Metodo di analisi 200

Azioni di innovazione e ricerca a supporto
del Piano Sementiero (PRIS1):
elaborazione di disciplinari per la produzione
di prodotti sementieri no OGM
ASPETTI ANALITICI
Roma, 19 giugno 2007
Rita Zecchinelli
ENSE – Laboratorio Analisi Sementi
Tavazzano (LO)
E.N.S.E.
Laboratorio Analisi Sementi, Tavazzano (LO)
Laboratorio OGM:
verifica presenza di OGM in sementi
convenzionali (mais, soia)
•presenza / assenza
•quantificazione
•identificazione evento GM
•messa a punto di metodologie e protocolli
•test di proficiency (circuito ISTA)
•test di validazione (circuito ENGL/CRL)
E.N.S.E.
Laboratorio Analisi Sementi, Tavazzano (LO)
2001:
ACCREDITAMENTO ISTA
2006:
AMPLIAMENTO A
ANALISI OGM
ANALISI VARIETALI
Azioni di innovazione e ricerca a supporto del Piano Sementiero
(PRIS1)
SCOPO:
definire protocolli di campionamento e
analisi per verificare l’assenza di OGM
nelle sementi.
1° ANNO:
mais
barbabietola
patata
soia
pomodoro
2° ANNO:
Azioni di innovazione e ricerca a supporto del Piano Sementiero
(PRIS1)
CAMPIONAMENTO
PREPARAZIONE DEL CAMPIONE DI ANALISI
ESTRAZIONE DEL DNA
QUANTIFICAZIONE DNA
ANALISI QUALITATIVA, QUANTITATIVA:
RISULTATO
Azioni di innovazione e ricerca a supporto del Piano Sementiero
(PRIS1)
mais
soia
1°
A
N
N
O
DETECTION OGM
Specie largamente studiate a livello internazionale.
Disponibilità di protocolli validati.
Disponibilità di materiali di riferimento.
Import di sementi da Paesi utilizzatori di OGM.
CONTROLLI SU TUTTE LE SEMENTI
IMPIEGATE e PRODOTTE
Azioni di innovazione e ricerca a supporto del Piano Sementiero
(PRIS1)
barbabietola
pomodoro
2°
A
N
N
O
patata
DETECTION OGM
Esperienze limitate.
Scarsa disponibilità di protocolli validati.
Scarsa disponibilità di materiali di riferimento.
Azioni di innovazione e ricerca a supporto del Piano Sementiero
(PRIS1)
patata
2°
A
N
N
O
DETECTION OGM
Esperienze limitate.
Scarsa disponibilità di protocolli validati.
Scarsa disponibilità di materiali di riferimento.
+
Mancanza di metodi standardizzati per il campionamento.
Deperibilità, ingombro.
Azioni di innovazione e ricerca a supporto del Piano Sementiero
(PRIS1)
patata
barbabietola
2°
A
N
N
O
pomodoro
DETECTION OGM
Esperienze limitate.
Scarsa disponibilità di protocolli validati.
Scarsa disponibilità di materiali di riferimento.
Limitato import di sementi da paesi utilizzatori di OGM.
CONTROLLI A SONDAGGIO
Azioni di innovazione e ricerca a supporto del Piano Sementiero
(PRIS1)
CAMPIONAMENTO delle SEMENTI:
i riferimenti
GAZZETTA UFFICIALE
DELLA REPUBBLICA ITALIANA
supplemento ordinario al n. 2 del 4 gennaio 1993
MINISTERO
DELL’AGRICOLTURA E DELLE FORESTE
DECRETO MINISTERIALE 22 dicembre 1992
METODI UFFICIALI DI ANALISI PER LE SEMENTI
in corso di revisione:
sottocommissione per i metodi ufficiali di analisi delle sementi
c/o MiPAF
Azioni di innovazione e ricerca a supporto del Piano Sementiero
(PRIS1)
SEMENTI:
CAMPIONAMENTO
SCOPO:
ottenere un campione di
dimensioni adeguate,
rappresentativo del lotto
- caratteristiche del lotto:
identificazione - omogeneità - dimensioni
- strumenti:
sonde - campionatore automatico
- modalità, in base a:
tipo confezioni
- intensità, in base a:
dimensioni lotto, peso e n° confezioni
- dimensione del campione (3000 semi), in base alla
specie:
mais 1.500 g, soia 800 g, pomodoro 10 g, barbabietola 80 g
(sementi confettate: 3.000 semi)
- numero di aliquote: 5





per il laboratorio (analisi)
per il laboratorio (rianalisi)
per altro laboratorio (revisione)
da conservare
per la ditta
Azioni di innovazione e ricerca a supporto del Piano Sementiero
(PRIS1)
SEMENTI DI MAIS, SOIA, POMODORO, BARBABIETOLA
C
A
M
P
I
O
N
A
M
E
N
T
O
1. Verificare le seguenti condizioni:
a) Il lotto deve essere identificato da un cartellino di certificazione; per lotti non definitivamente
certificati, è possibile effettuare il campionamento solo se si provvede ad effettuare una sigillatura
provvisoria, con attribuzione di un numero di riferimento identificativo;
b) il peso del lotto non deve superare quello massimo ammesso (N.B. ricordare che è consentita una
tolleranza del 5%);
c) il lotto deve essere accessibile in ogni sua parte;
d) il lotto deve risultare omogeneo, almeno per le caratteristiche macroscopiche.
2. Procedere al campionamento, utilizzando lo strumento e le modalità di campionamento indicate
adatte al tipo di confezione e allo stato in cui si trova la semente.
3. Effettuare un numero di campioni elementari almeno pari al minimo stabilito in base al peso
unitario delle confezioni, al numero di confezioni che compongono il lotto o al peso totale del lotto.
4. Miscelare i campioni elementari prelevati per ottenere il campione globale di peso minimo pari a 5
volte il peso minimo del campione di analisi per la specie interessata (mais: 1.500 g, soia: 800 g,
pomodoro: 10 g, barbabietola: 80 g). Nel caso di sementi confettate, calcolare la dimensione del
campione in base alle dimensioni dei confetti e stimare il peso minimo del campione in modo da
garantire il prelievo di 3000 semi; incrementare il valore ottenuto del 10% a scopo di garanzia.
5. Suddividere il campione globale in cinque aliquote, ciascuna in una busta di carta robusta e
completata con le indicazioni relative al lotto campionato (specie, varietà, lotto, categoria, ditta,
data).
6. Compilare un verbale che descriva l’intervento effettuato.
7. Consegnare un’aliquota e una copia del verbale al rappresentante della ditta presso la quale si
effettua il campionamento.
8. Confezionare adeguatamente i campioni, unendo copia dei verbali.
9. Inviare i campioni al laboratorio di destinazione, evitando in ogni caso di lasciare il pacco
incustodito o di delegare la spedizione ad altri.
10. Effettuare l’invio prontamente, con il mezzo più rapido.
P
R
O
T
O
C
O
L
L
O
Azioni di innovazione e ricerca a supporto del Piano Sementiero
(PRIS1)
PATATA: CAMPIONAMENTO IN CAMPO
- il campionamento in campo è preferibile perché consente di ottenere migliore
rappresentatività;
- il momento ottimale è 10 giorni dopo la distruzione dei cespi;
- la dimensione del campione viene stabilita in base alla superficie della coltura
(minimo: 400 tuberi);
- la raccolta del campione viene realizzata dall’intero appezzamento, in modo
rappresentativo;
- viene prelevata una singola aliquota, ma è necessario garantire la possibilità di un
ricampionamento.
Azioni di innovazione e ricerca a supporto del Piano Sementiero
(PRIS1)
TUBERI-SEME DI PATATA
C
A
M
P
I
O
N
A
M
E
N
T
O
1. Eseguire il prelievo in campo, almeno 10 giorni dopo la distruzione dei cespi.
2. Per appezzamenti di dimensioni sino a 4 ha: prelevare un numero di tuberi almeno pari a 400.
3. Per appezzamenti di dimensioni superiori a 4 ha e sino a 9,9 ha: prelevare un numero di tuberi
almeno pari a 550.
4. Per appezzamenti di dimensioni pari a 10 ha o superiori: 110 tuberi in più ogni 5 ha.
5. Suddividere idealmente la superficie da campionare con un reticolo di dimensioni opportune, in
modo da avere un numero di celle pari al numero di prelievi elementari.
6. Prelevare un tubero da ogni cella.
7. Scegliere tuberi di medio calibro.
8. Compilare un verbale che descriva l’intervento effettuato e che riporti tutte le informazioni
relative alla partita e al coltivatore.
9. Acquisire una dichiarazione relativa alla destinazione della merce, al fine di consentire un
eventuale ricampionamento.
10. Confezionare adeguatamente i campioni, unendo copia dei verbali.
11. Inviare i campioni al laboratorio di destinazione, evitando in ogni caso di lasciare il pacco
incustodito o di delegare la spedizione ad altri.
12. Effettuare l’invio prontamente, con il mezzo più rapido.
P
R
O
T
O
C
O
L
L
O
Azioni di innovazione e ricerca a supporto del Piano Sementiero
(PRIS1)
PREPARAZIONE DEL CAMPIONE
DI ANALISI
Omogeneizzatore sterilmixer
Mulino ZM200 Retsch
SCOPO – caratteristiche del campione di analisi:
- dimensioni adeguate, in base al protocollo di analisi
- farina sufficientemente fine, sufficientemente omogenea
- assenza di “contaminazioni”
Azioni di innovazione e ricerca a supporto del Piano Sementiero
(PRIS1)
PREPARAZIONE DEL CAMPIONE DI ANALISI
PROTOCOLLO
A. Ottenimento campioni/subcampioni di lavoro
∙ Sementi:
- 3.000 semi: unico campione o diversi subcampioni in base al protocollo
- tramite calcolo del peso dei 1.000 semi
∙ Tuberi-seme di patata:
- minimo 400 tuberi: sbucciatura, 1 carotaggio/tubero (~1g)
B. Macinazione
-
in base allo strumento disponibile
procedure di pulizia accurata
sementi confettate: deconfettare e lasciare seccare prima della macinazione
macinato di patata: conservazione del macinato liofilizzato o congelato a -20°C
le “contaminazioni” possono essere evitate se la procedura
di macinazione viene seguita scrupolosamente
Azioni di innovazione e ricerca a supporto del Piano Sementiero
(PRIS1)
ESTRAZIONE DEL DNA
SCOPO:
OTTENERE DNA PURO E DI BUONA QUALITA’ PER LE ANALISI PCR
METODO:
CTAB (cetyltrimethilammonium bromide)
RIFERIMENTO:
“Foodstuffs - detection of genetically modified organism and derived
products - nucleic acides extraction CEN”
Azioni di innovazione e ricerca a supporto del Piano Sementiero
(PRIS1)
ESTRAZIONE DEL DNA
PROTOCOLLO
Tre fasi
- LISI della membrana cellulare con cattura di lipidi e proteine
- ESTRAZIONE con eliminazione di polisaccaridi, proteine, altro
- PRECIPITAZIONE e RISOSPENSIONE del DNA
Azioni di innovazione e ricerca a supporto del Piano Sementiero
(PRIS1)
QUANTIFICAZIONE DEL DNA
SCOPO:
CONOSCERE QUANTITA’ E QUALITA’ DEL DNA ESTRATTO
METODI ALTERNATIVI:
METODO:
SPETTROFOTOMETRICO
DILUIZIONI
CONCENTRAZIONE
OTTIMALE (50 ng/μl)
FLUORIMETRIA
QUANTIFICAZIONE SU GEL
DI AGAROSIO
Azioni di innovazione e ricerca a supporto del Piano Sementiero
(PRIS1)
QUANTIFICAZIONE DEL DNA
PROTOCOLLI
A. Quantificazione del DNA su gel di agarosio
- preparazione del gel di agarosio
- lettura del gel con transilluminatore e stima della concentrazione di
DNA per confronto con campione di riferimento
B. Quantificazione del DNA con spettrofotometro
- calibrazione: lettura della soluzione di riferimento e del “bianco” a λ=
260 nm e a λ= 320 nm
- lettura del campione e del “bianco” a λ= 260 nm e a λ= 320 nm
- calcolo:[assorbanza a 260 nm (OD) - assorbanza a 320 nm
(background)] x fattore di diluizione x fattore di conversione
Azioni di innovazione e ricerca a supporto del Piano Sementiero
(PRIS1)
ANALISI QUALITATIVA E QUANTITATIVA
SCOPO:
EVIDENZIARE, QUANTIFICARE L’EVENTUALE PRESENZA DI OGM IN
SEMENTI CONVENZIONALI.
SCOPO COMPLEMENTARE:
IDENTIFICARE L’EVENTO OGM PRESENTE.
ANALISI SU SEMENTI
- matrice unica e nota
- campioni di grandi dimensioni
- presenza di OGM limitata
- omogeneizzazione necessaria
Azioni di innovazione e ricerca a supporto del Piano Sementiero
(PRIS1)
ANALISI QUALITATIVA E QUANTITATIVA
Approccio privilegiato:
analisi del DNA
PCR - REAZIONE A CATENA DELLA POLIMERASI
Azioni di innovazione e ricerca a supporto del Piano Sementiero
(PRIS1)
PCR
tramite amplificazione specifica, genera
milioni di copie identiche di una singola
sequenza di DNA
Denaturazione
Annealing
Extension
Azioni di innovazione e ricerca a supporto del Piano Sementiero
(PRIS1)
ANALISI QUALITATIVA
Risultato:
elettroforesi su gel di agarosio
confronto con standard
Azioni di innovazione e ricerca a supporto del Piano Sementiero
(PRIS1)
ANALISI QUANTITATIVA
Sonda TaqMan
Azioni di innovazione e ricerca a supporto del Piano Sementiero
(PRIS1)
ANALISI QUANTITATIVA
Azioni di innovazione e ricerca a supporto del Piano Sementiero
(PRIS1)
LA CASSETTA OGM
35S
“Gene funzionale”
DNA della
pianta
Promotore
NOS
DNA della
pianta
Gene di interesse
Terminatore
Azioni di innovazione e ricerca a supporto del Piano Sementiero
(PRIS1)
EVENTI AUTORIZZATI IN UE PER LA COLTIVAZIONE
SPECIE
EVENTO
GENE D’INTERESSE
STATUS
Mais
MON810
gene cry1Ab (resistenza
insetti: lepidotteri)
Autorizzata
90/220/CEE
Decisione 98/294/CE
Mais
Bt176
gene bar (resistenza
insetti: lepidotteri)
Mais
T25
Colza
NOTIFICANTE
con
VARIETÀ
ISCRITTE
Monsanto
47
ES: 36
FR: 6
DE: 5
Autorizzato 90/220/CEE con
decisione 97/98/CE
Iscritta al registro degli alimenti
Ciba-Geigy
0
gene pat (tolleranza agli
erbicidi)
Autorizzato 90/220/CEE con
decisione 98/293/CE
Iscritta al registro degli alimenti
Agrevo
0
MS1/RF1
Gene bar (tolleranza agli
erbicidi glufosinato)
Autorizzato
90/220/CEE
con
decisione 97/392/CE
Iscritta al registro degli alimenti
Bayer
Cropscience
0
Colza
MS1/RF2
Gene bar (tolleranza agli
erbicidi glufosinato)
Autorizzato
90/220/CEE
con
decisione 97/393/CE
Iscritta al registro degli alimenti
Agrevo
0
Tabacco
ITB 1000 OX
Gene bxn (tolleranza agli
erbicidi)
Autorizzato 90/220/CEE con
decisione 94/385/CE
Iscritta al registro degli alimenti
Seita
0
EVENTI IN CORSO DI AUTORIZZAZIONE PER LA COLTIVAZIONE:
mais 6, soia 1, colza 1
Fonte: http://www.consigliodirittigenetici.org/agrobiotech/notifiche_tutto.php
Azioni di innovazione e ricerca a supporto del Piano Sementiero
(PRIS1)
Eventi OGM di pomodoro
Evento
1345-4
p35S
tNOS
Varietà
commerciale
Produttore
Caratteristiche
Paesi
+
+
-
DNA Plant
Tecnology
corporation
Ritardo nella maturazione (riduzione
dell'accumulo di etilene) mediante l'inserimento
del gene troncato ACC sintasi
Canada, Messico, USA
USA
35 1 N
-
-
-
Agritope Inc.
Ritardo nella maturazione (degradazione di un
precursore dell'etilene) mediante l'introduzione
di un gene che codifica per l'enzima Sadenosilmetionina idrolasi.
5345
+
+
-
Monsanto
Company
Resistenza ai lepidotteri mediante l'inserimento
del gene cry1Ac dal Bacillus thuringiensis
subsp. kurstaki.
Canada, USA
-
Monsanto
Company
Ritardo nella maturazione (degradazione di un
precursore dell'etilene) mediante l'introduzione
di un gene che codifica per l'enzima ACC
deaminasi.
USA
Zeneca Seed
Ritardo della degradazione pectinica (riduzione
dell'espressione della poligalatturonasi
endogena) mediante l'inserimento di un gene
(senso o antisenso) troncato che codifica per la
PG.
Canada, Messico, USA
Calgene Inc.
Ritardo della degradazione pectinica (riduzione
dell'espressione della poligalatturonasi
endogena) mediante l'inserimento di un'altra
copia del gene antisenso che codifica per la PG.
Canada, Giappone,
Messico, USA
CGN-89322-3 (8338)
B, Da, F
+
+
-
+
-
Flavr Savr
CGN-89564-2 (FLAVR
SAVR)
+
-
Fonte: www.agbios.com/dbase.php
Azioni di innovazione e ricerca a supporto del Piano Sementiero
(PRIS1)
Eventi OGM di
barbabietola da zucchero
Evento
GTSB77
H7-1
T120-7
p35S
+
-
+
tNOS
-
-
-
Varietà
commerciale
Produttore
Caratteristiche
Paese
InVigor™
Novartis Seed
Monsanto
Company
Tollerante al glifosate, mediante l'inserimento di
un gene che codifica per l'enzima EPSPS
isolato dal ceppo CP4 di Agrobacterium
tumefaciens.
Australia, Giappone,
Filippine, Usa
-
Monsanto
Company
Tollerante al glifosate, mediante l'inserimento di
un gene che codifica per l'enzima EPSPS
isolato dal ceppo CP4 di Agrobacterium
tumefaciens.
Campioni standard certificati IRMM disponibili.
Australia, Canada,
Giappone, Corea,
Filippine, Usa
-
Bayer
CropScience
(Aventis
CropScience(A
grEvo))
Tollerante all'erbicida fosfinotricina (PPT)
mediante l'inserimento di un gene, isolato da
fungo Streptomyces viridochromogenes, che
codifica per l'enzima PAT detossificando
l'erbicida.
Canada, Giappone,
USA.
Fonte: www.agbios.com/dbase.php
Azioni di innovazione e ricerca a supporto del Piano Sementiero
(PRIS1)
Fonte: www.agbios.com/dbase.php
E
v
e
n
t
i
O
G
M
d
i
p
a
t
a
t
a
Evento
p35S
tNOS
Varietà
commerciale
Produttore
Caratteristche
Paese
Monsanto
Company
Resistente alla dorifora mediante inserimento
del gene cry3a da Bacillus thuringensis subsp.
tenebrionis
Australia, Canada,
Giappone, Corea,
Filippine, Usa
Monsanto
Company
Resistente alla dorifora mediante inserimento
del gene cry3a da Bacillus thuringensis subsp.
tenebrionis
Canada, Giappone,
Corea, Filippine,
Messico, Usa
Monsanto
Company
Resistente alla dorifora mediante inserimento
del gene cry3a da Bacillus thuringensis subsp.
tenebrionis. Resistente a PVY (virus Y della
patata) mediante inserzione del DNA
codificante la proteina del capsidio
Australia, Canada,
Giappone, Corea,
Filippine, Usa
Russet Burbank
NewLeaf® Plus
Monsanto
Company
Resistente alla dorifora mediante inserimento
del gene cry3a da Bacillus thuringensis.
Resistente a PLRV (RNA virus
dell'accartocciamento fogliare della patata)
mediante inserzione del DNA codificante la
replicasi virale
Australia, Canada,
Giappone, Corea,
Filippine, Messico,
Usa
-
BASF
Amylogene
Contenuto di amilopectina superiore al 98%,
mediante l'introduzione del gene antisenso
gbss che inibisce la produzione di amilosio.
Campioni standard certificati IRMM disponibili.
UK
(Codice BPS-25271-9,
12/0705)
ATBT04-6,
ATBT04-27,
ATBT04-30,
ATBT04-31,
ATBT04-36,
SPBT02-5,
SPBT02-7
+
+
Atlantic and
Superior
NewLeaf®
BT6, BT10,
BT12, BT16,
BT17, BT18,
BT23
+
+
Russet Burbank
NewLeaf®
RBMT15-101,
SEMT15-02,
SEMT15-15
RBMT21-129,
RBMT21-350,
RBMT22-082
EH92-527-1
-
-
-
+
+
+
NewLeaf® Y
Azioni di innovazione e ricerca a supporto del Piano Sementiero
(PRIS1)
Mais, soia:
PCR REAL TIME
IL PROTOCOLLO MESSO A PUNTO:
- è mirato a verifiche su grandi numeri
- può richiedere modifiche, in base alle strumentazioni disponibili
- prevede uno screening con ricerca di p35S e tNOS
- include 2 sub-campioni per ogni campione (estrazioni indipendenti)
- include 3 repliche per ogni estratto
- può essere completato con l’identificazione degli eventi OGM presenti nei
campioni positivi
- prevede procedure che diminuiscono i rischi di errore
- include uno schema dei possibili errori e delle azioni correttive necessarie
- prevede analisi “multiplex”
- prevede il “protocollo termico” e fornisce indicazioni sul “protocollo di piastra”
- prevede l’utilizzo di campioni standard di riferimento certificati per la
costruzione di una curva di calibrazione con 5 punti
- considera il gene endogeno di riferimento
- prevede parametri per verificare l’esito della PCR (R2, slope)
- prevede parametri per la verifica dell’attendibilità del risultato (CV su 6 repl.)
Azioni di innovazione e ricerca a supporto del Piano Sementiero
(PRIS1)
Pomodoro, patata, barbabietola:
PCR QUALITATIVA
IL PROTOCOLLO MESSO A PUNTO:
-è mirato a verifiche per sondaggio
-può richiedere modifiche, in base alle strumentazioni disponibili
-prevede uno screening con ricerca del p35S e/o tNOS
- include i riferimenti ai metodi validati per gli eventi privi di p35S e tNOS (barbabietola
H7-1 e patata EH92-527-1)
- include 2 sub-campioni per ogni campione (estrazioni indipendenti)
- include 2 repliche per ogni estratto
- prevede la verifica dell’amplificabilità del DNA (geni endogeni di riferimento)
- prevede procedure che diminuiscono i rischi di errore
- include uno schema dei possibili errori e delle azioni correttive necessarie
Azioni di innovazione e ricerca a supporto del Piano Sementiero
(PRIS1)
Amplificazione con primer trnLc-trnLd
(cloroplasto)
lane 2-3-4: pomodoro
lane 5-6-7: barbabietola
lane 8: patata
lane 9: mais
lane 10: soia
lane 11: controllo negativo di
amplificazione
lane 1,12: marcatori di peso molecolare
Azioni di innovazione e ricerca a supporto del Piano
Sementiero
(PRIS1)
TOF-TOR in pomodoro
M
tomatina: +
+ NTC M
Azioni di innovazione e ricerca a supporto del Piano Sementiero
(PRIS1)
p35S in pomodoro
M
p35S: neg.
p35S: pos.
-
+
NTC
Azioni di innovazione e ricerca a supporto del Piano Sementiero
(PRIS1)
Staff laboratorio OGM:
D.ssa Elena Perri - responsabile scientifico
D.ssa Maria Losi - ricercatrice
D.ssa Vanna Losi - ricercatrice
D.ssa Daniela Villa – ricercatrice
Dr. Simone Garavelloni – assegno di ricerca
P.A. Carlo Tamagni - tecnico
Grazie!