Elettrodo di riferimento

• METODOLOGIE DI BASE PER LA BIOCHIMICA
E LA BIOTECNOLOGIA
AUTORI: NINFA E BALLOU
CASA EDITRICE : ZANICHELLI
• CHIMICA BIOCHIMICA E BIOLOGIA APPLICATA
AUTORI: STEFANI E TADDEI
CASA EDITRICE: ZANICHELLI
I
Gruppo
esercitazione
II
IV
V
esercitazione esercitazione esercitazione esercitazione
Gruppo 23/10/07
A
(martedì)
6/11/07
Gruppo
B
(giovedì)
8/11/07
25/10/07
III
13/11/07
20/11/07
27/11/07
(Pomeriggio) (Pomeriggio)
15/11/07
22/11/07
29/11/07
Edificio 7 laboratorio BIO/3
Dip.to di Biologia Strutturale e Funzionale
La concentrazione degli ioni H3O+ in soluzione è particolarmente
importante in chimica ed in biologia (funzionalità degli enzimi,
legame e rilascio dell’ossigeno da parte dell’emoglobina,…)
Il carattere neutro, acido o basico di una soluzione è determinato
dal valore di [H3O+]
[H+] in soluzione neutra
[H+] in soluzione acida
[H+] in soluzione basica
= 10-7 M
> 10-7 M
< 10-7 M
Per comodità la concentrazione degli ioni H+ è espressa in scala
logaritmica, introducendo la funzione di pH
pH = -log[H+]
Il pH e/o il pOH indicano l’acidità e/o
l’alcalinità di una soluzione acquosa
Acidità crescente
7
Basicità crescente
pH
0
neutralità
14
pOH
7
0 Basicità crescente
Acidità crescente 14
pH = - log[H3O+]
[H3O+] > 1 · 10-7
pH < 7soluzione acida
[H3O+] < 1 · 10-7
pH > 7soluzione basica
[H3O+] = 1 · 10-7
pH = 7soluzione neutra
La funzione pOH può essere impiegata per esprimere la concentrazione
degli ioni OH-:
pOH = -log[OH-]
Nel caso dell’acqua pura a 25°C:
pH + pOH= 14
ACIDI E BASI
ARRHENIUS
 Si definiscono ACIDI quelle sostanze che in soluzione acquosa liberano ioni H+ e anioni
 Si definiscono BASI quelle sostanze che in soluzione acquosa liberano ioni OH- e cationi
BRONSTED-LOWRY
(scambio chimico tra la sostanza acida o basica ed un’altra sostanza)
 Si definiscono ACIDI quelle sostanze che cedono ioni H+ ad un’altra sostanza
 Si definiscono BASI quelle sostanze che acquisiscono ioni H+ da un’altra sostanza
LEWIS
(considera acide anche sostanze che non possiedono atomi di idrogeno da cedere ed
è particolarmente importante nell’interpretazioni di reazioni che avvengono in solventi
non acquosi)
 Si definiscono ACIDI quelle specie chimiche che accettano una coppia di elettroni
 Si definiscono BASI quelle specie chimiche che cedono una coppia di elettroni
Acidità
Alcune soluzioni acquose di uso comune sono acide:
Succhi Gastrici
Succo di Limone
Aceto
Bibite gassate
Vino
Pomodori
Urina
Latte
pH = 1.0 - 3.0
pH = 2.2 - 2.4
pH = 2.4 - 3.4
pH = 2.5 - 3.5
pH = 3.0 - 3.8
pH = 4.0 - 4.4
pH = 4.8 - 7.0
pH = 6.4 - 7.0
Basicità
Altre soluzioni acquose di uso comune sono basiche:
Saliva Umana
Sangue Umano
Uova Fresche
Acqua di Mare
Bicarbonato di Sodio (soluzione)
Carbonato di calcio (soluzione)
Detergenti con Ammoniaca
pH = 7.0 - 7.3
pH = 7.3 - 7.5
pH = 7.6 - 8.0
pH = 7.8 - 8.3
pH = 8.4
pH = 9.4
pH = 10.5 – 11.9
pH
L’aggiunta di un acido all’acqua determina un aumento
della concentrazione di ioni H+ ed una diminuzione della
concentrzione di ioni OHHA + H2O → A- + H3O+
L’aggiunta di una base determina un aumento della
concentrazione di ioni OH- ed una diminuzione della
concentrazione di ioni H+
B + H2O → HB+ + OH-
L’acqua pura ha valori di pH compresi
tra 6,5 ed 8,5
Se il pH assume valori non compresi in
questo intervallo si assiste a conseguenze
gravi attribuibili alla capacità corrosiva
dell’acqua, basti pensare alla vita acquatica
pH
Il sistema più semplice per variare il pH è quello
di aggiungere un acido ad una soluzione basica o
viceversa:
NaOH + HCl
IN SOLUZIONE ACQUOSA
H3O+ + OH- + Na+ + Cl- ↔ H2O + Na+ + ClIn seguito alla variazione di pH si ottiene anche
una variazione della concentrazione salina
 Il metodo più semplice ed accurato per misurare
il pH consiste nell’utilizzo di un elettrodo a vetro
 Progettato nel 1919, tale elettrodo è divenuto di
uso comune solo negli anni Trenta, quando
divennero disponibili degli amplificatori
collegabili
 Al giorno d’oggi, l’elettrodo a pH/pHmetro fa
parte dell’equipaggiamento di base di ogni
laboratorio
Il pHmetro misura il voltaggio tra due
elettrodi immersi in una soluzione
Il cuore del sistema è un
elettrodo il cui potenziale
dipende dal pH
1) Un elettrodo indicatore di misura
2) Un elettrodo di riferimento
3) Un registratore e misuratore di potenziale
L’elettrodo di misura è un
elettrodo a vetro sensibile
alla [H+]
L’elettrodo di riferimento
non è sensibile alla variazione
della [H+]
Elettrodi indicatori: elettrodi deputati alla misurazione di un
determinato parametro, ad es. pH.
Tali elettrodi indicatori devono essere accoppiati ad un
elettrodo di riferimento, vale a dire un elettrodo avente
potenziale noto, costante ed indipendente dalla
composizione della soluzione in cui deve essere immerso
L’elettrodo di riferimento è generalmente costituito da
un metallo a contatto con una fase solida formata da
un sale poco solubile del metallo ed immerso in una
soluzione elettrolitica contenente l'anione del sale
poco solubile
Ag
Cl-(aq)
AgCl(s
)
Storicamente, uno dei più importanti elettrodi di riferimento è
stato l’elettrodo ad idrogeno standard (SHE: standard hydrogen
electrode), il quale contiene un elettrodo di materiale inerte
(ad es. platino ricoperto di platino nero) posto in una soluzione
fissa di HCl, la quale fornisce gli ioni H+.
Sull’elettrodo viene gorgogliato idrogeno alla pressione di 105
Pa, ciò che garantisce l’instaurazione del seguente equilibrio:
½H2 ↔ H+ + eSi tratta comunque di un elettrodo molto scomodo da usare
poiché l’idrogeno deve essere presente ad una pressione
costante e non devono essere presenti tracce di ossigeno;
inoltre, il platino nero si contamina rapidamente.
L’elettrodo di riferimento è generalmente costituito da un metallo
a contatto con una fase solida formata da un sale poco solubile del
metallo ed immerso in una soluzione elettrolitica contenente
l'anione del sale poco solubile.
l'elettrodo Ag/AgCl/Cl(Vrif = 0,222 V)
l’elettrodo a calomelano
Hg/Hg2Cl2/Cl(Vrif = 0,268 V)
AgCl + e- = Ag + Cl-
KCl
Setto poroso
Hg2Cl2 + 2e- = 2Hg + 2Cl-
Ogni elettrodo di riferimento deve essere messo in contatto con la soluzione
da esaminare tramite una giunzione liquida.
Tali giunzioni sono generalmente costituite da cloruro di potassio che,
diffondendo lentamente all’esterno dell’elettrodo, fornisce una continuità
elettrica al circuito.
La presenza della giunzione può però dar luogo alla formazione di un
potenziale di giunzione di entità ignota e che non può essere mai
completamente eliminato.
Utilizzando le giunzioni liquide, bisogna assicurarsi che sia la soluzione di
cloruro di potassio a diffondere lentamente all’esterno e non la soluzione da
esaminare a diffondere all’interno.
Sebbene la diffusione verso l’esterno comporti inevitabilmente una certa
contaminazione del campione, di norma questo non è considerato un
problema, a meno che non debbano essere misurati cloruro o potassio → in
tal caso, per evitare la contaminazione, deve essere utilizzato un elettrodo di
riferimento a doppia giunzione.
Diversi sono i tipi di giunzione attraverso la quale diffonde il KCl: ceramiche,
materiale vetrificato, giunzioni fibrose.
Elettrodo a vetro
Elettrodo di
H+ (interno)
Membrana
riferimento ad es. HCl 0.1 M
di vetro
(interno)
Soluzione
in esame
Elettrodo di
riferimento
H+ (esterno) Elettrodo di
ad es. analita riferimento
(esterno)
• All’interno dell’elettrodo a vetro è contenuto un elettrodo di
riferimento argento/argento cloruro (Ag/AgCl/Cl-), circondato da
HCl 0,1 M che agisce da elettrolita (la soluzione di riferimento
HCl 0,1 M è saturata con KCl)
• La membrana di vetro separa la soluzione interna da quella
esterna
• Il circuito è chiuso da un secondo elettrodo di riferimento a
calomelano o ad Ag/AgCl/Cl-, immerso nella stessa soluzione a
pH incognito tramite un ponte salino
La differenza di potenziale misurata è quella tra l’elettrodo di riferimento interno e quello esterno.
L’elettrodo esterno di riferimento può essere una sonda
esterna oppure può essere costruito intorno all’elettrodo
a vetro
In tal caso il secondo elettrodo di riferimento è contenuto
nello stesso corpo dell’elettrodo a vetro
L’elettrodo risultante si dice a combinazione ed è una cella
elettrochimica
La misurazione avviene immergendo nella soluzione il solo
elettrodo a combinazione
N.B.: nel caso dell’elttrodo a combinazione, il livello della soluzione da analizzare deve essere
abbastanza elevato da ricoprire il tappo poroso (giunzione liquida), ma non così tanto da raggiungere
il livello della soluzione per il ponte salino (KCl) che si trova nell’elettrodo esterno poiché è
necessario che il KCl diffonda lentamente nella soluzione.
Il funzionamento dell’elettrodo di misura, generalmente di vetro,
si basa sullo scambio di ioni che si verifica negli strati idratati posti
sulla superficie di vetro dell’elettrodo stesso.
In prima approssimazione, infatti, il potenziale dell’elettrodo a vetro
dipende dalla composizione della membrana stessa dell’elettrodo (una
rete di silicati contenente ioni metallici coordinati ad atomi di ossigeno),
dal suo stato di idratazione e, naturalmente, dalla concentrazione degli
ioni idrogeno nella soluzione interna (nota e costante) e nella soluzione
esterna (incognita).
La composizione del vetro Corning 015, largamente adoperato
per le membrane degli elettrodi a vetro, è pressappoco la seguente:
Na2O
22%
CaO
6%
SiO2
72%
Sono proprio tali ioni metallici
coordinati ad atomi ossigeno a
scambiare gli ioni H+.
Affinchè lo scambio sia possibile, è necessario che le due superfici
della membrana siano idratate. L’idratazione avviene mediante
reazioni di scambio ionico:
H+acq + Na+Gl- = Na+acq + H+GlGl = glass (vetro)
Il funzionamento dell’elettrodo a pH si basa sul fenomeno per cui
alcuni tipi di borosilicati sono permeabili agli ioni H+, ma non ad
altri cationi o anioni.
Il passaggio degli ioni H+ da un lato all’altro della membrana di
vetro determina lo sviluppo di un potenziale elettrico attraverso
la membrana.
pHmetro
L’elettrodo a vetro è
costituito da una
membrana di vetro
molto sottile e leggera
situata all’estremità di
un tubo di vetro grosso
o a volte in resina
epossidica.
Elettrodo a
vetro
Semicella di misura
Elettrodo di riferimento
Poiché l’elettrodo interno di riferimento dà origine ad un potenziale costante, il
potenziale variabile fornito dall’elettrodo a vetro può essere paragonato con il
potenziale standard generato da un elettrodo esterno di riferimento.
In sintesi, l’elettrodo a vetro si comporta come una batteria il cui
voltaggio dipende dall’attività degli ioni H+ presenti nella soluzione
in cui esso si trova immerso.
Qualsiasi tipo di elettrodo di riferimento si utilizzi, il voltaggio che
viene misurato è pari alla differenza tra quello dell’elettrodo di
riferimento e quello dell’elettrodo a vetro.
E0 – 2.303 RT/F
V
log10 [H+]i/[H+]e
[H+]i è fissa e pari a 0.1 M che corrisponde alla
[HCl] all’interno dell’elettrodo di vetro
V
DIFFERENZA DI
POTENZIALE AI
CAPI DELLA CELLA
DI MISURAZIONE
cost - 2.303 RT/F pH
V = cost – 0,0592 pH a 25°C
Il voltaggio generato è direttamente proporzionale al pH
V = cost – 0,0592 pH a 25°C
Tale equazione tiene conto anche di altri potenziali costanti presenti
nel sistema.
Tra di essi vi sono:
Il potenziale asimmetrico che si genera a cavallo della membrana
di vetro anche quando la concentrazione di ioni H+ è uguale da
entrambi i lati → ne consegue che immergendo l’elettrodo a
vetro nella stessa soluzione presente all’interno dell’elettrodo
stesso si misura una differenza di potenziale non nulla
Il potenziale di giunzione che si genera a livello della giunzione
liquida con l’elettrodo di riferimento → tale potenziale si genera
perché gli ioni K+ e Cl- non diffondono esattamente con la stessa
velocità e perciò creano un potenziale di modesta entità nella
regione tra il campione ed il KCl nell’elettrodo di riferimento
Un elettrodo per il pH è adoperato insieme ad un pHmetro
Il pHmetro registra il potenziale dovuto alla concentrazione
degli ioni H+, però viene progettato in modo da utilizzare una
piccola quota della corrente di circuito
Un flusso di corrente troppo elevato provocherebbe delle
variazioni nella concentrazione degli ioni e quindi delle
variazioni di pH → tutto ciò è evitato dalla presenza di una
resistenza molto elevata
pHmetro, elettrodo a vetro ed elettrodo di riferimento a
calomelano sono costruiti in modo che a pH 7 il potenziale
registrato sia nullo
Due elettrodi, all’interno della soluzione, misurano la
differenza di potenziale
L’elettrodo di riferimento è contenuto nell’elettrodo
indicatore (di vetro)
L’elettrodo indicatore contiene una soluzione di HCl
0,1 M che costituisce [H+]I fissa
L’elettrodo indicatore misura il potenziale sviluppato,
il quale è direttamente proporzionale al pH esterno
all’elettrodo
Lo strumento traduce la differenza di potenziale
in un valore di pH
 E’ importante che la superficie esterna di vetro dell’elettrodo
rimanga idratata
 Per tale motivo l’elettrodo è di norma lasciato immerso in
una soluzione
 La sottile membrana di vetro è molto fragile e quindi bisogna
aver cura di non romperla né graffiarla, e nemmeno di
causarvi un accumulo di elettricità statica per strofinamento
 Molti elettrodi a pH di recente costruzione possiedono una
protezione di plastica per evitare questi problemi
 Dopo aver utilizzato l’elettrodo con soluzioni proteiche o
gelatinose, è necessario lavare con cura la membrana perché
un eventuale deposito di queste sostanze diminuirebbe
l’efficacia della misura
V = cost – 2.303 RT/F pH
 La variazione di una unità di pH provoca una variazione del
potenziale di 54.2 mV a 0ºC e di 61.5 mV a 37ºC → si tratta
di un effetto completamente prevedibile e che quindi può
essere facilmente compensato
 Più ci si allontana da pH 7 (il punto isopotenziale, dove la
temperatura non provoca alcun effetto sul potenziale) e
maggiore sarà la compensazione che si deve apportare a
causa dell’accumulo di errori
 Il dispositivo per la compensazione della temperatura del
pHmetro deve essere perciò accuratamente calibrato prima
della taratura dello strumento
 La taratura richiede l’utilizzo di due soluzioni a pH diverso
 Di norma si effettua prima la taratura con un tampone a
pH 7 e poi con uno a pH 4 (se il campione si presuppone
acido) oppure a pH 9 (se ci si aspetta un campione basico)
 Dopo la taratura, l’elettrodo a pH è semplicemente
immerso nella soluzione in esame e fornirà una misura
rapida ed accurata del pH
Alcuni acidi e basi deboli di natura
organica hanno la proprietà di
avere un colore diverso quando
sono in forma dissociata rispetto a
quando sono in forma indissociata.
Tali sostanze sono dette indicatori.
HA + H2O ⇄ A- + H3O+
giallo
rosso


[ A ] [ H 3O ]
Ka 
[HA ]

[H 3O ] [HA ]


Ka
[A ]
[H 3O  ] [HA ] giallo



Ka
[A ] rosso
Quando [H3O+] >> Ka la soluzione appare gialla
Quando [H3O+] << Ka la soluzione appare rossa
Quando [H3O+]  Ka la soluzione appare arancione
pKa = - log10 Ka
pH
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
La conoscenza del pKa dell’indicatore consente di avere un
riferimento sull’intervallo di pH in cui avviene il
cambiamento di colore (viraggio) e di conseguenza una
stima approssimativa del pH della soluzione
Uno degli indicatori più noti è il tornasole, rosso a pH acido
e blu a pH basico
L’impiego di stick impregnati con vari indicatori che hanno
pKa differenti consente una stima abbastanza accurata del
valore del pH della soluzione in cui essi sono immersi
Esempi:
pKa
fenolftaleina
pKa
blu di
bromotimolo
pKa
metil arancio
pKa
rosso fenolo
pH
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
Metilarancio
Blu di bromotimolo
Fenolftaleina
Il mantenimento di valori costanti di pH è un requisito
fondamentale per i liquidi presenti nel nostro organismo.
D’altra parte, è noto che l’aggiunta di modeste quantità di
acidi o basi forti a normali soluzioni acquose provoca grandi
variazioni di pH.
Com’è possibile conciliare questi due fatti?
Una soluzione tampone è una soluzione il cui pH non è
apprezzabilmente modificato dall’aggiunta di modiche
quantità di acidi o basi forti.
Una soluzione tampone è tipicamente formata da un acido debole
(o da una base debole) in presenza della propria base coniugata
(o del proprio acido coniugato).
Secondo la teoria di Bronsted e Lowry, le soluzioni tampone sono
costituite da una coppia acido-base coniugata.
Si consideri l’esempio dell’acido acetico e della sua base coniugata,
lo ione acetato presente in un sale come l’acetato di sodio.
ACIDO
CH3COOH + H2O
BASE
CONIUGATA
CH3COO- + H2O
H3O+ + CH3COOOH- + CH3COOH
Cosa succede se si aggiunge una modica quantità di HCl alla
soluzione?
CH3COO- + HCl
Cl- + CH3COOH
Lo ione acetato “tampona” la forza acida di HCl,
impedendo che si liberino ioni H+ in soluzione.
E se si aggiunge una modica quantità di NaOH alla soluzione?
CH3COOH + OH-
H2O + CH3COO-
Lo ione idrossido prodotto dalla dissoluzione di
NaOH è “tamponato” dall’acido acetico.
 In entrambi i casi, non si ha liberazione di ioni H+ o OH- in
grado di alterare sensibilmente il pH, ma vengono modificate
le proporzioni tra l’acido debole e la sua base coniugata
presenti nella soluzione tampone e ciò impedisce una variazione
significativa del pH della soluzione
 Ad ogni modo la variazione di pH non è proporzionale alla
quantità di ioni H+ ed OH- inseriti nella soluzione
 E’ evidente che, affinchè le specie tamponanti possano esercitare
la propria funzione, la loro concentrazione deve essere superiore
a quella dell’acido o della base forte aggiunta
E’ possibile calcolare il pH di una soluzione tampone? Sì, ma
per far ciò è necessario rielaborare l’espressione della costante
di dissociazione acida.
+
L’equazione di Henderson-Hasselbalch consente di determinare
il pH di una soluzione tampone conoscendo le concentrazioni
dell’acido debole e della sua base coniugata, e la costante di
dissociazione acida (e quindi il pKa) dell’acido stesso.
Consideriamo il caso in cui in una soluzione tampone l’acido debole
ed il suo sale sono presenti alla stessa concentrazione → l’equazione
di Henderson-Hasselbalch diventa:
pH = pKa – log1 = pKa – 0 = pKa
In queste condizioni il pH della soluzione è uguale al pKa dell’acido
debole.
Il pKa di un acido è il valore di pH al quale l’acido è dissociato al 50%.
Il pKb di una base è il valore di pH al quale la base è dissociata al 50%.
H3O+ + CH3COO-
CH3COOH + H2O
A bassi valori di pH (per es. pH 3.7) la forma dominante nell’equilibrio
chimico è l’acido acetico, mentre ad alti valori di pH (per es. pH 5.7) la
forma dominante è quello dello ione acetato.
Quando il pH = pKa, l’acido acetico (CH3COOH) è dissociato al 50%.
[CH3COOH]=[CH3COO-]
Ka=[H3O+] [CH3COO-]/[CH3COOH]
pKa = pH
Ad un pH pari al pKa si ha il massimo potere tampone di una soluzione.
Una soluzione in cui un acido debole ed il suo sale sono presenti in
concentrazioni uguali ha il massimo potere tampone, dal momento
che le due specie sono in grado di neutralizzare uguali quantità di
acidi e basi forti.
Una soluzione tampone può svolgere, tuttavia, la propria funzione
anche in condizioni in cui l’acido è presente in concentrazione
maggiore rispetto al sale o viceversa, purchè i rapporti tra le
concentrazioni delle due specie rimangano all’interno di un
intervallo compreso tra 10:1 e 1:10.
pH = pKa – log 10
1
pH = pKa – log 1
10
ovvero
pKa -1 < pH < pKa +1
La scelta di una soluzione tampone dipende sempre dal valore di
pH che deve essere mantenuto costante.
Una soluzione tampone può essere preparata in due modi
diversi:
 Aggiungendo direttamente l'acido (o la base) debole ed il
suo sale
Esempio: acido acetico ed acetato di sodio, oppure
ammoniaca e cloruro di ammonio (Henderson-Hasselbach)
 Aggiungendo l'acido (o la base) debole ed una base (o un
acido) forte
Esempio: acido acetico ed idrossido di sodio, oppure
ammoniaca ed acido cloridrico
Il pH del sangue e dei liquidi extracellulari è mantenuto a valori
prossimi alla neutralità (7,36 - 7,42) grazie a sistemi tampone
fisiologici che svolgono questo ruolo fondamentale.
Una parte della CO2 prodotta dal metabolismo dei vari tessuti
penetra all’interno dei globuli rossi dove, grazie alla catalisi
promossa dall’enzima anidrasi carbonica, reagisce con l’acqua
per produrre acido carbonico:
CO2 + H2O
H2CO3
L’acido carbonico si dissocia poi attraverso la seguente reazione:
H2CO3 + H2O
HCO3- + H3O+
Il tampone fosfato funziona attraverso il seguente equilibrio:
H2PO42- + H2O
H3O+ + HPO4-
Sebbene i fosfati non siano quantitativamente rappresentati nel
sangue come i bicarbonati, il loro valore di pKa (7,2) molto
prossimo al pH fisiologico del sangue gli conferisce un elevato
potere tampone.
Un terzo sistema tampone di notevole rilevanza fisiologica è
centrato sulle proprietà acido-base dell’emoglobina (Hb), la
proteina dei globuli rossi che trasporta l’ossigeno ai tessuti
del nostro organismo.
L’emoglobina è presente in grandi concentrazioni
(mediamente 15 - 16 grammi per litro di sangue) ed esiste in
due forme, una protonata ed una non protonata:
(nH+) + nH2O
Hb + nH3O+
L’equilibrio di dissociazione dell’emoglobina è, in effetti,
utilizzato per tamponare la maggior parte dell’acidità
prodotta dal metabolismo dei tessuti periferici.