Le interazioni delle radiazioni elettromagnetiche con la materia
offrono
l’opportunità di indagare in vario modo sulla natura e sulle
caratteristiche
di un campione e anche di effettuare analisi di tipo quantitativo.
Le tecniche ottiche ed i metodi di analisi che da esse derivano si
basano
su queste interazioni e sui fenomeni coinvolti.
La radiazione elettromagnetica è una forma di energia che si propaga.
È un’onda elettromagnetica caratterizzata dai seguenti parametri:
- lunghezza d’onda (λ), cioè la distanza fra due punti successivi in fase tra loro (ad es. fra
due massimi o due minimi)
- frequenza (ν), cioè il numero di oscillazioni al secondo, ovvero il numero di onde che transitano
per un punto in un secondo
- ampiezza (A) cioè il massimo spostamento di un punto rispetto alla posizione di equilibrio
- intensità (I) cioè l’energia che l’onda trasporta in 1 secondo attraverso una superficie di
area unitaria perpendicolare alla direzione di propagazione.
A ogni radiazione elettromagnetica è associata una energia:
l=c/n
E = hn =hc / l
L’insieme di tutte le radiazioni elettromagnetiche costituisce lo spettro elettromagnetico.
Radiazioni percepite
dall’occhio
Negli atomi: i livelli energetici atomici sono discreti e le transizioni elettroniche
permesse a seguito dell’assorbimento di luce sono caratteristiche di ogni
elemento
5s
E
n
e
r
g
i
a
4s
3s
2s
1s
5p
4d
4p
3p
2p
3d
Nelle molecole: anche gli orbitali molecolari che descrivono le molecole sono quantizzati. A
seguito dell’assorbimento di radiazione elettromagnetica si ha transizione elettronica da un
orbitale molecolare occupato ad uno vuoto a più alta energia
Non tutti gli orbitali atomici possono per energia o per simmetria
partecipare alla formazione di orbitali molecolari: questi rimangono
imperturbati dal legame e sono detti di NON LEGAME (n). Essi
contengono coppie isolate di elettroni
s*
e
n
e
r
g
i
a
p*
n
p
s
Una molecola ha una sua energia interna che è la somma di
contributi diversi:
Emolecola = Enucleo + Eelettronica + Evibrazionale + Erotazionale + Etraslazionale
Energia richiesta per le transizioni
Durante l’assorbimento, la cattura dell’energia della radiazione fa aumentare l’energia interna
dell’atomo o della molecola, provocando una serie di fenomeni diversi a seconda della lunghezza
d’onda (e quindi dell’energia) della radiazione:
le radiofrequenze (che sono poco energetiche) sono in grado di interagire
solo con lo spin di alcuni nuclei
le microonde inducono rotazioni nelle molecole
le radiazioni IR amplificano le vibrazioni dei legami in una molecola
le radiazioni UV/visibile riescono ad eccitare gli elettroni di valenza
i raggi X riescono addirittura ad estrarre gli elettroni più vicini al nucleo.
Modello quantomeccanico: una radiazione può essere considerata
con un flusso di fotoni, che sono particelle prive di massa ma dotate di
una specifica energia.
E= hn
Dove E è l’energia, h è la costante di Planck (6.63 x 10-34 Js) e n è la
frequenza.
L’energia di un fotone con lunghezza d’onda di 100 nm è 1,99 x10-18 J
L’energia di un fotone con lunghezza d’onda di 1000 nm è 1,99 x10-19 J
Una molecola interagisce con un fotone
A + hn
A*
Se si considera una mole di fotoni, l’energia associata è:
1,99 x10-18 x NA = 1198 KJ per fotoni di 100 nm
1,99 x10-19 x NA = 119,8 KJ per fotoni di 1000 nm
Questi valori di energia sono dello stesso ordine di grandezza di
quelli richiesti per rompere i legami chimici. Pertanto quando una
molecola assorbe un fotone di luce guadagna una quantità di
energia tutt’altro che trascurabile.
Lo stato eccitato della molecola ha un tempo di vita breve e tende a
tornare allo stato fondamentale perdendo l’energia acquisita sotto
forma o di calore o di radiazione (emissione) o entrambe.
Spettrofotometria UV-visibile
SPETTROFOTOMETRIA UV/VISIBILE
1) 10- 200 nm UV lontano
2) 200-400 nm UV vicino
3) 400-800 nm visibile
Per i composti organici
s*
e
n
e
r
g
i
a
p*
n
p
s
transizioni s-s* (l tra 110-135 nm)
sono tipiche di molecole sature che
contengono solo legami semplici
transizioni p-p* e n-s* (l tra 160-225 nm)
Le transizioni p-p* sono tipiche di composti
insaturi contenenti cioè doppi legami isolati
o coniugati.
transizioni n-p* (da l 285 nm in su)
Le transizioni n-s* e n-p* coinvolgono
eteroatomi con doppietti di non legame
come l’ossigeno in C=O, l’azoto e lo zolfo
Separazione p-p* in molecole con doppi legami coniugati
E
etilene
butadiene
E1
E2
E3
E4
esatriene
octatetraene
ETILENE
BUTADIENE
ESATRIENE
OCTATETRAENE
…e le porfirine?
Spettro di assorbimento di una porfirina
4
3
Abs 2
1
0
300
400
500
Wavelength [nm]
600
700
0.3
IV
0.2
Abs
II
0.1
0
450
III
500
600
Wavelength [nm]
I
700
Banda di Soret (circa a 420 nm) è
transizione p-p*.
Anche le bande nel visibile (responsabili
del colore) sono di questo tipo. Sono 4
nell’anello non coordinato e diventano
solo 2 quando vi è uno ione metallico
coordinato.
La presenza dello ione metallico quindi
non è direttamente responsabile del
colore, ma fa variare il numero e la
posizione delle bande.
Da ciò si ricavano informazioni sullo stato
di ossidazione del metallo (es. Fe(III) e
Fe(II)).
Inoltre sostituenti che aumentano la
delocalizzazione del sistema p
provocano lo spostamento delle bande a
lunghezze d’onda maggiori.
Lo spettro
elettronico
dipende dallo
stato di
ossidazione del
ferro.
Lo spettro
elettronico
dipende
dalla specie
coordinata
all’eme.
Ci sono esempi di complessi con metalli di
transizione (Fe, Cu, Mn, Mo) di macromolecole
biologiche, in particolare coinvolti nei processi di
trasferimento elettronico, che presentano
assorbimento nel vicino UV e nel visibile, anche in
assenza di estesi sistemi delocalizzati
(es. proteine ferro-zolfo, plastocianine e in generale
blu-rame proteine).
Nella colorazione di questi complessi risultano
coinvolti gli elettroni “d” del metallo. Si parla di
transizioni d-d
bande di trasferimento di carica (CT: charge
transfer). Si tratta, in generale, di transizioni in
cui un elettrone che si trovava in un orbitale molecolare
localizzato su una certa parte della molecola o di un
complesso, viene trasferito in un orbitale vuoto
localizzato su una parte diversa della molecola (o
complesso).
Nel caso di complessi di metalli di transizione, si può
avere il trasferimento da un orbitale d del metallo ad un
orbitale molecolare di antilegame dei leganti (MLCT), o
viceversa da un orbitale occupato nei leganti ad un d
vuoto del metallo (LMCT).
Fotosintesi: l’assorbimento della luce solare è garantito dalla presenza di
diversi pigmenti organici.
Clorofilla, che è l’anello tetrapirrolico
contenente Mg2+, è la specie che assorbe
luce (il coefficiente di estinzione molare è
circa 105 M-1 cm-1).
La catena idrofobica lunga lega saldamente la
clorofilla alla membrana del cloroplasto.
Gli altri pigmenti completano l’assorbimento
delle clorofille e consentono di coprire un
intervallo di assorbimento spettrale molto più
ampio.
La rosa dei colori
Quando un raggio
di luce
policromatica
illumina un oggetto
e questo ne
assorbe solo una
parte, la radiazione
trasmessa
raggiunge l’occhio.
A questa è
associata la
sensazione visiva
del colore.
Se un oggetto assorbe tutte le radiazioni
visibili che riceve appare nero,
Invece se un oggetto non assorbe radiazioni
del visibile appare bianco
La sensazione visiva di un determinato colore dipende dalla composizione spettrale
della sorgente luminosa.
Per esempio se un oggetto appare giallo, i casi sono tre:
1) la sorgente emette radiazione monocromatica a 580 nm (che corrisponde al giallo)
e l’oggetto non è in grado di assorbirla per cui la trasmette e quindi appare giallo.
2) la sorgente emette luce bianca (il campo spettrale da 400-800 nm)
e l’oggetto assorbe le radiazioni complementari al giallo
3) la sorgente emette due radiazioni monocromatiche
(per esempio a l=650 nm (rossa) e l=530 nm (verde)) che non vengono assorbite
e quindi raggiungono l’occhio combinandosi: perciò l’oggetto appare giallo.
A seguito dell’assorbimento, l’intensità misurata a valle di un campione
irraggiato può essere minore di quella della radiazione incidente.
Questo concetto sta alla base di tutte le tecniche spettroscopiche
di assorbimento!!!
I0
I0
I0
I<I0
SORGENTI
Le lampade possono emettere nel campo spettrale dell’UV o del visibile.
Devono emettere in modo continuo senza cali di potenza.
Per la regione del visibile si usano lampade a filamento di tungsteno
o lampade tungsteno-alogeno che forniscono energie più elevate
nell’intervallo 300-400 nm.
Per la regione dell’UV si usano lampade a
scarica riempite di gas deuterio (D2): il deuterio viene eccitato dalle scariche
elettriche prodotte da un arco ed emette uno spettro continuo di radiazioni
al di sotto di 400 nm.
MONOCROMATORI
Le lampade emettono radiazioni in tutte le direzioni dello spazio e quindi per ottenere un fascio di luce
sottile e ben focalizzato è necessario un sistema ottico costituito da lenti, specchi e fenditure. Il fascio
viene poi indirizzato sul monocromatore che scompone la radiazione policromatica (per es. la luce
bianca) in bande il più possibile monocromatiche. A seconda del principio fisico su cui si basano, i
monocromatori si dividono in:
-filtri, che assorbono una parte delle componenti spettrali della radiazione proveniente
dalla sorgente e ne trasmettono una gamma più o meno ampia
-prismi o reticoli che diffrangono la luce policromatica separandola nelle diverse
componenti monocromatiche.
CELLE
Le celle o cuvette sono di vario tipo. Normalmente sono a forma di parallelepipedo di
sezione quadrata con cammino ottico di 1 cm.
Per campioni molto diluiti sono disponibili celle da 4 cm e per campioni molto concentrati
ci sono celle con cammino ottico di 1 e 2 mm.
Per la regione UV, la cella deve essere di quarzo, mentre per la regione visibile vanno
bene sia il vetro che la plastica. Le celle di quarzo possono essere usate anche nel visibile.
Ci sono anche microcelle con cammino ottico di 1 cm ma adatte per contenere piccoli
volumi di soluzione.
RIVELATORI
Trasformano l’energia radiante in un segnale elettrico. Ci sono vari tipi di
rivelatore:
Fototubi (si basano sull’effetto fotoelettrico)
Un fototubo è un tubo da un catodo, detto fotocatodo, di grande area, e da un
anodo; gli elettrodi, contenuti in un'ampolla di vetro in cui si è fatto il vuoto
spinto, sono sottoposti ad un'elevata differenza di potenziale. Quando i fotoni
colpiscono il catodo, costituito di materiale fotoemittente, causano la
fuoriuscita di elettroni, i quali, accelerati dal campo elettrico prodotto, si
muovono verso l'anodo, posto a potenziale superiore rispetto al catodo. La
raccolta degli elettroni da parte dell'anodo permette di ottenere una corrente
elettrica in uscita dal fototubo, corrente la quale rispecchia il flusso luminoso
che colpisce il dispositivo; la relazione che lega le due grandezze è
praticamente lineare.
RIVELATORI
Fotomoltiplicatori (si basano sull’effetto fotoelettrico)
Sono una variante dei fototubi ma hanno sensibilità maggiore.
Gli elettroni emessi dal fotocatodo
vengono accelerati da una differenza di potenziale verso una superficie metallica
che espelle altri elettroni che a loro volta vengono accelarati verso
un'altra superficie metallica.
Si ottiene una notevole amplificazione del segnale.
Dopo più passaggi si raccolgono gli elettroni sull'anodo.
Spettrofotometri moderni sono a doppio raggio.
In essi il raggio uscente dal monocromatore viene sdoppiato: i due raggi ottenuti di intensità
I0 (intensità è il numero di fotoni che incidono sul campione nell’unità di tempo) vengono
inviati rispettivamente uno al campione e uno al riferimento posti in due cuvette uguali. Il
raggio emergente dal riferimento avrà intensità
inalterata, dato che non vi è stato assorbimento, mentre il raggio uscente dal campione avrà
una intensità I<I0, in quanto una parte della radiazione incidente è stata assorbita. Le due
intensità I e I0 raggiungono il dispositivo di lettura che ne effettua il rapporto
TRASMITTANZA
ASSORBANZA
T = I/I0
A = -logT= log I0/I
Spettro di Assorbimento
Assorbanza
Metilarancio
(MeO)
1.2
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
0.0
400
450
500
550
600
lunghezza d'onda, nm
650
700
750 nm
LEGGE DI LAMBERT BEER
AaC
A = el * l * C
A=log I0/I
4.0
3.5
C= 8 x10-5 M
3.0
A
2.5
2.0
C = 4 x 10-5 M
1.5
chopper
1.0
C=2x
0.5
0.0
350
10-5
450
500
550
600
lunghezza d'onda, nm
I
M
C = 1 x 10-5 M
400
Campione
650
Bianco
700
I0
A = el * l * C
A è adimensionale
l è in cm
C è molare
A=log I0/I
el è M-1cm-1
La legge di Lambert-Beer è valida per radiazioni
monocromatiche e soluzioni diluite
È valida solo per soluzioni diluite (< 10-2 M)
All'aumentare della concentrazione aumenta il numero di particelle in soluzione ed
aumenta anche il numero di urti fra queste; le forze interioniche e/o
intermolecolari aumentano e possono formarsi molecole o aggregati di particelle
più complesse, diverse per struttura da quelle in esame, per cui si potrà avere uno
spostamento del massimo di assorbimento.
e dipende dall’indice di rifrazione del mezzo che, per concentrazioni elevate,
dipende a sua volta dalla concentrazione.
Limiti strumentali
Radiazione incidente non
perfettamente monocromatica
