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L’UNIONE EUROPEA APPROVA UN TEST IMPORTANTE NELLA DEFINIZIONE
DEL DOSAGGIO DI FARMACI AD ELEVATA TOSSICITÀ UTILIZZATI NELLA
CHEMIOTERAPIA ANTINEOPLASTICA.
Augusto Pessina,
Dipartimento di Sanità Pubblica, Microbiologia, Virologia ,Facoltà di Medicina e Chirurgia
Università Statale di Milano
La notizia
Il 21 marzo 2006 il comitato scientifico consultivo del Centro europeo per la convalida dei metodi
alternativi (ECVAM) ha approvato sei nuovi metodi di prova alternativi che consentiranno di ridurre il
ricorso alla sperimentazione animale per alcuni farmaci e sostanze chimiche . I nuovi tests, effettuati su
colture cellulari anziché su animali, permettono di determinare la tossicità dei farmaci antitumorali e
identificare i farmaci contaminati. Oltre a ridurre il numero di animali necessari ai fini della
sperimentazione, i metodi approvati oggi miglioreranno l’accuratezza dei test e contribuiranno così a
rendere i prodotti più sicuri.
Uno dei test approvati è noto come Colony Forming Unit-Granulocytes-Macrophages (CFU-GM)
ed è volto a render più preciso il dosaggio di alcuni farmaci ad elevata tossicità utilizzati nella
chemioterapia per la cura dei tumori.
Il gruppo di ricerca
Il lavoro di ottimizzazione , prevalidazione (1) e validazione (2) di questo test nella sua applicazione nel
campo della ematotossicologia è stato eseguito da un gruppo di ricerca internazionale costituitosi nel
1996 e coordinato dal Dr Augusto Pessina ( Responsabile del Laboratorio di Colture Cellulari della
Sezione di Microbiologia del Dipartimento di Sanità Pubblica, Microbiologia, Virologia della Facoltà di
Medicina e Chirurgia dell’ Università Statale di Milano ) . Il gruppo di ricercatori dell’Università di
Milano , con il supporto del Consorzio Milano Ricerche in collaborazione con ECVAM, JRC( Ispra), ha
coordinando lo studio coinvolgendo quattro centri di ricerca in : Spagna (Cell Biology, Environment
Institute, CIEMAT, Madrid); Francia (Ecole Superieure de Microbiologie et Sècurité Alimentaire
(ESMISAB), Universitè de Bretagne Occidentale, Plouzanè ); Belgio ( Department of Environmental
Toxicology, VITO-Flemish Institute for Technological Research, Mol ) e Stati Uniti ( Laboratory of
Pharmacology, Cancer Centre, Wayne State University, Detroit (MI)). La fase di validazione del test è
stata rigorosamente eseguita in “doppio cieco” avvalendosi di agenti esterni: BIBRA International,
Carshalton (UK) ed Oncology Research and Regulatory Consulting Associates, Grosse Pointe Woods
(USA) che hanno fornito le molecole da studiare codificate secondo criteri di GLP e sicurezza.
Il test GM-CFU
Il test validato è un test clonogenico in coltura semisolida ( agar o metilcellulosa) in cui la
proliferazione/differenziazione di progenitori emopoietici è ottenuta per stimolazione “ in vitro” con specifiche
citochine (3). Diversi protocolli sperimentali sono stati suggeriti ed utilizzati in ematologia ma pochi di questi
sono stati sviluppati fino ad ottenere uno procedura operativa standardizzata atta a valutare la tossicità in vitro di
molecole sul sistema emopoietico (4). Lo studio in questione ha riguardato il test clonogenico che prevede la
stimolazione dei progenitori granulocitico-macrofagici (GM-CFU) del quale è stata messa a punto una procedura
standard successivamente analizzata per la sua riproducibilità in condizioni sperimentali diverse per specie
animale (murina verso umana ) , sorgente di progenitori ( midollo osseo verso sangue di cordone ombelicale),
attività stimolante e composizione del terreno colturale (citochina singola verso coktail di citochine ) ecc. In
questo modo è il test è stato adattato ed applicato a studi di ematotossicologia in vitro dove è richiesto che l’attività
tossica del composto sia influenzata il meno possibile dalle condizioni colturali. La validazione ha quindi prodotto
un modello predittivo che permette di aggiustare i dati di tossicità ottenuti nell’animale cosi da applicarli all’uomo
con maggiore affidabilità e sicurezza.
L'ematotossicità
Per comprendere adeguatamente la portata di questo test è necessario avere presente alcuni aspetti
essenziali riguardanti l'ematotossicità.
Il rapido turnover delle cellule del sistema emopoietico (deputato a mantenere l’omeostasi di tutto il
sangue compresa buona parte della componente immunitaria) lo rende un bersaglio molto sensibile ai
fenomeni di tossicità che si esplicano con diversi meccanismi sia verso cellule mature , che verso
progenitori in rapida proliferazione e differenziazione . Questi particolari effetti avversi sono
conseguenza diretta della assunzione di farmaci oppure secondari alla tossicità espressa verso altri
organi o sistemi.
Se per certe terapie ed entro certi limiti un tale effetto tossico è inevitabile per ottenere benefici , in altri
casi è assolutamente intollerabile ed è quindi importante disporre di strumenti adeguati per predire
fenomeni gravi di ematotossicità come certe forme di mielosoppressione o granulocitopenia .
Anche dopo l’avvento dei bersagli molecolari nello sviluppo di nuovi approcci terapeutici , per oltre il 50
% dei farmaci antineoplastici la mielotossicità è ancora una delle maggiori limitazioni all’uso di
dosaggi pieni.
Le agenzie regolatrici richiedono, per tutti i farmaci , studi di tossicologia in vivo in almeno due specie
animali (una delle quali non-roditore, di solito il cane) e la loro potenziale ematotossicità è dedotta dai
parametri di ematologia clinica monitorati nell’animale (come la severità della citopenia, tempi di
esposizione necessari, grado di reversibilità, ecc) sulla base dei quali si tenta di predire la tossicità nella
specie umana. Ancora oggi, i dati sperimentali costituiscono il principale criterio usato per calcolare la
più alta dose da amministrare nella cosiddetta fase I di sperimentazione clinica fatta nell’uomo e gli
aspetti regolatori sottolineano l’importanza di stabilire due fondamentali livelli di esposizione: la più
elevata dose che non causa effetti avversi e quella che causa la massima perturbazione tollerata nella
conta del sangue periferico (definita come MTD)(5). Quasi il 30% dei farmaci fallisce durante i trials
clinici su pazienti a causa degli effetti tossici, nonostante siano stati eseguiti preventivamente tutti i tests
tossicologici in animale .
Proprio per prevedere se un nuovo composto sarà clinicamente tossico sul midollo osseo umano, i tests
in vitro possono ridurre l’incertezza insita nella estrapolazione dall’animale di laboratorio alla specie
umana e contribuire ad una più precisa previsione.
Importanza predittiva del test GM-CFU
Il test GM-CFU è stato validato come strumento predittivo della neutropenia acuta in pazienti esposti a
farmaci antitumorali. La procedura standard utilizza cellule da midollo osseo di topo e cellule da sangue
di cordone ombelicale umano(che contiene cellule staminali e progenitori ematici che rispondono in
modo simile a quelli del midollo osseo) sulle quali viene determinata la tossicità diretta dei composti.
Rispetto alla sola sperimentazione animale , questo test offre un maggior grado di precisione, poichè
affina i margini di sicurezza riducendo l’incertezza dovuta alla estrapolazione animale/uomo e fornisce
una base più razionale per determinare le dosi cliniche e valutare i limiti di esposizione umane definiti
come massima dose tollerata (MDT). In pratica quindi il test GM-CFU contribuisce a ridurre il rischio di
sovradosaggio letale che può verificarsi nel primo gruppo di pazienti trattati con nuovi farmaci.
Infatti, la prima fase della sperimentazione farmacologia clinica ( cosiddetta di fase I ) ha come obiettivo
quello di valutare la MDT nell’uomo mediante somministrazione di quantità crescenti di farmaco in
volontari sani e maschi e nell’intraprendere questa fase clinica è importante che meno pazienti possibile
siano trattati con dosi di farmaco ad elevato rischio tossico. Va anche sottolineato che per i nuovi tipi di
farmaci ( proteine ricombinanti, anticorpi, ecc) che rappresentano oltre il 50 % nelle nuove notifiche , la
tossicologia tradizionale non funziona bene o non funziona affatto e questo test potrebbe offrire un
ulteriore strumento di indagine tossicologica.
Conclusione
I risultati già ottenuti con questo tests sono quindi molto importanti per almeno due fondamentali aspetti:
Uno, più diretto, che i tests in vitro come quello validato contribuiscono a migliorare il livello di
sicurezza nei trials clinici di fase I. Ciò è di importanza critica soprattutto alla luce di quanto
recentemente riportato nel marzo 2006 circa il drammatico esito che ha avuto il trattamento di alcuni
giovani con un nuovo farmaco (TGN1412) in sperimentazione a Londra
L’altro, più generale, sottolinea che le tecniche di colture cellulari in vitro possono essere utili nel
valutare differenze di specie così che con diversi modelli cellulari (per esempio murino e umano ) si
possa tentare di estrapolare dati su possibili effetti “in vivo” nella specie umana. Poiché recenti
pubblicazioni (6,7) hanno anche mostrato che la procedura standard validata può essere miniaturizzato
in piastre da 96 pozzetti essa può quindi essere applicata ad un elevato numero di molecole di grande
interesse per l’industria farmaceutica proprio nelle prime fasi di sviluppo di una nuova molecola.
Infatti, il test nella sua versione miniaturizzata è stato recentemente applicato per valutare la sensibilità in
vitro di precursori mieloidi umani e di topo verso dieci nuove molecole antitumorali della Cancer
Research UK ed ha confermato che le curve dose-risposta predittive come nel test originale validato
tanto da suggerire che possa esser usato in high-throughput screening.
Bibliografia
1 Pessina, A., Albella, B., Bueren, J., Brantom, P., Casati, S., Gribaldo, L., Croera, C., Gagliardi, G., Foti, P.,
Parchment, R., Parent-Massin, D., Sibiril, Y., Schoeters, G. and Van Den Heuvel, R (2001) Prevalidation of a
model for predicting acute neutropenia by Colony Forming Unit-Granulocyte/Macrophage (CFU-GM) assay.
Toxicology in Vitro 15, 729-740.
2 Pessina A, Albella B, Bayo M, Bueren J, Brantom P, Casati S, Croera C, Gagliardi G, Foti P, Parchment R,
Parent-Massin D, Schoeters G, Sibiril Y, Van Den Heuvel R, Gribaldo L. (2003) Application of the CFU-GM
assay to predict acute drug-induced neutropenia: an international blind trial to validate a prediction model for the
maximum tolerated dose (MTD) of myelosuppressive xenobiotics. Toxicological Sciences 75, 355-367.
3 Bradley TR, Metcalf D. (1966) The growth of mouse bone marrow cells in vitro. Austr J Exp Biol Med 44,
287-298.
4 Pessina A, Malerba I, Gribaldo L.(2005) Haematotoxicity testing by cell clonogenic assay in drug development
and preclinical trials. Curr.Pharmaceut.Design 11,1055-1065.
5 Parchment RE, Huang M, Erickson-Miller CL.(1993) Roles for “In vitro” Myelotoxicity Tests in Preclinical
Drug Development and Clinical Trial Planning. Toxicologic Pathology 21, 241-250.
6 Pessina A, Croera C, Bayo M, Malerba I, Passardi L, Cavicchini L,Neri MG, Gribaldo L.(2004) A
methylcellulose microculture assay for the in vitro assessment of drug toxicity on granulocyte- macrophage
progenitors (CFU-GM). ATLA 32,7-23.
7 Malerba I, Ferrario D,Farmer H,Gribaldo L,Casati S. (2006). Inhibition of GM-CFU colony growth by ten
anticancer drugs assessed by a high-throughput clonogenic microtest. Comm. To 46th ETCS Meeting , March
26-29, Verona, Italy.