Metodi Spettroscopici in Biochimica
Principi e Applicazioni
R. Zanasi
Dipartimento di Chimica e Biologia
L’assorbimento e l’emissione di radiazione elettromagnetica da
parte della materia sono processi molto importanti, non solo per lo
studio dei sistemi biologici, ma anche per le funzioni della vita così
come la conosciamo.
Chemical structure of beta-carotene. The eleven conjugated
double bonds that form the chromophore of the molecule are
highlighted in red.
Senza
l’interazione
tra
luce
e
cromofori non ci sarebbe percezione
visiva e le piante non sarebbero in
grado di eseguire la fotosintesi per
produrre zuccheri e altri carboidrati.
Structure of chlorophyll a
Nello studio delle strutture
biologiche
l’interazione
tra
radiazione e materia non è
limitata alla sola regione visibile
dello spettro elettromagnetico.
In
spettroscopia
biologica,
radiazione di lunghezza d’onda
variabile in ordine di grandezza
tra km e nm è stata impiegata
con successo.
ESR
NMR
Ci sono molte sorgenti di radiazione. Per esempio, la radiazione
visibile (“Luce”) è generata da reazioni chimiche e trasformazioni di
energia nella fiamma che si produce bruciando sostanze di vario
tipo.
Nel sole, la “luce diurna” è generata dalla fusione nucleare di H in
He, durante la quale un largo intervallo di radiazione è emesso che
si estende ben oltre la regione visibile. Fortunatamente,
l’atmosfera assorbe la maggior parte della luce ad alta energia,
come la radiazione ultravioletta (UV) che è pericolosa per la vita
sul nostro pianeta.
Radiazione elettromagnetica è generata da scariche elettriche
come, ad esempio, fulmini, tubi al neon, ecc..
Radiazione è generata anche da circuiti elettrici, per esempio
radio, televisione, cellulari, ecc..
Anche certi animali sono capaci di generare radiazione elettromagnetica.
Esempi sono alcuni tipi di meduse e le lucciole.
La medusa luminescente (aequorea
victoria) è capace di produrre lampi
di luce blu (469 nm).
I lampi di luce blu sono prodotti da un incremento intracellulare di
[Ca2+] che causa la transizione
Aequorin + 3Ca2+ Apoaequorin + CO2 + hv (469 nm) + coelenteramide
Apoaequirin + coelenterazine + O2 Aequorin
Aequorin ribbon diagram
from PDB (Protein Data
Bank) database with
prosthetic group
coelenterazine in blue
Mechanism of Action
The two components of aequorin
reconstitute spontaneously, forming
the functional protein. The protein
bears three binding sites for Ca2+
ions. When Ca2+ occupies such sites,
the protein undergoes a
conformational change and converts
through oxidation its prosthetic
group, coelenterazine, into excited
coelenteramide and CO2. As the
excited coelenteramide relaxes to the
ground state, blue light (wavelength
= 469 nm) is emitted.
La luce blu è quindi trasdotta a verde (502 nm) dalla famosa
green fluorescent protein (GFP)
GFP ribbon diagram. From PDB
In 1961, Osamu Shimomura of Princeton University extracted green
fluorescent protein (GFP) and another bioluminescent protein, called
aequorin, from the large and abundant hydromedusa Aequorea victoria, while
studying photoproteins that cause bioluminescence by this species of jellyfish.
Three decades later, Douglas Prasher, a post-doctoral scientist at Woods Hole
Oceanographic Institution, sequenced and cloned the gene for GFP. Martin
Chalfie of Columbia University soon figured out how to use GFP as a
fluorescent marker of genes inserted into other cells or organisms. Roger
Tsien of University of California, San Diego, later chemically manipulated GFP
in order to get other colors of fluorescence to use as markers. In 2008,
Shimomura, Chalfie, and Tsien won the Nobel Prize in Chemistry for their
work with GFP.
Man-made GFP is now commonly used as a fluorescent tag to show which cells
or tissues express specific genes. The genetic engineering technique fuses the
gene of interest to the GFP gene. The fused DNA is then put into a cell, to
generate either a cell line or (via IVF techniques) an entire animal bearing the
gene. In the cell or animal, the artificial gene turns on in the same tissues and
the same time as the normal gene. But instead of making the normal protein,
the gene makes GFP. One can then find out what tissues express that protein
—or at what stage of development—by shining light on the animal or cell and
observing fluorescence. The fluorescence shows where the gene is expressed.
The Nobel Prize in Chemistry 2008 was awarded jointly to Osamu
Shimomura, Martin Chalfie and Roger Y. Tsien "for the discovery and
development of the green fluorescent protein, GFP".
La radiazione è caratterizzata da una lunghezza d’onda,
un’ampiezza e velocità di propagazione.
Energia, frequenza, lunghezza d’onda e numeri d’onda sono dati
dalle seguenti equazioni
Costante di Planck
Velocità della luce nel vuoto
Numeri d’onda in cm-1
L’onda elettromagnetica è descritta come
Electromagnetic waves can be imagined as a self-propagating transverse
oscillating wave of electric and magnetic fields. This diagram shows a plane
linearly polarized wave propagating from left to right. The electric field is in a
vertical plane and the magnetic field in a horizontal plane
Una tipica modalità spettroscopica è quella di mandare radiazione
attraverso un campione, continuamente o a impulsi.
In funzione del tipo di radiazione le molecole del campione
reagiscono alla perturbazione elettromagnetica mediante una
alterata distribuzione delle cariche e degli spin molecolari.
Occorre spigare:
1) perché solo un certo tipo di radiazione è assorbita;
2) quanto velocemente le molecole reagiscono alla perturbazione;
3) quanta materia viene alterata dalla radiazione.
Introduciamo una descrizione qualitativa dell’interazione
radiazione/materia percorrendo le varie regioni spettrali
che sono individuate dal tipo di risposta molecolare alla
perturbazione.
Regione delle radio frequenze (rf): si estende
dal MHz (km) a circa 50 GHz (cm).
Queste frequenze sono usate in spettroscopie di
risonanza magnetica nucleare (NMR, MHz) e in
spettroscopia
di
risonanza
paramagnetica
elettronica (EPR, anche chiamata spettroscopia
di risonanza di spin elettronico, ESR, GHz).
L’assorbimento di energia radiante provoca il
ribaltamento degli spin nucleari o elettronici ed
è dell’ordine di 0.001-20 J/mol.
Allo spin è associato un piccolo dipolo magnetico
e il ribaltamento dello spin risulta dalla
interazione di questo dipolo con il campo
magnetico della radiazione ad una frequenza
appropriata.
All isotopes that contain an odd number of protons and/or of
neutrons have an intrinsic magnetic moment, in other words a
nonzero spin, while all nuclides with even numbers of both have a
total spin of zero.
The most commonly studied nuclei are 1H and 13C, although nuclei
from isotopes of many other elements (e.g. 2H, 6Li, 10B, 11B, 14N,
15N, 17O, 19F, 23Na, 29Si, 31P, 35Cl, 113Cd, 129Xe, 195Pt) have
been studied by high-field NMR spectroscopy as well.
Regione delle microonde: 30 GHz (1cm) - 3000 GHz (0.1mm).
Queste frequenze sono usate in spettroscopie rotazionale. In
questo tipo di spettroscopia, solo le molecole che possiedono un
momento di dipolo elettrico permanente (polari) possono interagire
con la radiazione elettromagnetica.
L’energia rotazionale molecolare è quantizzata. Pertanto solo le
frequenze corrispondenti alla differenza di energia tra due livelli
rotazionali possono essere assorbite. Questa separazione è
dell’ordine di 100 J/mol.
L’assorbimento di energia radiante provoca
distribuzione della popolazione dei livelli rotazionali.
Molecole attive: H2O, HCl, HCN, CO,…
Molecole non attive: H2, O2, C6H6, CH4, CO2, Cl2,…
una
diversa
Regione infrarossa (IR): 3x1012 Hz (0.1mm) – 3x1014 Hz (1m).
Queste frequenze sono usate in spettroscopie vibrazionale. La
spettroscopia vibrazionale è particolarmente utile in chimica e
biochimica.
La separazione tra i livelli di energia vibrazionale molecolari è
dell’ordine di 10 kJ/mol.
L’assorbimento di radiazione provoca una diversa distribuzione di
carica. Pertanto, solo i moti vibrazionali che comportano una
variazione del momento di dipolo elettrico molecolare possono
interagire con la radiazione.
Prendiamo il caso del biossido di carbonio ad esempio
Nella vibrazione “stretching simmetrico” la molecola di CO2 è
alternativamente allungata e compressa, entrambi i legami vibrano
simultaneamente (simmetricamente) e il momento di dipolo non
cambia. Questo particolare moto vibrazionale non è arrivo in IR.
Regione visibile e ultravioletto (UV-Vis): 3x1014 Hz (1m) – 3x1016
Hz (10nm).
Queste frequenze sono usate in spettroscopie elettronica.
La separazione tra i livelli di energia degli elettroni di valenza è
dell’ordine di 100 kJ/mol.
Le transizioni elettroniche comportano una ridistribuzione di carica
e, pertanto, a una variazione del momento di dipolo elettrico
molecolare, provocato dall’interazione con il campo elettrico della
radiazione.
Regione dei raggi X: 3x1016 Hz (10nm) – 3x1018 Hz (100pm).
Queste frequenze provocano transizioni degli elettroni interni.
La separazione tra i livelli di energia degli elettroni interni è
dell’ordine di 10000 kJ/mol.
Regione dei raggi : 3x1018 Hz (100pm) – 3x1020 Hz (1pm).
Queste frequenze provocano transizioni coinvolgenti particelle
nucleari. L’energia assorbita è dell’ordine di 109-1010 J/mol.
Tryptophan
Tyrosine
Phenylalanine
Amino Acid
3-Letter
1-Letter
Side-chain
polarity
Side-chain
charge (pH
7.4)
Hydropathy
index
Alanine
Ala
A
nonpolar
neutral
1.8
Arginine
Arg
R
polar
positive
−4.5
Asparagine
Asn
N
polar
neutral
−3.5
Aspartic acid
Asp
D
polar
negative
−3.5
Cysteine
Cys
C
polar
neutral
2.5
Glutamic acid
Glu
E
polar
negative
−3.5
Glutamine
Gln
Q
polar
neutral
−3.5
Glycine
Gly
G
nonpolar
Neutral
−0.4
Histidine
His
H
polar
positive(10%)
neutral(90%)
−3.2
Isoleucine
Ile
I
nonpolar
Neutral
4.5
Leucine
Leu
L
nonpolar
Neutral
3.8
Lysine
Lys
K
polar
positive
−3.9
Methionine
Met
M
nonpolar
neutral
1.9
Phenylalanine
Phe
F
nonpolar
neutral
2.8
Proline
Pro
P
nonpolar
neutral
−1.6
Serine
Ser
S
polar
neutral
−0.8
Threonine
Thr
T
polar
neutral
−0.7
Tryptophan
Trp
W
nonpolar
neutral
−0.9
Tyrosine
Tyr
Y
polar
neutral
−1.3
Valine
Val
V
nonpolar
neutral
4.2
Absorbance
λmax(nm)
ε at λmax
(x10−3 M−1
cm−1)
250
0.3
211
5.9
257, 206, 188 0.2, 9.3, 60.0
280, 219
5.6, 47.0
274, 222, 193 1.4, 8.0, 48.0
Spettroscopia Infrarossa (IR)
La spettroscopia infrarossa è una spettroscopia tipicamente di
assorbimento che interessa la regione a lunghezza d’onda
maggiore (frequenza ed energia minore) rispetto alla luce
visibile (1-100 1m).
L’energia della luce infrarossa non è sufficiente a indurre
transizioni degli elettroni di valenza. La radiazione infrarossa
eccita moti vibrazionali e rotazionali nelle molecole.
I principi della spettroscopia infrarossa sono gli stessi della
spettroscopia UV-Vis. Tuttavia, gli spettri infrarossi presentano
usualmente il grafico della trasmittanza percentuale in funzione
del numero d’onda in cm-1.
Un tipico spettro IR copre da 4000-10000
superiore) a 100-800 cm-1 (limite inferiore).
cm-1
(limite
Le transizioni vibrazionali molecolari avvengono fra livelli di
energia vibrazionale distinti.
La più semplice situazione possibile è la vibrazione di due atomi
in una molecola biatomica. La distanza tra i due atomi varia
continuamente e la distanza internucleare media definisce la
distanza di legame.
Se assumiamo che il legame tra
i due atomi sia comparabile a
una molla tra due sfere di
massa m1 e m2 e che la forza di
compressione o espansione sia
data dalla legge di Hook,
abbiamo il cosiddetto modello
dell’oscillatore armonico.
(Notare che la forza si oppone
allo spostamento degli atomi.)
L’energia potenziale classica dell’oscillatore armonico
aumenta simmetricamente quando la distanza tra gli atomi
varia. Il suo valore dipende dall’ampiezza del moto che
classicamente può essere qualsiasi.
0.9
2r0Ep/k
La vibrazione di una tale
molecola diatomica è
caratterizzata da una
frequenza di oscillazione
che è data dalla meccanica
classica:
0.8
0.7
0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
dove è la massa ridotta
del sistema:
0.1
0
0
0.5
1
1.5
r/r0
2
La frequenza di oscillazione non dipende dall’ampiezza dell’oscillazione.
In contrasto alla meccanica classica, l’energia vibrazionale delle
molecole è quantizzata (come ogni altra energia molecolare). I
livelli di energia vibrazionale permessi sono
Dove v è il numero quantico vibrazionale e n è la frequenza di
vibrazionale classica.
Il numero quantico vibrazionale può assumere i valori 0,1,2,3,…
ciò implica che il più basso valore di energia non è nullo (gli
atomi vibrano sempre, anche allo zero assoluto).
La quantità
è nota come energia di punto zero.
Un ulteriore risultato che si
ottiene applicando il trattamento
quantistico al modello
dell’oscillatore armonico è la
semplice regola di selezione
Riassumendo:
1) durante il moto vibrazionale il
momento di dipolo elettrico della
molecola deve cambiare;
2) sono permesse solo transizioni
tra livelli di energia adiacenti.
L’energia della transizione è data da:
Ciò significa che per l’oscillatore armonico i livelli di energia
vibrazionale sono equidistanti, indipendentemente dal numero
quantico vibrazionale .
Quando la frequenza della radiazione è identica a quella della
vibrazione, si ha risonanza: la radiazione viene assorbita
causando la transizione vibrazionale, sempre nel caso in cui il
momento di dipolo elettrico della molecola cambi durante il moto
vibrazionale.
L’intensità complessiva dell’assorbimento dipende dall’intensità
della radiazione (densità di radiazione, quantità di fotoni) e dal
numero di molecole in grado di compiere la transizione
vibrazionale (vedi legge di Bouguer-Beer-Lambert)
Il modello dell’oscillatore
comportamento reale.
armonico
descrive
abbastanza
bene
il
Tuttavia, le molecole non si comportano esattamente come masse
connesse da una molla, in quanto i legami chimici:
sono sì elastici, ma non obbediscono alla legge di Hook;
si rompono se allungati oltre un certo limite e la molecola dissocia;
non possono essere accorciati fino a far sovrapporre i nuclei, i quali si
respingono fortemente se avvicinati.
Questo comportamento è descritto in modo più accurato dalla funzione
di Morse, che è un’approssimazione migliore del potenziale
dell’oscillatore armonico.
La costante di anarmonicità
x è piccola e positiva.
I livelli di energia
vibrazionale non sono più
equidistanti, ma si
avvicinano sempre più
aumentando il numero
quantico vibrazionale
Dove a è una costante che
dipende dal legame e DMin è
l’energia di dissociazione del
legame stesso.
Le regole di selezione per l’oscillatore
anarmonico sono
Comunque, l’intensità degli
assorbimenti diminuisce fortemente
aumentando il salto energetico, al
punto che transizioni
sono raramente osservate.
Nel caso di molecola poliatomiche si ha più di un legame chimico.
Inoltre, ci sono altri gradi di libertà vibrazionali.
Una molecola con N atomi può essere descritta localizzando ogni
atomo nello spazio mediante tre coordinate x,y,z, per un totale di 3N
coordinate o gradi di libertà totali.
La traslazione della molecola tutta assieme rigidamente (tutti gli
atomi nella stessa direzione per un uguale spostamento) richiede 3
coordinate del centro di massa (3 gradi di libertà non vibrazionali).
Allo stesso modo, la rotazione della molecola rigida attorno al centro
di massa richiede 3 assi di rotazione, ovvero altri 3 gradi di libertà
non vibrazionali (2 nel caso di molecole lineari).
Pertanto restano:
3N-6 (molecole non lineari )
3N-5 (molecole lineari)
gradi di libertà vibrazionali
H2O GLV=3
CO2 GLV=4
Ad ogni grado di libertà vibrazionale corrisponde un modo di
vibrare della molecola detto fondamentale o normale.
I modi normali di vibrazione sono classificati come simmetrici o
antisimmetrici se la simmetria della molecola è mantenuta o no
durante la vibrazione.
O
H
O
H
Stiramento
simmetrico
H
O
Stiramento
asimmetrico
O C O
H
H
H
Piegamento
O C O
O C O
O C O
Stiramento
simmetrico
Stiramento
asimmetrico
Piegamento (degenere)
Symmetrical
stretching
Antisymmetrical
stretching
Scissoring
Rocking
Wagging
Twisting
Un altro risultato molto importante della meccanica quantistica, di
carattere generale, descrive come una molecola che si trova in un
determinato livello energetico possa assorbire o emettere radiazione.
Si dice emissione stimolata il fenomeno quantistico per cui la
radiazione elettromagnetica, oltre che ad eccitare un sistema, può
anche stimolarne la diseccitazione. Se si applica la teoria delle
perturbazioni dipendente dal tempo si ottiene infatti che la probabilità
di transizione fra due livelli è pari al 100% quando l‘energia della
radiazione incidente è pari alla differenza di energia fra i due livelli. Se
il sistema si trovava nel livello inferiore si ha un fenomeno di
assorbimento risonante della radiazione, ovvero l‘onda viene assorbita
ed il sistema si eccita al livello superiore. Se, al contrario, il sistema
era già eccitato si disecciterà emettendo radiazione elettromagnetica
alla stessa frequenza, e nella stessa direzione, di quella incidente.
Questo fenomeno è alla base del funzionamento dei laser e dei maser.
A laser is a device that emits light (electromagnetic
radiation) through a process of optical amplification
based on the stimulated emission of photons. The
term "laser" originated as an acronym for Light
Amplification by Stimulated Emission of Radiation.
Questo significa che l’assorbimento viene parzialmente
compensato dalle molecole già eccitate.
Per una data transizione, l’intensità di
assorbimento risulta quindi proporzionale
alla differenza
tra il numero di particelle nel livello
inferiore e il numero di particelle nel
livello superiore.
Il rapporto tra le popolazioni è dato dalla legge di distribuzione di Boltzmann
numero d'onda cm-1
Velocità della luce (c) m/s
Coantante di Plank (h) Js
Frequenza (n) s-1
Costante di Boltzmann (k) J/K
Temperatura (T) K
hn/kT
Nm/Nn
Nn/Nm
100
200
500
1000
2.998E+08
6.626E-34
2.998E+12 5.996E+12 1.499E+13 2.998E+13
1.381E-23
298.15
0.482
0.965
2.412
4.825
0.6173
0.3810
0.0896
0.0080
1.6200
2.6245
11.1592
2000
3000
4000
5.996E+13
8.994E+13
1.199E+14
9.649
0.0001
14.474
0.0000
19.298
0.0000
124.5273 15507.0517 1931051.4784 240468651.8675
Nel caso della spettroscopia IR, nell’intervallo tipico di numeri d’onda
500-4000 cm-1, la maggior parte delle molecole a temperatura
ambiente popolano il livello di energia vibrazionale più basso.
Lo spettro IR è quindi dominato da assorbimenti di radiazione che
provocano transizioni vibrazionali 0 1 (fondamentali).
Altri assorbimenti più deboli possono essere notati per transizioni
vibrazionali 0 2, 0 3, … (sovratono, overtone).
In ogni caso, il momento di dipolo elettrico della molecola deve
variare durante il moto vibrazionale.
Le transizioni vibrazionali si possono combinare. In questo caso
l’assorbimento avviene a una frequenza pari alla somma delle
frequenze dei modi individuali. E’ sufficiente che un solo modo
vibrazionale provochi la variazione del momento di dipolo elettrico
della molecola affinché l’assorbimento combinato sia attivo.
esempi
Che tipo di informazione può essere ottenuta dalla spettroscopia IR
eseguita su campioni biologici?
Una delle principali applicazioni della spettroscopia IR in biologia
riguarda l’identificazione della struttura secondaria delle proteine.
I gruppi di atomi in una sequenza poli-peptidica di una proteina
vibrano diversamente se la struttura secondaria è di tipo alfa elica
(a-helix) o foglietto beta (b-sheet).
Questi motivi strutturali vennero correttamente predetti da Pauling
e Corey usando considerazioni teoriche ancora prima della loro
effettiva determinazione sperimentalmente.
Proc. N.A.S. 1951,37, 205
Linus Pauling and Robert
Corey examining models
of protein structure
molecules. approx. 1951.
Julian Voss-Andreae's Alpha
Helix for Linus Pauling (2004),
powder coated steel, height 10
ft (3 m). The sculpture stands
in front of Pauling's childhood
home on 3945 SE Hawthorne
Boulevard in Portland, Oregon,
USA.
Un vantaggio delle tecniche spettroscopiche rispetto alla cristallografia
a raggi x, che richiede cristalli di proteina allo stato solido, è che
queste tecniche possono essere usate per determinare gli elementi
strutturali delle proteine in soluzione acquosa.
Questi metodi sono molto utili perché permettono di chiarire
velocemente la struttura secondaria di una proteina e di determinare
se ci sono variazioni strutturali in seguito all’interazione con altre
molecole.
Inoltre, la moderna spettroscopia IR consente esperimenti risolti nel
tempo (time resolved) per monitorare i cambiamenti di folding delle
proteine e nello studio della funzione delle proteine.
La spettroscopia IR può essere applicata a proteine molto grandi, a
differenza della spettroscopia NMR.
a helix
Nelle a eliche lo scheletro del polipeptide
risulta strettamente arrotolato attorno a un
asse centrale immaginario, mentre i gruppi
laterali
degli
amminoacidi
sporgono
radialmente all'esterno dell'elica.
L’ a elica è stabilizzata da legami idrogeno tra
i gruppi NH e CO della catena centrale. Il
gruppo CO di ogni amminoacido è legato al
gruppo NH dell’amminoacido che è quattro
residui più avanti nella sequenza lineare, così
che tutti i gruppi CO e NH della catena
principale sono legati fra loro mediante legami
idrogeno.
3.6 residui formano un giro completo.
L’angolo tra due amminoacidi è di 100 a la
loro distanza proiettata sull’asse dell’elica è
1.5 Å, corrispondente a uno spostamento di
5.4 Å per giro completo.
b sheet
Il foglietto β è la seconda forma più diffusa di struttura secondaria
delle proteine, che consiste di più filamenti β disposti uno accanto
all'altro e collegati tra loro da tre o più legami idrogeno che formano
una struttura planare molto compatta.
Si definisce filamento β (β-strand) una sequenza peptidica di
amminoacidi (tipicamente composta da 5 – 10 amminoacidi) che si
dispone linearmente ed è in grado di instaurare legami idrogeno.
Catene adiacenti possono essere parallele, se sono orientate nella
stessa direzione, o antiparallele (direzione opposta).
Il cambio di direzione della catena di un polipeptide tra due βstrands è detto β-turn.
Nei peptidi e nelle proteine ci sono tre bande di assorbimento IR
importanti:
amide A band a 3300 cm-1 dovuta alla vibrazione di stretching del
legame N-H
amide I band a 1650 cm-1 dovuta alla vibrazione di stretching del
legame C=O
amide II band a1550 cm-1 dovuta alla vibrazione di bending del
legame N-H
Queste vibrazioni non sono indipendenti. A causa della formazione
dei legami idrogeno i gruppi CO ed NH diventano oscillatori
accoppiati.
Nelle a eliche e nei foglietti b l’accoppiamento degli oscillatori è
differente, pertanto gli spettri IR dipendono dalla struttura
secondaria.
La grande differenza tra le bande di assorbimento per le
diverse conformazioni delle proteine si osserva in generale.
Sulla base di queste relazioni tra struttura secondaria e frequenze di
assorbimento IR, le componenti strutturali delle proteine possono
essere determinate.
Tuttavia, le bande di assorbimento sono larghe e spesso si
sovrappongono tra loro per produrre un profilo di assorbimento
complesso.
Per trovare le componenti strutturali delle proteine è necessario
ricorrere a processi di deconvoluzione.
Deconvolution is an algorithm-based process used to reverse the
effects of convolution on recorded data. In general, the object of
deconvolution is to find the solution of a convolution equation of the
form:
f*g=h
Usually, h is some recorded signal, and ƒ is some signal that we wish
to recover, but has been convolved with some other signal g before
we recorded it. This is most often done using methods of statistical
estimation.
Spettroscopia di Assorbimento UV-Vis
La regione spettrale di interesse
per la spettroscopia UV-Vis copre
l’intervallo
3x1014 Hz – 3x1016 Hz
1m
– 10nm
Che corrisponde a valori di
energia in grado di provocare
transizioni elettroniche.
Questo tipo di spettroscopia trova
applicazioni sia in assorbimento
che in emissione.
Solar spectrum
with Fraunhofer
lines
Designation Element
y
Z
A
B
C
a
D1
D2
D3 or d
e
E2
b1
b2
b3
b4
b4
O2
O2
O2
O2
Hα
O2
Na
Na
He
Hg
Fe
Mg
Mg
Fe
Fe
Mg
Wavelength
(nm)
898.765
822.696
759.370
686.719
656.281
627.661
589.592
588.995
587.5618
546.073
527.039
518.362
517.270
516.891
516.891
516.733
Designation Element
c
F
d
e
G'
G
G
h
H
K
L
N
P
T
t
Fe
Hβ
Fe
Fe
Hγ
Fe
Ca
Hδ
Ca+
Ca+
Fe
Fe
Ti+
Fe
Ni
Wavelength
(nm)
495.761
486.134
466.814
438.355
434.047
430.790
430.774
410.175
396.847
393.368
382.044
358.121
336.112
302.108
299.444
Gli atomi producono spettri elettronici puri che sono relativamente
semplici da interpretare.
Ad esempio, La spettrofotometria di assorbimento atomico (AAS)
è una tecnica analitica impiegata per la determinazione sia quantitativa
che qualitativa di ioni metallici in soluzione. A differenza delle molecole
gli atomi non contengono sottostrutture rotazionali o vibrazionali e
pertanto l'assorbimento di una radiazione elettromagnetica non
avviene in una banda di frequenze ma ad una e una sola frequenza.
Tutto ciò implica che ogni atomo avrà il suo spettro di assorbimento
caratteristico e per ogni lunghezza d'onda, a cui corrisponde una
transizione sufficientemente probabile, è possibile effettuare misure
quantitative applicando la legge li Lambert-Beer.
Hollow cathode lamp (HCL)
Xenon lamp as a continuous radiation source
La spettroscopia di emissione atomica, spesso indicata con
l’acronimo AES (Atomic emission spectroscopy) o OES (Optical
emission spectroscopy), è una tecnica spettroscopica di emissione
utilizzata in analisi chimica. Essa sfrutta la somministrazione di
energia relativamente elevata, tanto da provocare la dissociazione in
atomi e l’eccitazione di quest’ultimi. In base alla lunghezza d’onda
emessa è possibile risalire alla specie incognita, mentre misurando
l’intensità dell'emissione si può effettuare anche l’analisi quantitativa.
Cu
Na
Le molecole hanno spettri elettronici molto più complessi a causa
della presenza dei nuclei.
Gli spettri elettronici molecolari vengono interpretati mediante un
certo numero di approssimazioni, la più importante delle quali
(approssimazione di Born-Oppenheimer) consente di separare
il moto elettronico da quello nucleare.
L'approssimazione di Born-Oppenheimer, nota anche come
approssimazione adiabatica, è una tecnica usata in chimica quantistica
al fine di disaccoppiare i moti di nuclei ed elettroni, cioè per separare
le variabili corrispondenti al moto nucleare e le coordinate
elettroniche. Si basa sul fatto che le tipiche velocità elettroniche sono
molto maggiori di quelle nucleari.
-
+
Poiché le masse dei nuclei atomici sono molto maggiori di quelle degli
elettroni orbitanti (un nucleone pesa circa 2000 volte più di un
elettrone), gli elettroni hanno velocità molto maggiori di quelle dei
nuclei. Per avere un'idea degli ordini di grandezza coinvolti, notiamo
che la velocità tipica di un elettrone all'interno di un atomo è circa 106
ms-1 (velocità di Fermi) mentre quella di un nucleo è circa 103 ms-1
(velocità del suono). Il sistema di elettroni può quindi rispondere
rapidamente a cambiamenti nella configurazione dei nuclei.
In questa approssimazione l’energia totale molecolare può essere
separata in contributi indipendenti dovuti ai moti elettronico,
vibrazionale e rotazionale (trascurando il contributo traslazionale)
Anche le transizioni tra i differenti livelli di energia possono avvenire
indipendentemente
Di norma si ha che
Poiché la variazione della distribuzione elettronica che avviene in
seguito a una transizione elettronica è accompagnata sempre da una
variazione del momento di dipolo elettrico molecolare, tutte le
molecole hanno spettri di assorbimento elettronici, anche quelle che
non hanno spettri rotazionali e roto-vibrazionali (vedi H2, O2).
Quindi, si ha che durante una data transizione elettronica avvengono
contemporaneamente transizioni vibrazionali e rotazionali.
Le transizioni vibrazionali danno luogo alla struttura grossolana a
bande di assorbimento, mentre quelle rotazionali producono una
struttura fine nella quale le bande possono essere risolte adoperando
strumenti adeguati.
Trascurando il contributo rotazionale, l’energia di una particolare
molecola può essere riscritta come (in numeri d’onda)
L’insieme delle transizioni,
che iniziano tipicamente dallo
stato fondamentale
elettronico + vibrazionale,
formano una banda poiché, a
bassa risoluzione, appaiono
allargate e diffuse.
Normalmente, le molecole
hanno molti stati eccitati
elettronici, così l’intero
spettro di assorbimento,
anche di una molecola
biatomica, è più complicato
di quello in figura.
Gli spettri di emissione molecolari sono di norma estremamente più
GG
complicati.
Anche se la meccanica quantistica non impone restrizioni sulla
variazione nel numero quantico vibrazionale durante una transizione
elettronica, le linee vibrazionali che compongono una banda non hanno
tutte la stessa intensità.
In alcuni spettri la transizione (0,0) è la più intensa, in altri l’intensità
aumenta fino ad un massimo per un certo valore del numero quantico
vibrazionale, in altri ancora solo poche linee vibrazionali sono visibili
seguite da un continuo.
Tutti questi tipi si spettri trovano una spiegazione nel principio di
Franck-Condon.
Da un punto di vista classico, il principio di Franck-Condon afferma che
durante una transizione elettronica il moto dei nuclei viene considerato
nullo, in quanto le loro posizioni variano molto più lentamente rispetto
a quelle degli elettroni, dato che la loro massa è maggiore rispetto
quella di questi ultimi. Il moto dei nuclei diventa quindi trascurabile in
confronto a quello degli elettroni.
(Transizioni verticali)
Consideriamo una molecola
biatomica, il suo stato
elettronico fondamentale e uno
stato elettronico eccitato
stabile rispetto alla
dissociazione degli atomi.
In questo caso possiamo
rappresentare i due stati
elettronici mediante due curve
di Morse, tutto sommato
abbastanza simili anche se non
necessariamente uguali.
Lo stato eccitato presenta di
norma una distanza di legame
>= di quella dello stato
fondamentale.
Nel caso si molecole poliatomiche si introduce il concetto di
cromoforo.
Con il termine cromoforo si definisce, in senso ampio, un gruppo di
atomi capaci di conferire colorazione ad una sostanza. Più
specificamente, un cromoforo rappresenta un atomo o gruppo di atomi
di una entità molecolare responsabili dell'insorgere di una data banda
spettrale a seguito di una transizione elettronica. Ciò è possibile in
quanto la configurazione degli orbitali molecolari consente
transizioni elettroniche dovute all’assorbimento di radiazione visibile e
assorbimento nell’UV non lontano; risultano quindi escluse le
transizioni σ → σ*. In genere, tutti i gruppi insaturi possono definirsi
cromofori, in particolare:
C≡C, C=C, C=N, C=O, C=S, N=N, N=O;
sistemi polienici;
anelli aromatici.
Sono cromofori anche gli elementi dei blocchi d ed f.
In chimica, un orbitale molecolare (MO) è una funzione matematica
che descrive il comportamento ondulatorio di un elettrone in una
molecola. Questa funzione può essere usata per calcolare proprietà
chimiche e fisiche come la probabilità di trovare un elettrone in ogni
dato punto dello spazio molecolare.
Gli orbitali molecolari vennero introdotti da
Friedrich Hund e Robert S. Mulliken nel 1927 e
1928.
Gli orbitali molecolari che si formano in seguito al
legame che si instaura tra gli atomi di una
molecola,
possono
essere
stimati
come
combinazione lineare di orbitali atomici (LCAO).
La combinazione lineare di orbitali atomici venne
introdotta da John Lennard-Jones nel 1929.
Per le molecole biatomiche, gli orbitali molecolari si ottengono molto
semplicemente come
Ψ = caψa + cbψb
Ψ * = caψa − cbψb
dove Ψ e Ψ* rappresentano gli orbitali molecolari di legame e
antilegame rispettivamente; ψa e ψb sono gli orbitali atomici degli
atomi a e b che si uniscono nella molecola e ca e cb sono coefficienti che
devono essere determinati sotto certe condizioni.
La combinazione può essere interpretata nel seguente modo:
avvicinando i due atomi i loro orbitali atomici si sovrappongono per
produrre zone di densità elettronica che, interponendosi fra i nuclei,
consentono un equilibrio elettrostatico fra cariche negative e positive,
formando così un orbitale molecolare di legame occupato dalla coppia
elettronica che si colloca a una energia più bassa rispetto a quella degli
orbitali atomici originali.
La combinazione opposta è prevista dalla meccanica quantistica e
rappresenta uno stato eccitato (energia più alta) disponibile per la
transizione elettronica.
σ bonds
I legami sigma sono i legami covalenti più forti. Si formano dalla
sovrapposizione di orbitali atomici lungo la direzione interatomica.
Un legame sigma è simmetrico rispetto alla rotazione attorno all’asse
del legame. Forme comuni di legami sigma sono s+s, pz+pz, s+pz and
dz2+dz2 (dove z è l’asse di legame).
Il corrispondente antilegame σ* è definito dalla presenza di un piano
nodale tra i due atomi legati.
p bonds
I legami pi sono legami
covalenti
che
si
formano
sovrapponendo due lobi di un
orbitale atomico con due lobi di
un secondo orbitali atomico.
Questi orbitali condividono un
piano
nodale
che
passa
attraverso i nuclei degli atomi
coinvolti nel legame.
Forme comuni di legami pi sono
px+px, py+py and dxy+dxy (dove
x,y
sono
direzioni
perpendicolari
all’asse
di
legame).
Il corrispondente antilegame p*
contiene un secondo piano
nodale tra i due atomi legati.
Transizioni elettroniche
s → s*
Elettroni che occupano un HOMO di un legame sigma possono essere
eccitate al LUMO del medesimo legame.
p → p*
Promozione di un elettrone di un orbitale pi di legame ad un orbitale
pi di antilegame.
n → s* , n → p*
Transizioni che provocano l’eccitazione di elettroni appartenenti a una
coppia solitaria.
SHMo2
Simple Huckel Molecular Orbital
Theory Calculator
Carotene is responsible for the
orange colour of the carrots and
many other fruits and vegetables
Lesser Flamingos in the Ngorongoro
Crater, Tanzania. The pink colour of wild
flamingos is due to beta carotene they
absorb from the blue-green algae in
their diet. If fed a carotene-free diet
they become white
Bacteriochlorophylls are photosynthetic pigments that occur in
various phototrophic bacteria. They were discovered by Von Neil in
1932 . They are related to chlorophylls, which are the primary
pigments in plants, algae, and cyanobacteria. Groups that contain
bacteriochlorophyll conduct photosynthesis, but do not produce oxygen.
They use wavelengths of light not absorbed by plants or Cyanobacteria
Spettroscopie Chirottiche
Finora abbiamo considerato fenomeni di assorbimento (o di
emissione) che non dipendono dallo stato di polarizzazione della
radiazione.
I metodi spettroscopici che impiegano luce polarizzata sono di
importanza fondamentale quando il mezzo che interagisce con la
radiazione è di natura chirale.
La chiralità (dal greco χείρ cheir, "mano"), è in senso generale la
proprietà di avere un'immagine speculare non sovrapponibile a sé
stessa come avviene, appunto, nel caso di una mano. Un oggetto
con questa proprietà è detto chirale.
Molecole che non contengono piani di simmetria sono chirali.
Un mezzo chirale si dice otticamente attivo
perché ha la proprietà di ruotare il piano della
luce polarizzata linearmente che lo attraversa.
La prima osservazione risale al 1811, quando
François Arago trovò che il quarzo ha questa
proprietà nella direzione dell’asse ottico.
La Chiralità.
Convenzionalmente il potere rotatorio di un mezzo
è riportato in gradi/decimetro e si indica con il
simbolo
. Il potere rotatorio specifico, o più
comunemente rotazione specifica, è definito come
Dove r è la densità del materiale otticamente
attivo in grammi/cm3, pertanto le unità di misura
della rotazione specifica sono
gradi/dm(gr/cm3)-1
Un mezzo chirale presenta anche il fenomeno del dicroismo circolare
scoperto nel 1896 da Aimé Auguste Cotton.
In the absorption bands of chiral molecules,
he discovered large values of optical rotatory
dispersion (ORD), or variation of optical
rotation as a function of wavelength (Cotton
effect), as well as circular dichroism or
differences of absorption between left and
right circularly polarized light.
E’ utile ricordare, che se una molecola contiene un atomo
asimmetricamente sostituito non ha piani di simmetria ed è, pertanto,
chirale.
Occorre tenere presente che una molecola può essere chirale anche in
assenza di atomi asimmetricamente sostituiti. In questo caso si parla di
chiralità intrinseca, come nel caso delle a-eliche.
Una a-elica proteica ha due motivi chirali: l’elica stessa e i singoli
amminoacidi che contengono almeno un carbonio asimmetrico (unica
eccezione la glicina).
La Biochimica Terrestre è
Omochirale
Omochiralità è un termine usato per descrivere un gruppo di
molecole che possiedono la stessa chiralità.
Le proteine degli organismi viventi sono formate (quasi)
esclusivamente da L-a-amminoacidi
Gli acidi nucleici contengono solo gli isomeri D del ribosio
o del deossiribosio
Cahn–Ingold–Prelog
The CIP system
or CIP conventions
Per gli zuccheri ed altre molecole di interesse biochimico non si fa uso
dei prefissi (R) ed (S). Si assegnano i prefissi D ed L a seconda che i
sostituenti legati all'atomo di carbonio asimmetrico più distante da
quello che lega il gruppo carbonilico abbiano disposizione simile a
quella della L-gliceraldeide o a quella della D-gliceraldeide.
Come e quando le bio-macromolecole sono apparse sulla terra?
Miller and Urey experiment
The common 20 amino acids were formed, in various concentrations,
both left-handed (L) and right-handed (D) optical isomers were
created in a racemic mixture.
Come e quando l’omochiralità della biochimica terrestre abbia avuto
inizio è ancora un problema irrisolto. Molte controverse ipotesi sono
ancora sul tappeto, nessuna delle quali ha avuto conferma
sperimentale.
Origine extraterrestre: scoperta di uno sbilancio
enantiomerico nel meteorite di Murchison,
Australia 1969.
Violazione della parità: la forza nucleare debole distingue destra e
sinistra, gli enantiomeri di una molecola chirale non hanno
esattamente la stessa energia, c’è una piccolissima differenza.
Origine terrestre: catalisi asimmetrica dovuta a minerali particolari
quali zeoliti.
Tuttavia, sembra ci sia la fondamentale, anche se non completamente
verificata, ipotesi che la vita, così come la conosciamo, non sarebbe
mai apparsa senza la scelta omochirale.
Generalmente
gli
L-amminoacidi
formano
eliche
destrogire.
Similarmente, i b-sheets non sono completamente piani ma, se fatti di
L-amminoacidi, mostrano un leggero twist destrogiro.
Una catena di D-amminoacidi produce eliche e fogli levogiri.
Ad esempio, la struttura del peptide b-amyloid ottenuto con i Denantiomeri dei 42 residui amminoacidi che lo compongono è
esattamente opposto a quello del peptide “naturale”
[Cribbs et al. J Biol Chem 1997, 272, 7431].
In alcuni casi è stato provato che la conformazione speculare
comporta una funzionalità stereospecifica, come nel caso dell’enzima
HIV-1 protease
Gli enantiomeri dell’enzima esibiscono una specificità chirale reciproca:
L-enzima agisce solo su L-substrati, il D-enzima solo su D-substrati.
[Milton et al. Science 1992, 256, 1445.]
menta
cumino
Limonene
Forte odore di
arance o limoni
Odore di
trementina o
acquaragia
La talidomide è un farmaco che fu
O
venduto negli anni ‘50 e ‘60 come
sedativo, anti-nausea e ipnotico,
N
rivolto in particolar modo alle
donne in gravidanza. Venne ritirato
dal commercio alla fine del 1961.
O
H
Prodotto in forma di racemo, fu
N
ritirato dal commercio in seguito O
O
alla scoperta della teratogenicità
(generazione di mostri) dovuta ad
uno dei suoi enantiomeri, resa
tristemente evidente dalla nascita
di
migliaia
di
bambini
che
presentavano amelia (assenza degli
(R)
arti) o vari gradi di focomelia
teratogeno
(riduzione delle ossa lunghe degli
arti).
O
N
H
O
O
N
(S)
sedativo
O
prova
prova
Luce polarizzata linearmente si ottiene facendo passare luce ordinaria
attraverso un cristallo particolare (ad esempio un prisma di calcite,
CaCO3) detto prisma di Nicol
Il materiale deve essere birifrangente
Il cristallo deve essere tagliato in modo tale da riflettere totalmente
uno dei due raggi.
Luce polarizzata circolarmente può essere ottenuta sovrapponendo
due raggi di luce polarizzati linearmente che hanno una differenza di
fase pari a l/2.
Spettroscopie di assorbimento chirottiche
1) Se gli indici di rifrazione della luce polarizzata circolarmente destra
e sinistra sono diversi (velocità di propagazione nel mezzo chirale
diverse) si ha rotazione del piano di polarizzazione della luce
polarizzata linearmente. Il fenomeno dipende dalla lunghezza
d’onda. Registrando la rotazione ottica variando la lunghezza
d’onda della radiazione si ha la spettroscopia ORD (Optical Rotatory
Dispersion).
2) La differenza di assorbimento tra luce polarizzata circolarmente
destra e sinistra definisce il dicroismo circolare del mezzo. Il
fenomeno è nullo in assenza di assorbimento ed è massimo in
corrispondenza dei massimi di assorbimento. Lo spettro di
dicroismo circolare che si ottiene nella regione UV-Vis è altrimenti
noto come ECD (Electronic Circular Dichroism).
3) Se la differenza di assorbimento avviene nell’IR si ottengono spettri
di dicroismo circolare vibrazionale (VCD).
ORD
ECD/VCD
Equazione usata per combinare le curve
Dove
ac=% di elica; bc=% di beta; d=% di random
Vedi dati reali
Spettroscopia di Fluorescenza
