDOSI RESPIRATORIA
Causata da ↑pCO2 per difficoltà di ventilazione, insufficienza respiratoria, asma, grave
broncopatia ostruttiva che impedisce l’eliminazione della CO2. Il compenso è renale con
↑HCO3- CARATTERISTICHE PRINCIPALI
- ↓pH
- ↑H+
- ↑pCO2
- ↑HCO3-
93
4. ALCALOSI RESPIRATORIA
Causata da ↓pCO2 legata ad aumento dell’attività respiratoria (febbre, anemia, stati d’ansia).
Compenso renale che trattiene H+ ed elimina HCO3- CARATTERISTICHE PRINCIPALI
- ↑pH
- ↓H+
- ↓pCO2
- ↓HCO3-
GAP ANIONICO
E’ una valutazione di ioni plasmatici non misurati che si ottiene sottraendo dalla somma dei cationi
(Na+ e K+) la somma degli anioni (HCO3- e Cl-)
G.A. = Na+ + K+ ‒ Cl‒ ‒ HCO3‒
G.A. = 8 ‒ 12 μmol/L
VALORI MEDI
G.A. > 17 μmol/L
PATOLOGICO
Il GA è utile nella diagnosi differenziale di acidosi metabolica, dal momento che molte sono
caratterizzate dal tipo di anione che aumenta (ac. lattico, corpi chetonici,…)
MIDALITA’ di PRELIEVO EMOGASANALISI
Il prelievo arterioso si esegue sull’arteria radiale. Sono indispensabili stretta anaerobiosi,
conservazione in ghiaccio e processazione rapida.
94
Capitolo 9
MARCATORI
TUMORALI
95
MARCATORI TUMORALI
La diagnosi definitiva di tumore si compone di 3 fasi:
- 1 – diagnostica per immagini
- 2 – indagini sierologiche
- 3 – indagini anatomo-patologiche
Approccio del laboratorio di analisi alla malattia tumorale: analisi del prelievo ematico per
giungere a una diagnosi legata al fatto che il tumore rilascia in circolo molecole che lo
rappresentano. La trasformazione neoplastica è infatti associata all’espressione di proteine
anomale che poi vanno in circolo (situazione ideale).
In realtà: 1) solo una piccola parte delle proteine è implicata nella trasformazione neoplastica;
2) sono rilasciate in piccole quantità
Per questo la biopsia è più sicura per una diagnosi.
Breve storia dei marcatori tumorali.
1846: proteina di BJ
1928: sindrome ormone ectopico
1930: hCG (tumori placentari)
1932: ACTH
1949: delezione Ag gruppi sanguigni
1959: isoenzimi
1963: AFP (α-feto-proteina)
1965: CEA (Ag carcino-embrionale)
1969: oncogeni
1975: Ab monoclonali (utili come reagenti per evidenziare markers)
1980:
1985: geni oncosoppressori
Potenziale uso dei markers tumoral.
- screening della popolazione
- diagnosi differenziali su pz.
96
- valutazione stadio clinico del tumore
- stima del volume del tumore
- indicatore prognostico di progressione
- radioimmunolocalizzazione della massa tumorale
- valutazione successo del trattamento
- valutazione eventuale recidiva
- monitoraggio risposta alla terapia
- determinazione direzione di immunoterapia
Nella diagnostica più comune l’uso del marker è valutare il successo della terapia e le eventuali
ricadute.
ENZIMI COME MARKERS
ALT:
LDH:
fegato
fegato
ALP:
osso, fegato (isoenzima L1), leucemia, sarcoma
AFP:
Ag oncofetale (presente nella vita fetale, è riespresso in caso di tumore). Utile nella
diagnostica del carcinoma epatocellulare (ATTENZIONE! non tutti lo secernono). E’ come
ALB col 4% di glicosilazione.
CEA:
160 aa, differentemente glicosilato. Presenta grande eterogeneità e quindi è di difficile
standardizzazione. Associato a tumore del pancreas, colon, stomaco, polmone, mammella.
PROTEINE COME MARKERS
FERRITINA:
aumenta in caso di neoplasia del fegato
Ag CELLULO-SQUAMOSO:
cervice, pelle, polmone, faringe
Ag TISSUTALI:
riconducibili a frammenti di citocheratine 8- 18- 19 (sono elementi
del citoscheletro). Il più famoso è SARIFA (da citocheratina 19).
Associati a tumore della mammella, ovaio, colecisti, colon, vescica.
MUCINE COME MARKERS
Oligosaccaridi complessi legati a proteina transmembranaria. Composti da 50-80% carboidrati e
acido sialico. Danno viscosità alla soluzione in cui sono identificate. Le mucine compaiono a
seguito di un’alterazione della glucosiltransferasi che altera a sua volta la struttura cellulare. La
cellula perde così la sua polarità e le mucine vanno in circolo.
Esse vengono indicate con la sigla CA (Carboidrato Ag) + numero corrispondente all’Ab
monoclonale che mette in evidenza l’Ag.
97
CA 15.3:
MCA:
proteina MUC-1 con dominio centrale e un numero variabile di tandem repeat
(VNTR). Tumore della mammella
tumore della mammella (non si usa più)
CA 125:
oligosaccaride, aumenta nel tumore dell’ovaio
DU-PAN Z:
per il pancreas, ma non si usa più
CA 19.9:
costituito da un epitopo glucidico sialilato denominato SIALIL……..
Pancreas, colon, retto
ALTRI MARKERS
RECETTORI per ESTROGENI e PROGESTERONE: mammella
METABOLITI CATECOLAMINE: nelle urine. Neuroblastoma (si forma nel cranio e nei gangli
addominali) e feocromocitoma
IDROSSIPROLINA: per metastasi ossee
ONCOGENI TROVATI in TUMORI UMANI
mutazione
proteina RAS
FUNZIONE
trasduzione del
segnale
traslocazione
C. myc
regolazione
della
trascrizione
amplificazione
C. erb B2
recettore per
EGF
PRODOTTI
TUMORE
GTP/GDP
leucemia,
binding protein neuroblastoma,
linfoma
lega DNA
linfoma cellule
B e T,
carcinoma
polmone a
piccole cellule
tirosina-chinasi
mammella,
ovaio, intestino
Non sono specifici dei tessuti
GENI ONCOSOPPRESSORI
mutazione p53: mammella, colon, vescica, polmone, rene, sarcoma, colecisti
mutazione APC: colon, retto
98
Obiettivo clinico
- diagnosi differenziale (distinguere tumore benigno da maligno)
- bilancio di base
- risposta al trattamento primario
- riconoscimento della progressione della malattia
- monitoraggio della malattia avanzata
ATTENZIONE!!! Molte condizioni benigne ↑ i markers
CONDIZIONE
- abitudini voluttuarie
-fumo
-alcol
MARCATORI
CEA, TPA (antigene polipeptidico tissutale)
CEA, TPA
- condizioni fisiologiche
-allattamento
-ciclo mestruale
-gravidanza
MCA
CA 125
AFP, βhCG, TPA, CEA, CA 125, MCA
- patologie non neoplastiche
-ittero
-pancreatite
-nefropatia cronica
-ipertrofia prostatica
-endometriosi
-epatite cronica
-polmonite
-malattie reumatiche
CA 125, CA 19.9, TPA
CA 125, CA 19.9
CEA, TPA, β2microglobulina
PSA, PAP
CA 125
CEA, TPA, AFP, CA 19.9, CA 125, CA 15.3
CEA, TPA
CA 19.9
99
MARCATORI di EVIDENTE UTILITA’ CLINICA
AFP
CA 15.3
epatocarcinoma, tumore germinale di
testicolo e ovaio
mammella
CA 125
ovaio
CA 19.9
pancreas, stomaco, colon
CEA
colon-retto, fasi avanzate di tutti i tumori
HER 2 (rec. EGF)
mammella
NSE (enolasi neuro-specifica)
PSA (Ag prostatico specifico)
carcinoma micro cellulare del polmone e
tutti quelli che derivano dalla cresta
neuronale
prostata
fPSA (frazione libera)
prostata
hCT calcitonina
carcinoma midollare della tiroide
hTC tireoglobulina
carcinoma differenziato della tiroide
catecolamine
carcinoide, tumore neuroendocrino
Ag cellulo-squamoso
collo dell’utero
100
hCG
vescica, corio-carcinoma, ovaio, testicolo
CM-BJ
Mieloma Multiplo
CgA (cromogranina A)
tumori neuroendocrini
CARATTERISTICHE dei PRINCIPALI MARKERS
- CEA - t1/2 = 6-8 gg
↓CEA: intervento chirurgico, successo terapia
↑CEA: patologia benigna del tratto gastroenterico, fegato, polmone, insufficienza renale cronica
Se[CEA] è costante per lungo tempo probabilmente la patologia è maligna
- AFP - t1/2 = 5-6 gg
↑ gravidanza, epatopatia cronica
- CA 15.3 e CYFRA 21.1 - t1/2 non noto
↑epatopatie
- NSE ↑ emolisi campione
- CT - t1/2 = 2-15 minuti → utile fare più prelievi per valutare l’operazione già in sede
intraoperatoria
↑ insufficienza renale cronica, iperparatiroidismo, morbo di Paget
- TPS ↑ patologia benigna del tratto gastrointestinale
- PSA marker tumorale callicreina. Membro delle proteasi a callicreina, è prodotto dalle cellule epiteliali
secretorie della prostata. Si trova nel liquido seminale (mg/dl) in cui ha la funzione di proteasi
(semelogelina e fibronectina) per aumentare la mobilità degli spermatozoi. Nel siero la [C] è
nell’ordine dei ng/ml.
↑ a seconda del numero delle cellule tumorali
colon-retto
I^ scelta: CEA (bilancio di base)
II^ scelta: CA 19.9, TPA
101
stomaco
CA 19.9, CA 72.4, CEA
fegato
AFP, ferritina
ovaio
AFP (germinale), hCG
prostata
PSA totale e lbero
polmone
NSE (microcitoma), CYFRA (spino cellulare),
CEA (adenocarcinoma=origine epiteliale)
Capitolo 10
MALATTIE
AUTOIMMUNI
102
MALATTIE AUTOIMMUNI
Causa: errore del sistema immunitario che produce anticorpi diretti contro Ag-self
Si distinguono in
- malattie sistemiche: LES, artrite reumatoide
- malattie d’organo: tiroidite di Hashimoto, malattie renali, epatiti, cirrosi
biliare, colite ulcerosa, gastrite atrofica, piastrinopenie, anemia emolitica,
malattie emorragiche (Ab contro fattori della coagulazione)
MALATTIE SISTEMICHE
Nelle malattie autoimmuni si ricercano gli Ab autoimmuni con tecniche immunoenzimatiche,
immunofluorescenti e radioimmunologiche.
Gli Ab possono avere vari bersagli:
- Ab anti-nucleo (ANA o FAN)
Si utilizzano vetrini con cellule a cui viene aggiunto il siero del pz. Se ci sono Ab antinucleo questi si legano alle cellule. Si aggiunge un Ab anti-Ig marcato con fluoro
cromo. Osservare con microscopio a fluorescenza.
ENA: sottoclasse degli Ab anti-nucleo. Ab diretti contro strutture nucleari estraibili
con fisiologica (ribinucleoprotine)→ pattern centromerico.
Per identificare gli ENA si usa CRITHIDIA LUCILIAE, un parassita dotato di un nucleo e
di un flagello con DNA a doppia elica e presenza di DNA a singola elica nel nucleo.
- Ab contro nucleoli (RNA, non DNA)
- Ab anti topo-isomerasi
- Ab anti-mitocondriali
Dosare poi il titolo anticorpale
103
- LES:
- ANA anti ds-DNA (double strand), tranne nel caso di LES farmacologico → (Ab
anti-istone)
- ENA
- SCLEROSI SITEMICA:
- ANA
- ENA
- Ab anti-topoisomerasi I
- ARTRITE REUMATOIDE:
- Ab antinucleo negativi
- IgM anti-IgG = fattore reumatoide (FR) NON SPECIFICO
- Ab anti-peptide citrulli nato
- SCLERODERMIA CUTANEA: - Ab anti SCL-70
- Ab anti-actina
- Ab anti-mitocondriali
MALATTIE d’ORGANO
- TIROIDITE:
- Ab anti-tireoglobulina
- Ab anti-perossidasi
(da richiedere per diagnosi e monitoraggio)
- IPERTIROIDISMO AUTOIMMUNE (morbo di Graves):
- Ab anti recettore del TSH (si legano al
recettore e lo attivano)
- MORBO CELIACO:
- IgA anti-glutine → NON SPECIFICI
Per diagnosi ricercare:
- Ab anti-transglutaminasi
- Ab anti-endomisio
- DIABETE TIPO 1:
- Ab anti-isole
- Ab anti-recettore insulina
104
Capitolo 11
EMOGLOBINOPATIE
105
EMOGLOBINOPATIE
Le emoglobinopatie si distinguono in qualitative e quantitative.
- QUANTITATIVE: riduzione dell’espressione di una o più catene globiniche → TALASSEMIA
- QUALITATIVA: derivano dall’alterazione strutturale della molecola che causa falcizzazione
(HbS), alterazione dell’affinità per O2, ecc…
Struttura dell’Hb
L’Hb è una proteina tetramerica contenente 4 gruppi eme, uno per ogni subunità. HbA1 (normale,
dell’adulto) contiene 2 tipi di globina: 2 catene α e 2 catene β. L’eme, costituito dalla proto
porfirina IX e da Fe2+, è situato in una tasca costituita a sua volta da Leucina, isoleucina e altri
amminoacidi idrofobi che impediscono l’ingresso di H2O e l’ossidazione del ferro. Il gruppo eme è
legato alla globina da 2 residui di istidina distale e prossimale.
Nell’adulto sono presenti, in condizioni normali 3 tipi di Hb:
- 97% HbA1 costituita da 2 catene α e 2 catene β
- 2,5-3,2% HbA2 costituita da 2 catene α e 2 catene δ
- HbF in una minima quota costituita da 2 catene α e 2 catene γ
Il 5-6% di HbA1 è glicata (HbA1c).
La catena β è più soggetta a mutazioni, rispetto alla catena α e ciò trova spiegazione a livello
evoluzionistico: l’Hb nei primi organismi viventi si è differenziata dalla mioglobina e si è
specializzata nel trasporto di O2 nella forma tetramerica α2β2. Da questa forma si è costituita HbF
(α2γ2) che ha la caratteristica di avere un’affinità > per O2 e infine, per ulteriore evoluzione si è
costituita la catena δ. La α è rimasta invariata e quindi è più facile riscontrare una patologia a
carico della β.
PRINCIPALI VARIANTI dell’Hb
- HbS: dovuta alla sostituzione nella catena β di un Glu con Val. Ciò comporta l’assunzione della
caratteristica forma a falce dell’eritrocita a basse concentrazioni di O2 e polimerizzazione in
lunghe file
106
- HbE: dovuta alla sostituzione nella catena β di Glu con Lys. HbE è sintetizzata in quantità ridotta
perché la sostituzione crea un sito di splicing alternativo in un esone. Pertanto l’individuo con HbE
mostra caratteristiche della talassemia β
- HbC: dovuta alla sostituzione nella catena β di un Glu con una Lys. I soggetti eterozigoti sono
asintomatici, gli individui omozigoti presentano emolisi associata a splenomegalia, litiasi biliare
- HbM: divuta alla sostituzione di Ist con Tyr. L’Hb non è più in grado di legarsi all’O2 e si stabilizza
in metaemoglobina (Fe3+). Porta a cianosi
TALASSEMIA
E’ causata da una mutazione genetica delle catene globiniche dell’Hb. I difetti possono essere
molti e a vari livelli della molecola. Principalmente comunque le talassemie sono suddivise in:
- β-talassemia o anemia mediterranea.
è la più frequente. L’individuo eterozigote è asintomatico, ma possiede globuli rossi in numero
maggiore, più piccoli (MICROCITEMIA) e poveri di Hb. Gli omozigoti hanno microcitemia, anemia e
povertà di Hb più marcate. Devono subire trasfusioni ogni 15-20 gg che portano però ad un
accumulo di Fe in organi quali cuore, gh. endocrine, fegato compromettendone la funzione.
Necessario somministrare Fe-chelanti.
La malattia può avere diversi gradi di gravità: la sintesi della catena β può essere annullata o
rallentata. In entrambi i casi per compenso ↑ la produzione di HbA2 e HbF. Nella forma più lieve
aumenta solo HbA2 (da 3 a 5%), nelle forme più gravi anche HbF.
- α-talassemia.
causata dalla sintesi rallentata o annullata della catena α. Per compenso si ha nell’adulto un
accumulo di catene β e nel feto di catene γ.
Ciò porta alla formazione di emoglobine patologiche:
- HbH → β4 nell’adulto
- Hb di BART → γ4
nel bambino
Se γ4 e β4 > 20% INCOMPATIBILI con la VITA
METODI di STUDIO
Punto di partenza dell’indagine di laboratorio: ANEMIA riscontrata con un emocromo. L’indagine
comincia con l’ELETTROFORESI dell’Hb. Viene eseguita su emolisati ottenuti lavando i GR con
fisiologica e emolizzandoli. Vengono poi sottoposti a centrifuga per allontanare le membrane. Per
visualizzare le emoglobinopatie correttamente è utile eseguire 2 elettroforesi una a pH basico e
una a pH acido.
………………………………
………………………………..
107
………………………………..
…………………………….
……………………………….
- CROMATOGRAFIA HPCL (cromatografia liquida ad alta selezione)
Esame che permette di valutare le differenze aa delle varianti di Hb in aggiunta a elettroforesi e
FINGER PRINTING. E’ un sistema che permette il confronto di frammenti di Hb tagliati a livello di
Arg (emolisato + tripsina)
ANEMIE EMOLITICHE
Sono causate da Ab diretti contro gli Ag eritrocitari (malattia autoimmune). Varie le cause (es.
incompatibilità Rh tra medre e feto, farmaci …). Per la diagnosi esistono test diretti e indiretti per
evidenziare Ab sul globulo rosso.
ENZIMOPATIE ERITROCITARIE
Gli eritrociti non possiedono mitocondri; perciò le principali vie metaboliche sono:
- glicolisi anaerobia 90%
- via del pentoso-fosfato 10%
- produzione del 2,3-BPG
E’ possibile dosare l’attività enzimatica degli enzimi coinvolti nel metabolismo eritrocitario.
I principali sono:
- G6PD = glucoso-6-fosfato-deidrogenasi: enzima eritrocitario chiave della via dei pentoso-fosfati.
L’enzima riduce un NADP a NADPH, che la cellula usa per ridurre Fe3+ a Fe2+ (enzima METAHb
REDUTTASI). Se non funzione G6PD il soggetto mostra particolare sensibilità a sostanze e farmaci
che hanno potenziale ossidativo (es. FAVISMO → anemia emolitica dopo l’ingestione di legumi;
malattia X-linked). L’attività della G6PD è valutata basandosi sulla riduzione del NADP in un
emolisato con aggiunta di G6PD
- PK = piruvato chinasi (ENZIMA GLICOLITICO)
Catalizza la reazione: fosfoenolpiruvato → piruvato + ATP
La cellula non riesce a produrre sufficiente ATP e muore
PORFIRIE
PORFIRIA: malattia di origine genetica che interessa il metabolismo delle porfirine
PORFIRINURIA: alterazione biometabolica associata con un’escrezione anomala di sostanze
tetrapirroliche, ma indotta da altre condizioni (es. intossicazione da Pb)
METABOLISMO dell’EME
SuccinilCoA + glicina → ac. δ-aminolevulanico (ALA) → porfobilinogeno (PBG) →
→protoporfirina IX e copro porfirina
108
Le porfirie possono essere di tipo eritropoietico o epatico, a seconda che l’alterazione metabolica
risieda nel midollo osseo o nel fegato. Sono dovute a difetti parziali di attività enzimatiche che
comportano l’accumulo di uno o più metaboliti (ALA e porfobilinogeno) nei tessuti e la loro
escrezione con le urine. La porfiria più diffusa è di tipo epatico (PORFIRIA ACURA INTERMITTENTE)
caratterizzata da fotosensibilità (che porta a fotodermatosi), anemia, coliche addominali
intervallate da periodi di benessere. L’alterazione biochimica è il deficit della uroporfirinogeno
sintasi che induce l’ALA sintetasi con accumulo di ALA e porfobilinogeno.
Dosare le porfirine urinarie. Avvolgere il contenitore in un panno perché le porfirine sono sensibili
alla luce.
- 5-10 mg/die
valori normali
PORFIRINURIE
Sono le malattie in cui un’aumentata escrezione di porfirine nelle urine non costituisce la
manifestazione più saliente della patologia. In questi casi il dosaggio delle porfirine urinarie è utile
per la diagnosi.
- Avvelenamento da Pb: inibisce alcuni enzimi del metabolismo dell’eme.
109
