lezione6-2017 (McClintock

Elementi trasponibili nel mais
Barbara McClintock negli anni ’50 scoprì nel mais un fattore genetico che chiamò Ds (Dissociation), che causava
un’elevata tendenza alle rotture cromosomiche; in particolare aveva inizialmente osservato queste rotture sul
cromosoma 9.
L’azione di Ds determinava INSTABILITA’ ed i chicchi delle pannocchie apparivano variegati
Instabilità cromosomica dovuta all’ elemento Ds nel mais
Coppia
di
omologhi
del
cromosoma 9 durante la
mitosi
Nodo
Le cariossidi sono:
C -> Colorate
Sh -> Lisce
Bzz -> Gialle
Wx -> Amidacee
Wx
C
Bz
Locus Ds
Deleto e perso (osservabile citologicamente)
Sh
Fenotipi recessivi
che si manifestano
in presenza di Ds
c sh
bz wx Ds
Wx
Bz
C
Sh
Il tessuto risultante è:
c -> colorless (incolore)
sh -> shrunken (grinzoso)
bz -> bronze (bronzato)
wx -> waxi
(ceroso)
Altre osservazioni di Barbara McClintock
Il manifestarsi dell’instabilità dipendeva dalla presenza di un altro
locus , un gene non associato a Ds che chiamò Ac (Activator).
Il locus Ds, in assenza di Ac, poteva essere mappato in regioni
specifiche del cromosoma (spesso sul cromosoma 9)
Mc Clintock scoprì che invece Ac non poteva essere mappato come era
stato fino ad allora possibile fare con tutti gli altri loci genetici
identificati, perché in linee differenti si presentava in posizioni
differenti.
Scoprì inoltre che anche il locus Ds cambiava posizione, quando era
presente Ac
L’elemento Ac è stato definito dalla McClintock un elemento AUTONOMO,
mentre Ds è stato definito elemento NON AUTONOMO
Fenotipi osservati in cariossidi di mais con
particolari genotipi
C -> Colorato
c -> incolore
F1:
CDs/CDs; Ac+/Ac+
CDs/cDs+; Ac+/Ac
X
cDs+/cDs+; Ac/Ac
completamente pigmentate
CDs/cDs+; Ac/Ac+
con chiazze senza colore
va perso in ALCUNE CELLULE (si manifesta il recessivo)
1 cariosside C*Ds/cDs+; Ac/Ac+
Incolore, instabile
Ac+ e Ds+ indicano ASSENZA dell’elemento
?
Spiegazione dei fenotipi osservati
In questa cariosside c’e il fenotipo pigmentato con alcune chiazze bianche, ciò
significa che in quelle cellule in cui manca la pigmentazione si è avuta una rottura
cromosomica in corrispondenza del locus C (Colored) che quindi permette
l’espressione del recessivo c (senza colore).
Una chiazza piccola indica che la rottura è avvenuta in una fase tardiva dello
sviluppo del chicco della pannochhia, mentre una chiazza più grande indica che la
rottura è avvenuta precocemente.
Nelle prime fasi dello sviluppo di questa pannocchia si è espresso il carattere
recessivo c (senza colore); la presenza di chiazze pigmentate dimostra che il
processo è REVERSIBILE in quanto consente nuovamente l’espressione di C.
Non può quindi trattarsi di una rottura cromosomica che non tornerebbe mai
indietro.
Quello che accade realmente è che l ’ elemento Ds si inserisce nel gene C
disattivandolo senza indurre rottura cromosomica; in seguito Ds si ESCINDE e
RIPRISTINA la funzione di C (anche questo secondo tipo di fenomeno richiede la
presenza dell’elemento Ac.
Mosaicismo nel mais dovuto ad elementi trasponibili
Chiazze grandi
Chiazze piccole
Chiazze intermedie
Possibili conseguenze della presenza degli
elementi Ac e Ds
- Gene 1Allele stabile del gene 1,
inattivato da Ds
Reversione
solo
presenza di Ac
- Gene 2-
Ds
manca Ac
Ds
Ac
in
Ds
Trasposizione nel gene 2
Allele instabile del gene 1,
inattivato da Ac
Reversione e trasposizione
dipendente da Ac
Ac
Ac
Ac
Possibili conseguenze della presenza degli
elementi Ac e Ds
- Gene 1Allele stabile del gene 1,
inattivato da Ds
Reversione
solo
presenza di Ac
- Gene 2-
Ds
manca Ac
Ds
Ac
in
Ds
Trasposizione nel gene 2
Allele instabile del gene 1,
inattivato da Ac
Reversione e trasposizione
dipendente da Ac
Ac
Ac
Ac
Possibili conseguenze della presenza degli
elementi Ac e Ds
- Gene 1Allele stabile del gene 1,
inattivato da Ds
Reversione
solo
presenza di Ac
- Gene 2-
Ds
manca Ac
Ds
Ac
in
Ds
Trasposizione nel gene 2
Allele instabile del gene 1,
inattivato da Ac
Reversione e trasposizione
dipendente da Ac
Ac
Ac
Ac
Conclusioni di Barbara McClintock
Ds determina il suo effetto genetico lì dove è localizzato:
• può determinare ROTTURE CROMOSOMICHE
• può rendere NON FUNZIONALE il gene in cui
si inserisce
• Ds si può anche disinserire e quindi è possibile
che il gene che era stato
inattivato, si RIATTIVI
Anche Ac può determinare gli stessi effetti
Ac e Ds sono ELEMENTI TRASPONIBILI DI CONTROLLO
Barbara McClintock e le sue pannocchie di mais
Barbara McClintock alla conferenza per il Premio Nobel
8 Dicembre 1983
Caratterizzazione molecolare degli elementi Ac e Ds
• Ac e Ds sono loci genetici trasponibili che possono muoversi nel
genoma e presentano alle loro estremità delle sequenze ripetute e
invertite.
• I due elementi sono costituiti da sequenze simili tra loro ma Ds può
avere dimensioni diverse da Ac ma più piccole.
• L’elemento Ac è un elemento completo la cui sequenza compresa tra le
due ripetizioni codifica per un enzima che è necessario per la
trasposizione : la trasposasi.
• L’elemento Ac si muove autonomamente, Ds invece è un locus Ac che
manca di alcune sequenze nella parte centrale dell’elemento e quindi non
produce la trasposasi, ma può muoversi perché le sue “estremità “ (IR)
sono intatte
Quando c’è Ac che produce la trasposasi Ds si muove andando a
interrompere delle sequenze codificanti e determinando
l’inattivazione di un gene.
Struttura degli elementi Ac e Ds
Elemento Ac (Activator)
TRASPOSASI
IR Esone 1 I Esone 2 I
5’
Elementi Ds (Dissociator)
Esone 3
IR Esone 1 I Esone 2 I E3
Ds2d1
IR Esone 1 I E2
Ds2d2
IR Esone 1 I E2
Ds6
IR E 1
I
Esone 5 IR
3’
TRASCRIZIONE
Ds9
E2 I
I E4
E3 I E4
I
Esone 5 IR
I E4
I
Esone 5 IR
I E4
I
Esone 5 IR
I
Esone 5 IR
Esone 3
E3
L’elemento Ds deriva dall’elemento Ac; mostra delezioni nelle sequenze codificanti per la TRASPOSASI ed è
questo il motivo per cui non è AUTONOMO. Se nello stesso genoma è presente Ac che fornisce la
TRASPOSASI, avendo le IR intatte Ds si può muovere
Elementi genetici mobili nei BATTERI
Nel 1970, 3 ricercatori (Saedler, Starlinger e Shapiro)
studiavano particolari mutazioni nell’operone del galattosio
di E.coli : le “mutazioni polari”
3 geni sono coinvolti nel metabolismo del galattosio:
Direzione di trascrizione
P
(promotore)
E
(epimerasi)
T
(transferasi)
G
mRNA policistronico
operone GAL
(galattochinasi)
Alcuni mutanti identificati nell’attività chinasica (ultimo gene)
mappavano in diversi punti nell’operone
SONO STATE DEFINITE “MUTAZIONI POLARI”
Mutazioni non senso in geni “a monte” hanno effetto sui geni “a valle”
Particolarità di queste mutazioni
• revertivano al tipo selvatico e quindi non si trattava di
delezioni, ma le reversioni non erano affatto influenzate
da mutageni chimici!
• non erano mutazioni puntiformi ( né sostituzioni di basi,
né frame-shift)
Di che tipo di mutazioni si trattava?
Alla fine degli anni ‘70 alcuni esperimenti dimostrarono
che si trattava di inserzioni di segmenti di DNA che
furono chiamati IS (sequenze di inserzione)
Le mutazioni polari nel locus gal sono dovute all’inserzione di elementi IS
L’operone del galattosio proveniente sia da batteri gal+ che da batteri gal- è
stato inserito in fago 
Il sito di inserimento del fago è molto vicino all’operone gal
virus gal-
Il DNA del mutante
era più DENSO
Centrifugazione
in gradiente di
densità
densità
virus  gal+
 gal+
 gal-
DNA virale
DNA virale
+ elemento inserito
Ibridazione del DNA dei due fagi, il normale ed il mutato
Fotografia al microscopio elettronico delle due molecole
ibridate di DNA dei fagi  gal+ e  gal -, la stima della
grandezza del frammento è stata di 800 bp
I segmenti di DNA che si inseriscono sono PEZZI casuali o
ENTITA’ GENETICHE distinte?
Dimostrazione che si trattava di ENTITA’ GENETICHE
SPECIFICHE
Le sequenze furono isolate da mutanti polari ed il loro
DNA venne usato per produrre RNA “marcato”
Queste sonde ibridavano con il DNA dell’operone del
galattosio del ceppo di E. coli mutante, ma non con il DNA
dell’operone del galattosio del ceppo del normale
La stessa ibridazione si aveva ibridazione anche con
altri mutanti polari
Questa è la dimostrazione che LO STESSO PEZZO DI
DNA era inserito in punti diversi ed in ceppi con diverse
mutazioni polari-> questi ELEMENTI sono MOBILI e
possono trasporsi in tutto il genoma
Sequenze di inserzione batteriche
La prima sequenza identificata di 800 bp fu chiamata IS1
Ad ogni estremità delle IS c’è una ripetizione invertita (IR) perfetta
Denominazione
dimensioni(bp)
ripetuti/invertiti(bp)
ripetizioni
di sequenza
nel sito di
integrazione
numero di
copie nel
genoma di
E. coli
IS1
768
20/23
9
6-
IS2
1327
32/41
5
4-
IS5
1195
15-16
4
10
IS10
1329
17/22
9
Scoperta dei trasposoni
Nel 1950 in un ospedale giapponese si notò che alcuni ceppi di
Shigella, isolati da pazienti con dissenteria, si dimostrarono
resistenti contemporaneamente a molti ANTIBIOTICI (penicillina,
tetraciclina, sulfanilammide, streptomicina, cloramfenicolo)
Si notò che la resistenza a questi antibiotici era ereditata in un
UNICO BLOCCO GENETICO, e poteva essere trasmessa sia ad
altre Shigelle che ad altre specie batteriche
Il fattore che portava la resistenza è un fattore plasmidico che si
replica AUTONOMAMENTE, molto simile al FATTORE F ed è
stato chiamato “fattore R” , da resistenza.
Il fattore R viene trasferito mediante coniugazione
Se un “fattore R” viene denaturato
e rinaturato lentamente si forma
una struttura particolare chiamata
“ struttura a lecca-lecca”
TRASPOSONE
IS
Questi elementi che hanno geni
per la resistenza agli antibiotici
racchiusi tra due sequenze
invertite ripetute (IR, che di
solito sono delle IS) sono stati
chiamati TRASPOSONI
Geni per la resistenza
ai farmaci
IS
AB C
C’ B‘ A’
A’ B’ C’
CB A
Struttura a
lecca-lecca
C
B
A
C’
B’
A’’
IS
Descrizione di alcuni trasposoni batterici
Trasposone Tn9
2638 bp
resistenza al cloramfenicolo
IS1
IS1
IR
IR
Trasposone Tn10
9300 bp
resistenza alla tetraciclina
IS10
IR
IS10
IR
I trasposoni batterici traspongono come DNA e possono trovarsi all’interno
dei genomi batterici, in siti differenti.
Primo elenco dei trasposoni batterici
Trasposone
Tn1
Tn2
Tn3
Tn4
marcatore
coppie di basi
4957
“
“
20500
Tn5
Tn6
ampicillina
ampicillina
ampicillina
ampicillina,streptomicina
sulfonammide
canamicina
canamicina
Tn7
Tn9
Tn10
Tn204
Tn402
trimetoprim,streptomicina
cloramfenicolo
tetraciclina
cloramfenicolo,acidofusidico
trimetoprim
14000
2638
9300
2457
7500
Tn501
Tn551
Tn554
Tn732
Tn903
Tn917
Tn951
Tn1681
Tn1721
ione mercurio
eritromicina
eritromicina,spectrinomicina
gentanamicina,tobramicina
canamicina
eritromicina
lac
enterotossina termostabile
Tetraciclina
7800
5200
6200
11000
3100
5100
16600
2088
10900
5400
4200
ripetizione invertite
38
“
“
corta
1500 (IS50)
non individuabile
al microscopio elettronico
“
18-23 (IS1)
1400 (IS10)
18-23
non individuabile
al microscopio elettronico
38
35
non determinata
non determinata
1050
corta
corta
768 (IS1)
corta