07/04/2016
A.A. 2015-16
Dipartimento di Scienze della Vita
CdS Biologia Molecolare e Cellulare (LM-6)
Type IV – T4S
correlato all’apparato della
coniugazione che transloca DNA o
substrati proteici attraverso la parete
(spesso in relazione alla patogenesi)
Genetica dei Procarioti - 6
Prof. Laura Marri
ricevimento: previo appuntamento telefonico o e-mail
I batteri usano il sistema di secrezione di tipo IV (T4S) per due
motivi fondamentali:
scambio genico
rilascio di molecole effettrici (EFFETTORI) a
cellule eucariotiche bersaglio
1
07/04/2016
(a) a model for T-pilus assembly in Agrobacterium tumefaciens
VirB4–VirB8–VirB5–VirB2
interaction sequence lead
to the formation of VirB2–
VirB5 complexes followed
by T-pilus assembly
(b)
transmission electron microscopic image showing
T-pili and flagella on A. tumefaciens.
Ti è un esempio di plasmide
batterico naturale
Secretion pathway and structure of the T4S system
2
07/04/2016
secondary amine derivatives formed by condensation of an amino
acid, either with a ketoacid or a sugar
Crown gall tumors
galla del colletto
Also, virulence plasmids from Salmonella, Shigella, Yersinia,
Bacillus anthracis, E.coli, and others.
3
07/04/2016
PLASMIDI
MGEs: segmenti di DNA codificanti enzimi o altre proteine che
consentono lo spostamento di questi elementi nel genoma (mobilità
intracellulare) o tra cellule batteriche (mobilità intercellulare)
Elementi genetici mobili
(mobile genetic elements,
MGEs)
Bacterium releasing DNA with plasmids
PLASMIDI
nella maggior parte dei casi sono molecole di DNA circolari
(1 - 1000 kb) ma anche lineari o integrati nel cromosoma
batterico (episomi)
dal 1977
4
07/04/2016
In un gel di agarosio e bromuro di etidio le tre forme migrano a
velocità diverse e possono essere distinte
PLASMIDI
Le forme molecolari circolari superavvolte durante le
forma linerizzata ( tagliata con un
enzima di restrizione in un sito unico)
manipolazioni sperimentali possono rilassarsi o linearizzarsi
in seguito a rotture a singolo o a doppio filamento.
plasmide superavvolto
supercoiled
forma rilassata
forma lineare
forma superavvolta
plasmide circolare
rilassato
nick
plasmide linearizzato
Large-scale purification of plasmids
by cesium chloride density gradient centrifugation
“old school method of purifying plasmid”
since the 1950s
Three forms of plasmid DNA
72-96 hrs
during this time, the CsCl forms a gradient and the molecules migrate
according to their density until they float at their individual isopycnic points (the
point in the gradient that equals the buoyant density of the molecule).
5
07/04/2016
Replicazione plasmidica
Replicazione plasmidica
La capacità di replicarsi autonomamente è conferita loro dalla
presenza di una origine di replicazione, ori (oriV, “ori vector”)
host protein
P1
un plasmide deve contenere un’origine per la replicazione del DNA
richiedono proteine plasmidiche e/o dell’ospite batterico
Plasmid replication
REPLICONI
1. Plasmid replication requires host DNA replication machinery.
2. Most wild plasmids carry genes needed for transfer and copy number
control.
circolo rotante
replicazione
(uni o bi-direzionale)
3. All self replication plasmids have a oriV: origin of replication
4. Some plasmids carry and oriT: origin of transfer.
5. There are 5 main “incompatibility” groups of plasmid replication. Not
all plasmids can live with each other.
6. Agents that disrupt DNA replication destabilize or cure plasmids from
cells.
6
07/04/2016
Funzioni dell’origine di replicazione
NUMERO DI COPIE e MODALITA' DI REPLICAZIONE
I plasmidi si replicano con due modalità diverse
Oltre ad essere essenziale per la replicazione, l’origine di
replicazione oriV controlla:
Alcuni, generalmente quelli di grandi dimensioni, si replicano in
maniera coordinata con la replicazione del cromosoma batterico
Il numero di copie
e si dicono sottoposti a
La specificità d’ospite
controllo stringente
I gruppi di incompatibilità
In genere sono presenti in una o poche copie per batterio.
NUMERO DI COPIE e MODALITA' DI REPLICAZIONE
NUMERO DI COPIE e MODALITA' DI REPLICAZIONE
Plasmidi
ori
N. di copie
Altri, in genere di piccole dimensioni, si replicano in maniera
indipendente dalla replicazione batterica e si dicono sottoposti a
controllo rilassato
Sono presenti in molte copie - fino a 1000 - per batterio.
PUC e derivati
ColE1
500-700
pACYC e derivati
p15A
10-12
pSC101 e derivati
Psc10
1-5
7
07/04/2016
Sistema di ripartizione
H
I
H
G
L
O
W
C
O
P
Y
C
O
P
Y
N
U
M
B
E
R
N
U
M
B
E
R
Sistema di ripartizione
Bacterial plasmids encode partitioning (par) loci that ensure ordered plasmid
segregation prior to cell division
8
07/04/2016
Plasmid R1 was first isolated from Salmonella paratyphi
Plasmid R1-encoded ParMRC plasmid segregation system.
The parMRC operon.
parC is composed of two blocks of five short repeats, which are interrupted by a
39 bp region containing the promoter for parM and parR (PMR).
ParR, an adaptor protein, binds to parC and represses transcription.
ParM forms short filaments in
the presence of ATP, which
either
undergo catastrophic
disassembly following
ATP hydrolysis to
ADP plus inorganic
phosphate (Pi),
or
become capped by a
ParR–parC complex and
undergo stable bipolar
elongation.
ParR, an adaptor protein, binds to parC and represses transcription.
Plasmids
ParR
ParM
9
07/04/2016
In vitro polymerization of cytoskeletal proteins of the MinD/ParA superfamily
(A) Formation of MinD filament
bundles in the presence of MinE,
and ATP
Actina-omologo
(B) Formation of a ParA (ParM)
filament bundle in the presence of
ParB (ParR), and ATP
Controllo del numero di copie
I plasmidi possono controllare il numero di copie regolando l’inizio
della replicazione plasmidica
inibizione mediante RNA + proteina dell’inizio della
replicazione
10
07/04/2016
Plasmidi Col:
conferiscono un vantaggio al batterio portatore nei confronti di batteri della stessa
specie o specie affini
codificano per le batteriocine (scoperte da
André Gratia nel 1925) capaci di
permeabilizzare le membrane o degradare
gli acidi nucleici
La maggior parte dei vettori di clonaggio derivano dal plasmide ColE1
11
07/04/2016
Controllo del numero di copie
Rnasi H
RNA II
ori
la replicazione è innescata da un primer (RNA II), trascritto da un
promotore situato 550 bp a monte di oriV.
Gli ibridi DNA:RNA formati dal filamento di DNA e dall’RNA II nascente,
costituiscono un substrato per la Rnasi H che taglia l’ibrido e fornisce
l’OH al 3’ per la replicazione del DNA.
RNA II è controllato da RNA I, trascritto sul filamento opposto della
Replicazione del plasmide ColE1
stessa regione di DNA e, quindi, complementare a RNA II .
RNA I-RNA II compete con l’appaiamento tra RNA II e il filamento
RNA II is required for
priming DNA synthesis
at the origin. Positive
regulation.
stampo, riducendo la frequenza di inizio della replicazione.
Il prodotto del gene rop stabilizza il complesso RNA I-RNA II ,
riducendo ulteriormente la frequenza di inizio.
-555
RNA II
P-II
P-I
RNA II
RNA polimerasi
-20
origin
RNA I
RNA I (108 b)
ori
RNA I
P-I & P-II: promotori
rop
RNA I è complementare a RNA II
12
07/04/2016
Funzioni dell’origine di replicazione
Oltre ad essere essenziale per la replicazione, l’origine di
replicazione oriV controlla:
Il numero di copie
Lo spettro d’ospite
I gruppi di incompatibilità
SPETTRO D’OSPITE
Funzioni dell’origine di replicazione
Alcuni plasmidi sono in grado di replicare in un numero limitato di
specie batteriche e si dicono a specificità d'ospite limitata : narrow
host range
Oltre ad essere essenziale per la replicazione, l’origine di
replicazione oriV controlla:
Altri sono in grado di replicarsi in una vasta gamma di specie
batteriche e si dicono a largo spettro d'ospite: broad host range, BHR
Il numero di copie
La specificità d’ospite
I plasmidi BHR derivano questa loro proprietà dal possesso di
funzioni per il riconoscimento dell' origine di replicazione, dipendono
I gruppi di incompatibilità
meno, quindi, dall'apparato replicativo dell'ospite batterico
13
07/04/2016
GRUPPI DI INCOMPATIBILITA’
Plasmidi con la stessa origine di replicazione sono incompatibili tra
loro.
Se in uno stesso batterio entrano due plasmidi con la stessa origine
di replicazione, questa compete per componenti proteici comuni.
Come risultato nel giro di poche generazioni uno dei due plasmidi
verrà perso.
INCOMPATIBILITA’ PLASMIDICA
GRUPPI DI INCOMPATIBILITA’
Plasmidi con la stessa origine di replicazione sono incompatibili tra
loro.
Se in uno stesso batterio entrano due plasmidi con la stessa origine
di replicazione, questa compete per componenti proteici comuni.
Come risultato nel giro di poche generazioni uno dei due plasmidi
verrà perso.
Possono invece coesistere plasmidi con origine di replicazione
diverse che appartengono a diversi gruppi di incompatibilità
14
07/04/2016
Plasmidi coniugativi e non coniugativi
MARCATORI SELEZIONABILI
Per essere coniugativo un plasmide deve possedere:
Una specifica regione di riconoscimento chiamata Ori T
(origine di trasferimento)
I plasmidi naturali a volte veicolano uno o più geni non
essenziali capaci di conferire loro un vantaggio selettivo in
I prodotti genici, agenti in trans, specificati dal locus tra
(trasferimento)
alcune situazioni.
Per es. possono codificare per tossine o resistenza agli
antibiotici
una delle funzioni tra: sintesi del pilo coniugativo
15
07/04/2016
Plasmidi coniugativi e non coniugativi
Plasmidi coniugativi e non coniugativi
plasmidi privi di queste funzioni geniche non sono trasmissibili
se un plasmide possiede un Ori T può
essere trasferito per coniugazione
utilizzando funzioni helper che
forniscono, in trans, i prodotti genici
mancanti
Tuttavia . . .
Distribution of conjugative, mobilizable, and nonconjugative plasmids
according to plasmid size
Schematic view of the genetic constitution of transmissible plasmids.
MPF: mating pair formation
T4CP: Type IV coupling proteins
Smillie C et al. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 2010;74:434-452
Smillie C et al. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 2010;74:434-452
16
07/04/2016
Escherichia coli S17.1 λpir
oriT
Escherichia coli S17-1 λpir è in grado di mobilizzare plasmidi
non coniugativi in batteri Gram-negativi grazie all’integrazione
stabile nel proprio cromosoma dei geni codificanti per le
geni tra
plasmide
funzioni di trasferimento derivate dal plasmide RP4 che
agiscono
sulla
sequenza
oriT
presente
sui
plasmidi
coniugazione
mobilizzabili
Ricevente
MGEs: segmenti di DNA codificanti enzimi o altre proteine che
consentono lo spostamento di questi elementi nel genoma (mobilità
intracellulare) o tra cellule batteriche (mobilità intercellulare)
17
07/04/2016
1. Plasmid replication requires host DNA replication machinery.
Sistemi di cattura di MGE dagli ambienti naturali
2. Most wild plasmids carry genes needed for transfer and copy
number control.
3. All self replication plasmids have a oriV: origin of replication
4. Some plasmids carry and oriT: origin of transfer.
5. Plasmid segregation is maintained by a par locus-a partition
locus that ensures each daughter cells gets on plasmid. Not all
plasmids have such sequences.
6. There are 5 main “incompatibility” groups of plasmid
replication. Not all plasmids can live with each other.
Metodo endogeno
ricerca di plasmidi in batteri coltivabili
7. Agents that disrupt DNA replication destabilize or cure plasmids
from cells.
Sistemi di cattura di MGE dagli ambienti naturali
Metodo esogeno
sfrutta il potenziale di trasferimento degli MGE
etc., etc., etc.
18
07/04/2016
SISTEMI DI CATTURA DI MGE
metodo esogeno
A
comunità microbica
donatrice di
MGE
metodo esogeno
A: INCROCI BIPARENTALI
INCROCI BIPARENTALI
marcatore
selezionabile
B: INCROCI TRIPARENTALI
ceppo ricevente
SISTEMI DI CATTURA DI MGE
metodo esogeno
B
INCROCI TRIPARENTALI
comunità microbica
donatrice di
MGE
ceppo donatore con
un plasmide mob +
marcatore
selezionabile
ceppo ricevente
19
07/04/2016
se un plasmide possiede un Ori T può
essere trasferito per coniugazione
plasmide
mobilizzabile
II
I
utilizzando funzioni helper che
forniscono, in trans, i prodotti genici
mancanti
marcatore
selezionabile
plasmide
coniugativo
??
III
ricevente
Sistemi di cattura di MGE dagli ambienti naturali
SISTEMI DI CATTURA DI MGE
PCR
Metodo esogeno
sfrutta il potenziale di trasferimento degli MGE
metodo esogeno che individua sequenze
specifiche di un MGE in DNA proveniente
da comunità microbiche
PCR
20
07/04/2016
Studying Plasmid Horizontal Transfer In Situ
Various reporter genes have been used to examine HGT,
including the luciferase genes luxAB, the β-galactosidase
gene lacZ and genes encoding fluorescent proteins such as
green fluorescent protein (GFP).
Only fluorescence genes have been used for the in situ
detection of HGT in natural environments, as no substrate has
to be added to detect the product of the expressed reporter
gene
21
07/04/2016
LacI repressible
promoter
Plasmide
coniugativo
GFP
gene
reporter
Horizontal gene transfer (HGT) in the phyllosphere
I biofilms offrono una nicchia
ideale per lo scambio di DNA
extracromosomico (plasmidi)
confocal scanning laser micrographs showing green fluorescent
transconjugant cells in the interstices of epidermal cells (a) and inside
a stoma (b) of a bean leaf.
22
