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Replicazione plasmidica La caratteristica più importante dei plasmidi, quella di essere dei “repliconi”, cioè molecole capaci di replicazione autonoma, è conferita loro dalla presenza di una origine di replicazione, chiamata ori (nel caso dei plasmidi oriV, per “ori vector”) I plasmidi si replicano per replicazione (uni o bi-direzionale) o per circolo rotante Richiedono proteine plasmidiche e/o dell’ospite batterico Funzioni dell’origine di replicazione Oltre ad essere essenziale per la replicazione, l’origine di replicazione controlla: • Il numero di copie • La specificità d’ospite • I gruppi di incompatibilità Numero di copie e modalità di replicazione I plasmidi si replicano con due modalità diverse. Alcuni, generalmente quelli di grandi dimensioni, si replicano in maniera coordinata con la replicazione del cromosoma batterico e si di dicono sottoposti a controllo stringente. In genere sono presenti in una o poche copie per batterio. Altri, in genere di piccole dimensioni, si replicano in maniera indipendente dalla replicazione batterica e si dicono sottoposti a controllo rilassato. Sono presenti in molte copie - fino a 1000 - per batterio. Plasmidi ori numero di copie pBR322 e derivati PMB1 15-20 pUC e derivati ColE1 500-700 pACYC e derivati p15A 10-12 pSC101 e derivati pSC10 1 -5 Controllo del numero di copie I plasmidi possono controllare il numero di copie regolando l’inizio della replicazione plasmidica L’inizio della replicazione può essere controllata regolando: • La disponibilità del primer necessario a innescare la replicazione del DNA plasmidico • La disponibilità di proteine essenziali alla replicazione • La funzionalità di proteine essenziali alla replicazione Rnasi H RNA II ori rop RNA I La replicazione plasmidica inizia dalla ori ed è innescata da un primer a RNA (RNA II), trascritto da un promotore situato 550 bp a monte della ori. Gli ibridi DNA:RNA formati dal filamento di DNA e dall’RNA II nascente, costituiscono un substrato per la Rnasi H che taglia l’ibrido e fornisce l’OH al 3' per la replicazione del DNA. La maturazione dell’RNA II è controllata dall’RNA I, trascritto sul filamento opposto della stessa regione di DNA e, quindi, complementare all’RNA II. L’appaiamente tra l’RNA II e l’RNA I compete con l’appaiamento tra l’RNA II e il filamento stampo, riducendo la frequenza di inizio della replicazione. Il prodotto d’espressione del gene rop, inoltre, stabilizza il complesso RNA I:RNA II, riducendo ulteriormente la frequenza di inizio. Rnasi H RNA II ori rop RNA I Il numero di copie dei plasmidi, quindi, è diminuito da mutazioni che destabilizzano il legame tra il filamento stampo e l’RNA II o da mutazioni che stabilizzano il complesso RNA I : RNA II e, all’inverso è diminuito da mutazioni che stabilizzano il legame RNA I:RNA II e aumentato da mutazioni che destabilizzano il legame tta il filamento stampo e l’RNA II. Analogamente mutazioni che aumentano la disponibilità della proteina Rop o dell’RNA I o che diminuiscono l’abbondanza di RNA II diminuiscono il numero di copie, mentre mutazioni che aumentano l’abbondanza di RNA II e diminuiscono quella di RNA I e/o Rop, aumentano il numero di copie.
