MUTAZIONI NEI GENI
STRUTTURALI III: il connettivo
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Lezione 6
By NA
Modello murino
ANALISI DI LINKAGE SU DIVERSE FAMIGLIE HANNO PERMESSO DI
IDENTIFICARE DIVERSE MUTAZIONI IN GENI DEL COLLAGENE CHE
SEGREGANO CON IL FENOTIPO OI.
SONO QUINDI QUESTE MUTAZIONI A
CAUSARE LA MALATTIA??
taglio con enzimi di
restrizione e
eliminazione di una
parte della sequenza
topo
transgenico
sostituzione con
un oligonucleotide
sintetico con una
mutazione
By NA
iniezione in un ovocita di topo
fecondato
SE IL TOPO MANIFESTA LA
MALATTIA
ALLORA
LA
MUTAZIONE
E’
LA
CAUSA
DELL’OI.
Perche’ la patologia dominante
E’ POSSIBILE RICONOSCERE MUTAZIONI PIU’ FREQUENTI PER CIASCUN TIPI
DIVERSO DI OI
MUTAZIONE IN UN ALLELE DEL GENE PER LA CATENA a1
Nonostante un solo
allele del gene COL1A1
e’ mutato ben il 75%
delle triple eliche sono
anomale.
a1
a2
DEGRADATE
a1
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La mutazione riguarda il
50%
del
prodotto
genico, ma influenza il
75%
della
proteina..L’EFFETTO E’
DOMINANTE anche in
caso di eterozigosi
Relazione genotipo-fenotipo
GRAZIE A TALI STUDI MOLECOLARI E BIOCHIMICI E’
STATO POSSIBILE IDENTIFICARE MUTAZIONI NEI DIVERSI
GENI DEL COLLAGENE CAUSA DELLE DIVERSE FORME DI OI
Mutazioni
di grosse dimensioni(delezioni o inserzioni multiesoniche) sono
rare perche’ compromettono la stabilita’ di gran parte delle molecole di
collagene. Questo tipo di mutazioni si riscontra spesso in casi di OI di tipo
II nelle forme letali in fase perinatale.
Piu’
frequenti sono le mutazioni puntiformi. Queste sono anche piu’
difficili da trovare viste le dimensioni della molecola del collagene. nei geni
COL1A1 e COL1A2 sono state trovate numerose mutazioni che causano una
sostituzione di una glicina con un altro amminoacido. A seconda del sito di
sostituzione si manifestano diversi fenotipi OI. Questi ultimi sono piu’ gravi
quando la sostituzione si verifica piu’ vicino all’estremita’ carbossi terminale.
By NA
Relazione genotipo-fenotipo
Tutte le sostituzioni Gly-Asp sono risultate letali.
Mutazioni in siti di splicing possono provocare delezioni
di esoni o
splicing anomali con conseguente sintesi di molecole anomale di
collagene.
Le mutazioni nel COL1A1 sono generalmente associate a fenotipi
piu’ gravi rispetto a quelle che colpiscono il gene COL1A2 e i fenotipi
piu’ gravi nel caso di mutazioni vicine all’estremita’ 3’ della tripla
elica.
L’APPROCCIO DI STUDI O DELL’OI E’ STATO QUELLO DELLA GENETICA
DIRETTA IN CUI SI PARTE DA UN PRODOTTO PROTEICO PER ARRIVARE AL
GENE E ALLO STUDIO DELLE MUTAZIONI AD ESSO ASSOCIATO
IN OGNI CASO IL PRIMO PASSO PER LO STUDIO DI
QUALSIASI PATOLOGIA
E’ L’ANALISI DEL FENOTIPO!
By NA
Relazione genotipo-fenotipo riepilogo
TIPO I: e’ causato da mutazioni nel COL1A1, in generale si tratta di mutazioni non senso
(sostituzione di un codone di senso con un codone di stop) o mutazioni di splicing. Queste
provocano una riduzione nella sintesi del collagene, ma le molecole che vengono sintetizzate hanno
una struttura normale.
TIPO II:e’ causato o da mutazioni multiesoniche(nei casi di forme letali) o da mutazioni missenso(
sostituzione di un codone per un AA con uno per un AA diverso) che non comportano mancata
produzione della proteina, ma produzione di catene a1(I)anomale. queste aggregandosi con catene
normali portano alla formazione di triple eliche anomale causando il fenomeno dell’effetto
dominante negativo.
TIPO III: e’ una forma geneticamente eterogenea, si riscontrano mutazioni in geni diversi. A
volte sono presenti anche piu’ mutazioni in geni diversi contemporaneamente. E’ l’unica forma
per la quale e’ stata dimostrata anche trasmissione ditipo autosomico recessiva, frequente solo
in alcune popolazioni come quella sud africana dove, pero’ di riconosce un EFFETTO DEL
FONDATORE(prevalenza di un allele nella popolazione dovuta alla sua presenza in uno dei
membri originari della popolazione stessa ed alla tendenza dei membri della popolazione ad
accoppiarsi tra loro). In questo caso sono piu’ frequenti soggetti omozigoti per mutazioni in geni
COL1A1 e COL1A2.
TIPO IV: pur essendo generalmente lieve, puo’ presentare variazioni notevoli anche nella stessa
famiglia(non e’ noto il perche’ di questa variabilita’). Si trovano frequentemente mutazioni
puntiformi nei geni COL1A1 o COL1A2.
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Altre patologie associate a difetti del
collagene
LA SINDROME DI MARFAN
E
LA SINDROME DI EHLERS-DANLOS
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Sindrome di Marfan (MS)
INDEBOLIMENTO DEL TESSUTO CONNETTIVO.
Elevata statura e magrezza con braccia gambe e dita delle mani e dei piedi
lunghe(aracnodattilia)
Ipersensibilita’ delle articolazioni e dislocazione
A volte dislocazione del cristallino per indebolimento del dei legamenti che lo
sostengono e miopia.
Manifestazioni
vascolari (prolasso della valvola mitriale nel 5% della
popolazione generale e dilatazione del tratto iniziale dell’aorta che puo’ portare a
aneurisma.
Esistono diverse forme di espressione della MS: alcuni soggetti sono
chiaramente affetti dall’infanzia, altri lo sono solo lievemente e
anche il trattamento medico e’ variabile in conseguenza di cio’.
By NA
Il gene della sindrome di Marfan
IL LOCUS MALATTIA E’ STATO MAPPATO SUL CROMOSOMA 15
ANALISI ISTOCHIMICHE
ANALISI GENETICHE
Deficit della proteina
extracellulare
FIBRILLINA nei tessuti
dei soggetti con MS
Analisi di linkage
con marcatori
genetici casuali
La prova definita deriva dalla scoperta di mutazioni nel gene per la
fibrillina in numerosi affetti dalla sindrome
FIBRILLINA: glicoproteina del tessuto connettivo (componente
delle microfibrille). Contiene 44 domini in tandem omologhi ad una
sequenza del fattore di crescita dell’epidermide
FIBRILLINA1: il gene che la codifica
mappa sul chr 15 Responsabile della MS
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FIBRILLINA2: il gene mappa sul
chr5, responsabile dell’aracnodattilia
contratturale congenita
SSCP : Single Strand Conformational Polymorphism
Omozigote Wild-type
Eterozigote
C
G
A
T
C
G
C
G
PCR
Denaturazione
A
T
A
T
A
C
G
C
G
C
G
Reverse
G
OmozigoteMutante
T
A
A
T
1
2
T
3
Reverse
T
A
Caricamento su gel
C
Forward
Omo WT
etero
Omo mut
VARIAZIONI ANCHE DI 1
SOLA BASE PROVOCANO
Forward UNA DIFFERENZA NELLA
CORSA SU GEL
Questo test si utilizza per identificare la variazione di una base senza dover
ricorrere al sequenziamento. Si possono identificare il 70%-95% delle mutazioni
di singola base in frammenti di lunghezza inferiore alle 200pb.
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Identificazione delle mutazioni della fibrillina
SSCP : Single Strand Conformational Polymorphism
Omozigote
Wild-type
PCR
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Eterozigote
SM
N
N
MS
N
Relazione genotipo-fenotipo in MS
Tipo
I: riduzione del 50% nella sintesi
della fibrillina, ma quella presente nella matrice
e’ normale. MUTAZIONI NON SENSO (solo
l’allele wild-type da’ origine alla proteina
normale)
FENOTIPO CLINICO LIEVE
Tipo
II: riduzione della sintesi e
secrezione della proteina. MUTAZIONI
MISSENSO (viene prodotta una certa
quantita’ di proteina anomala che
interagisce
con
la
proteina
normale).DOMINANTE NEGATIVO
Tipo III e IV: normale livello di
sintesi, ma moderata o grave riduzione
della secrezione nella matrice
extracellulare della fibrillina
Tipo V: i livelli di proteina
sintetizzata e secreta sono normali
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FENOTIPO CLINICO PIU’ GRAVE
FENOTIPO CLINICO MEDIO O GRAVE
fenotipo piu’ grave se viene compromesso
l’assemblaggio
NON SI SA QUALE SIA LA CAUSA
DELLA MS
Sindrome di Ehlers-Danlos
Iperplasticita’ della cute.
Esistono diversi tipi
Ipersensibilita’ delle articolazioni
Sono dovuti a mutazioni
Vengono ereditati con modalita’ diverse.
DOMINANTI
Tipo I : piu’ grave
tipo II: piu’ lieve
TIPO IV vascolare :
in locus diversi
interessano principalmente cute e
articolazioni.
sono
state
trovate
mutazioni nel collagene di tipo V
(mutazioni in COL5A1 o COL5A2).
pelle traslucida con vene chiaramente visibili e
facilmente escoriabile. Minima ipersensibilita’
delle articolazioni. Gravi
rischi di rottura di arterie, del colon e utero. Attesa di vita non superiore
ai 50 anni. E’ causata da mutazioni nel gene COL3A1 che codifica per le
catene di tipo III (mancata produzione del collagene di tipo III) di cui
sono particolarmente ricche le pareti arteriose, dell’intestino e utero.
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Sindrome di Ehlers-Danlos
Iperplasticita’ della cute.
Ipersensibilita’ delle articolazioni
RECESSIVE
TIPO VI:cute soffice e iperelasticita’, ipersensibilita’ delle articolazioni
e fragilita’ oculare (distacco della retina). Autosomica recessiva, causata da
mutazioni nel gene per la lisil idrossilasi responsabile delle modifiche post
traduzionali del collagene.
TIPO
VII: dislocazione congenita delle anche e altre articolazioni ed
estrema ipersensibilita’ articolare. Autosomica recessiva causata da
mutazioni nel gene per la Procollagene peptidasi responsabile del
processamento extracellulare del collagene
TIPO IX: RECESSIVA X-LINKED cute lassa, diverticoli e rottura della
vescica e deformita’ scheletriche. Colpisce gravemente i soggetti di sesso
maschile. E’ causata da un difetto del metabolismo del rame. ( L’attivita’
della lisil idrossilasi e’ coadiuvata dal rame)
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Diagnosi e trattamento delle malattie del tessuto
connetivo
UNA
DIAGNOSI ATTENTA PUO’ AIUTARE A COMPRENDERE IL
POSSIBILE DECORSO DELLA MALATTIA E IDENTIFICARE I RISCHI
FUTURI (e’ importante fare attenzione a tutti i piu’ piccoli segni che
possano aiutare a inquadrare correttamente la patologia, capire la storia
della famiglia, come la malattia si trasmette e considerare i fattori che
possono modificare i rischi di trasmissione).
ATTENTA INFORMAZIONE DELLE FAMIGLIE DEI RISCHI DELLA
MALATTIA: spesso il medico deve attenersi alla volonta’ del paziente
nonostante in alcuni casi la diagnosi possa riguardare anche altri membri
della famiglia (come nel caso della MS).
PREVENZIONE DEI FATTORI CHE POSSONO COMPLICARE O
AGGRAVARE LA MALATTIA: evitare attivita’ che potrebbero provocare
fratture o traumi nel caso dell’OI.
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Diagnosi e trattamento delle malattie del tessuto
connetivo
PREVENZIONE DEI FATTORI CHE POSSONO COMPLICARE O
AGGRAVARE LA MALATTIA: evitare attivita’ che potrebbero provocare
fratture o traumi nel caso dell’OI.
USO
DI COMPOSTI CHE MIGLIORINO IL RIASSORBIMENTO
OSSEO DA PARTE NELLE OSTEOCLASTI O INTEGRAZIONE DELLA
DIETA CON CALCIO E VITAMINA C (Cofattore di uno degli enzimi
responsabile della formazione dei legami crociati del collagene)
IL
CONSULENTE GENETICO
NON HA SOLO IL COMPITO DI
CALCOLARE I RISCHI O DISCUTERE UNA DIAGNOSI PRENATALE ,
MA
COMINCIA
DALLA
DIAGNOSI
PER
POI
COMPRENDERE
L’INFORMAZIONE SULLA STORIA NATURALE DELLA PATOLOGIA E
SULLE POSSIBILITA’ DI AZIONE SU ESSA. LA SUA ATTIVITA’
COADIUVA QUELLA DEL MEDICO PER UN CORRETTO TRATTAMENTO.
By NA
