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Biotecnologie
Il DNA ricombinante
INGEGNERIA GENETICA O TECNICA DEL DNA
RICOMBINANTE
• Nasce negli Stati Uniti nei primi anni ’70,
grazie agli studi sui microrganismi, in
particolare Escherichia coli.
• La maggior parte dei metodi utilizzati per
studiare e manipolare il DNA utilizza i
batteri, grazie alla scoperta dei Plasmidi e
degli Enzimi di Restrizione, strumenti
chiave della clonazione genica.
INGEGNERIA GENETICA O TECNICA DEL
DNA RICOMBINANTE
E’ una tecnica che viene utilizzata per:
• Per ottenere frammenti specifici di DNA in grandi
quantità;
• Studiare la sequenza di determinati frammenti genici;
• Identificare specifiche sequenze geniche nei cromosomi;
• Studiare le modalità di trasmissione e regolazione
genica;
• Creare piante ed animali transgenici (OGM);
• Diagnosticare e curare malattie genetiche
INGEGNERIA GENETICA O TECNICA DEL
DNA RICOMBINANTE
•
E’ dunque una tecnica che utilizza i batteri in particolare l’
Escherichia
coli
Il DNA di un batterio è raccolto in un unico cromosoma circolare. In alcune
situazioni specifiche, un tratto di DNA può essere scambiato e trasferito come
caratteristica fenotipica da un organismo ad un altro uguale, ricordando il
concetto Mendelliano di trasmissione di un GENE.
Molti batteri, come E. coli, possono essere
dotati anche di un DNA circolare a doppia
elica, molto più piccolo del cromosoma
(~1:1000): il plasmide.
Può essere presente anche in numerose
copie. In condizioni favorevoli opportune,
un plasmide libero entra con facilità in
un batterio e può anche successivamente
uscirvi. I plasmidi sono, dunque, capaci di
spostarsi tra le cellule influendo sulla
variabilità genetica.
Le funzioni del DNA Plasmidico
• Queste molecole sono dotate di un'origine per la
replicazione e sono molto simili a dei cromosomi batterici,
ma sono più piccole e non sono strettamente necessarie
alla vita del batterio.
• I plasmidi portano dei geni in singola copia, che
rappresentano un corredo genetico aggiuntivo per il
batterio che ne possiede, e possono quindi fornirgli delle
caratteristiche specifiche. Dei geni comunemente contenuti
nei plasmidi sono quelli che conferiscono al batterio la
resistenza agli antibiotici.
• I plasmidi possono quindi essere replicati all'interno dal
batterio, e i loro geni espressi, indipendentemente dal
cromosoma principale. Essi vengono trasmessi alle cellule
figlie nella divisione cellulare, conferendo lo stesso
vantaggio a tutte le cellule figlie.
Funzioni dei plasmidi
Tra le caratteristiche funzionali che i plasmidi sono in grado di
conferire, figurano:
･ la produzione o la resistenza agli antibiotici, ai metalli pesanti e ai
raggi UV;
･ l'utilizzo di fonti di carbonio insolite o la fissazione di azoto
inorganico nel suolo;
･ la produzione di proteine in grado di uccidere gli altri batteri
(batteriocine);
･ la virulenza (sono codificate a livello plasmidico x es.: la
neurotossina di Clostridium botulinum; molte batteriocine; le adesine
di patogeni intestinali).
DNA dei Plasmidi
• Tutte queste caratteristiche, unite alla conoscenza
degli enzimi di restrizione in grado di tagliare il
DNA in corrispondenza di sequenze specifiche,
hanno portato i biologi molecolari ad utilizzare i
plasmidi per introdurre nei batteri del DNA a loro
estraneo, al fine di produrre proteine oppure per
amplificare tratti di DNA. Inserendo un gene per
una proteina in un plasmide, ed immettendo il
plasmide in un batterio, posso conferire a tutte le
cellule figlie di quel batterio la capacità di
sintetizzare la proteina, della quale posso quindi
produrre quantità a piacere.
Gli enzimi
• Per «tagliare e incollare» il DNA si
utilizzano particolari enzimi
Infatti gli strumenti per ottenere DNA ricombinante sono:
•enzimi batterici chiamati enzimi di restrizione che
riconoscono brevi sequenze di nucleotidi del DNA e le tagliano
in punti precisi;
•l’enzima DNA-ligasi che incolla le estremità dei filamenti di
DNA catalizzando la formazione di legami covalenti
Enzimi di restrizione
Sono enzimi presenti nei procarioti che difendono il batterio
dal DNA estraneo, ad es., da parte di fagi, tagliandolo in
punti specifici e quindi riducendolo in frammenti più
piccoli, non infettanti.
Enzimi di restrizione
•
•
Gli enzimi riconoscono sequenze specifiche composte da 4 a 8 basi dette
sito o sequenza di riconoscimento;
Gli enzimi di restrizione possono effettuare due tipi di taglio:
netto come l’enzima HpaI
sfalsato come l’enzima EcoRI che taglia in maniera asimmetrica
creando “estremità appiccicose”
Nomenclatura degli enzimi di
restrizione
• Il nome dell’enzima di restrizione ci indica da quale
organismo essi sono stati isolati. Ad esempio l’enzima
EcoRI proviene dal ceppo di Escherichia coli .
• Regole:
E = genere Escherichia (genere a cui appartiene l’organismo)
Co = specie coli (seconda e terza lettera derivano dalle
iniziali della specie)
R = Ceppo RY13
I = prima endonucleasi isolata (numero romano indica
l’ordine di isolamento delle varie endonucleasi dello
stesso organismo)
Endonucleasi di tipo II
• Nelle tecnologie del DNA ricombinante vengono
ampiamente utilizzate endonucleasi di tipo II, nelle quali
la sequenza riconosciuta dall’enzima coincide con quella
effettivamente tagliata.
• Le sequenze di classe II sono sequenze palindromiche
del tipo:
5’.….GGTACC…..3’
3’…..CCATGG…..5’
Il palindromo (dal greco πάλιν "indietro" e δρóμος "corsa", col significato "che corre
all'indietro") è una sequenza di caratteri che, letta a rovescio, rimane identica.
TECNICA DEL DNA RICOMBINANTE
Il procedimento consta di 5 fasi successive:
1.
Isolamento del gene che codifica per la proteina che si vuole ottenere in
gran quantità;
2.
Costruzione di una molecola di DNA RICOMBINANTE:
il DNA da isolare ed un plasmide batterico vengono tagliati dallo stesso
enzima di restrizione; queste due molecole tendono a formare legami ad
idrogeno alle loro estremità che vengono unite dall’enzima DNA-ligasi
(taglio e cucito), si ottiene così un DNA ricombinante;
3.
Introduzione del DNA ricombinante nella cellula ospite: il plasmide, pur
contenendo DNA estraneo, si riproduce più volte duplicando così anche il
DNA associato;
4.
Clonazione del DNA: i batteri così modificati si riproducono: le cellule
sono tutte geneticamente identiche; questo insieme di cellule batteriche è
detto CLONE. Poichè anche il DNA ricombinante, presente nella cellula
originaria, si è riprodotto, si dice che il gene è stato CLONATO;
5.
Recupero della proteina mediante purificazione
TECNICA DEL DNA RICOMBINANTE
Nel clonaggio di un
gene si opera sulle
molecole con un «taglia
e cuci».
TECNICA DEL DNA RICOMBINANTE
E.coli
Cellula umana
Plasmide
DNA
Gene V
Estremità coesive
Plasmide con
DNA ricombinante
Gene V
Batterio
ricombinante
Clone batterico in possesso di molte copie del gene umano
ALCUNI PRODOTTI OTTENUTI
PER LA CURA DELLA SALUTE
•
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ormone della crescita
insulina umana
- TPA (attivatore tissutale del plasminogeno)
Calcitonina ormone importante per la fissazione
del calcio a livello osseo
• fattore VIII della coagulazione per il trattamento
dell’emofilia
• vaccini contro malattie virali (per esempio
epatite B
• interferoni (proteine attive contro i virus)
Applicazioni
Applicazioni
• https://www.scribd.com/doc/73130546/PR
O-E-CONTRO-Biotecnologie
• https://www.scribd.com/doc/73130546/PR
O-E-CONTRO-Biotecnologie