La spettrometria di massa converte le sostanze in ioni prima di
annuncio pubblicitario
Spettrometria di Massa Cos’è uno spettrometro di massa Lo spettrometro di massa è uno strumento che produce ioni e li separa in fase gassosa in base al loro rapporto massa/carica (m/z). Un’analisi mass spettrometrica può essere rappresentata dai seguenti passaggi: Introduzione del campione – Ionizzazione – Analisi della massa – Rivelazione degli ioni/analisi dei dati. Scopi della spettrometria di massa • Determinazione del peso molecolare • Delucidazione della struttura molecolare • Identificazione di componenti di una miscela • Indagini quantitative • Studi meccanicistici • Studio di interazioni intermolecolari Aree di interesse • • • • • • • • • • • • • Proteomica Glicobiologia Genetica e medicina Biologia molecolare e cellulare Scienze ambientali Chimica dei polimeri Antiterrorismo Farmacologia Antidoping Archeologia Astronomia Analisi inorganica …e ancora tante altre Caratteristiche della spettrometria di massa • Intervallo di PM fino a centinaia di kDa • Sensibilità dell’ordine delle picomoli o inferiore • Acquisizione veloce dei dati • Interfacce con metodi separativi • Alta e bassa risoluzione Spettrometria di massa Le molecole sono molto piccole! Ci vogliono approsimativamente 600.000.000.000.000.000.000.000 molecole di acqua per fare un grammo! Per pesare le molecole conviene usare il dalton (Da). 1 Da corrisponde alla dodicesima parte dell'atomo di carbonio (12C). In questa scala l'ossigeno (16O) pesa 15,9949 e l'idrogeno (1H) pesa 1,00782. L'acqua pesa quindi circa 18 (18,0104541). Alcune definizioni Massa Nominale: e' coincidente con il numero di protoni e neutroni che contiene l'isotopo. Lo spettrometro di massa misura il rapporto massa/carica degli ioni: e' quindi in grado di distinguere i singoli isotopi di ciascun elemento. Massa Esatta: e' la massa "relativistica" dell'isotopo; non coincide quindi con la somma delle masse esatte dei protoni e neutroni contenuti, ma e' determinata anche dall'energia di legame (nucleare). L'unita' di misura e' ottenuta ponendo uguale a 12 esatto la massa dell'isotopo 12C. Peso Atomico: (quello usato in stechiometria, per intendersi): e' la media ponderale delle masse esatte degli isotopi presenti in natura di quel particolare elemento. Relative Isotope Abundance of Common Elements: Element Isotope Carbon Hydrogen Nitrogen Oxygen Sulfur Chlorine Bromine 12C 1H 14N 16O 32S 35Cl 79Br Relative Abundance 100 100 100 100 100 100 100 Isotope 13C 2H 15N 17O 33S Relative Abundance 1.11 .016 .38 .04 .78 Isotope 18O 34S 37Cl 81Br Relative Abundance .20 4.40 32.5 98.0 Quali sono i componenti di uno spettrometro di massa? Sistema di introduzione rivelatore analizzatore Sorgente ionica Spettro di massa Modalità di ionizzazione Hard Ionization: • Ionizzazione elettronica – Electron Ionization (EI) Soft Ionization: • Ionizzazione chimica – Chemical Ionization (CI) • Bombardamento con atomi veloci – Fast Atom Bombardment (FAB) • Ionizzazione termospray – Thermospray Ionization (TSP) • Ionizzazione elettrospray – Electrospray Ionization (ESI) • Ionizzazione chimica a pressione atmosferica – Atmospheric Pressure Chemical Ionization (APCI) • Desorbimento laser assistito da matrice – Matrix Assisted Laser Desorption (MALDI) Lo ione molecolare può non essere visibile Eccessiva frammentazione La sostanza deve essere volatilizzata Gli ioni sono accelerati da un intenso potenziale elettrostatico verso l’analizzatore. Un campo magnetico è in grado di far deviare particelle cariche in movimento, per cui gli ioni provenienti dalla sorgente possono seguire la curvatura del tubo. L’entità della deviazione dipende dall’intensità del campo magnetico, dall’energia fornita dal potenziale elettrostatico e dal rapporto m/z dello ione. In particolare per ogni valore di potenziale elettrostatico e campo magnetico, solo ioni con un ben preciso rapporto m/z riusciranno ad attraversare la fenditura posta alla fine dell’analizzatore, ed arrivare quindi al collettore di ioni, che genera un segnale elettrico dipendente dall’intensità della corrente ionica che lo colpisce. L'analizzatore a quadrupolo consiste in un tubo rettilineo in cui è fatto il vuoto ed in cui sono presenti quattro barre parallele, disposte simmetricamente intorno all'asse del tubo, di sezione circolare oppure iperbolica. Le barre diametralmente opposte sono in contatto elettrico tra di loro, mentre tra barre adiacenti è applicata un voltaggio formato da due componenti: una differenza di potenziale continua e una oscillante ad alta frequenza. Lo ione entra nell'analizzatore parallelamente all'asse z, ed è spinto dai campi elettrici continuo e oscillante a seguire una traiettoria a spirale. Peso molecolare della sostanza sotto indagine Frammentazioni Picchi isotopici: HCl H35Cl MW 36 (75%) H37Cl MW 38 (25%) BILANCIA 6.021023 molecole = 1 mol = 36.55 g Sorg. Analizzatore MS m/z 36 m/z 38 (75%) (25%) Picchi isotopici: EtOH 13CH CH3CH2OH MW 46 3CH2OH MW 47 1.1% CH313CH2OH MW 47 1.1% Sorg. BILANCIA MS Analizzatore m/z 46 m/z 47 (2.2 %) 6.021023 molecole = 1 mol = 46.07 g Picchi isotopici M+1 M+2 1.1%(numero di C)+ 0.36%(numero di N) Cl (33% di M) Br (100% di M) S (4% di M) Sorgente FAB Sorgente MALDI Sorgente ESI Non richiedono volatilizzazione The Nobel Prize in Chemistry 2002 “For the development of methods for identification and structures analysis of biomolecules” Electrospray Ionization Laser Desorption Ionizzazione Elettrospray (ESI) Ionizzazione elettrospray • Tecnica di ionizzazione in fase liquida a pressione atmosferica • Ionizzazione delicata • Molecole di polarità medio-alta • Composti con basso ed alto PM fino a 150.000 • Spesso si formano ioni con carica multipla • Comune la presenza di ioni addotto • La fase mobile deve essere polare Dettaglio dell’ugello elettrospray Guaina di N2 Sonda riscaldata ESI ±5 kV Gas di nebulizzazione N2 Pennacchio di ioni Ago ESI Meccanismo dell’elettrospray Goccioline contenenti ioni Capillare ±5 kV Col procedere dell’evaporazione delle goccioline, il campo aumenta e gli ioni si muovono verso la Raggiungimento del superficie limite di Raleigh ed esplosione coulombica che rilascia gli ioni Ionizzazione elettrospray Ionizzazione elettrospray ESI-MS Spectrum of Ubiquitin (MW 8564 Da) +12 715.99 +13 661.26 +11 786.97 +10 859.66 +9 955.00 +8 1073.07 Nessuna Frammentazione Formazione di Ioni Multicarica Spettro Deconvoluto dell’Ubiquitina Ubiquitina Ossidata 8580.00 Ubiquitina Intatta 8563.63 Ubiquitina Carbossilata 8594.25 Prestazioni Generali della Sorgente ESI Vantaggi Svantaggi Funziona bene con analiti volatili e non volatili, ionici e/o polari Scarsa frammentazione Informazioni sul peso molecolare Scarsa frammentazione Elevata sensibilità Permette la determinazione di alti pesi molecolari Interfacciamento con Cromatografia Liquida Non compatibile con l’utilizzo di tamponi non volatili e solventi organici apolari. Ionizzazione inibita da alte concentrazioni saline Ionizzazione Laser Assistita da Matrice (MALDI) Matrix Assisted Laser Desorption Ionization MALDI Il desorbimento mediante laser permette di ottenere ioni in fase gassosa. Le pulsazioni provenienti da un laser a 106-1010 W/cm2 sono focalizzate sulla superficie del campione solido. Le pulsazioni estraggono materiale dalla superficie e creano un microplasma di ioni e di molecole neutre che possono reagire tra di loro in fase vapore. Le pulsazioni laser sono in grado sia di vaporizzare sia di ionizzare il campione. Matrix Assisted Laser Desorption Ionization MALDI Principi operativi I passaggio: il composto è mescolato ad una matrice che assorbe intensamente la lunghezza d’onda del laser. La miscela è asciugata e qualunque solvente rimosso. Ne risulta una soluzione solida costituita da analita e cristalli di matrice. Matrix Assisted Laser Desorption Ionization MALDI II passaggio: le pulsazioni estraggono la soluzione solida ed inducono il riscaldamento della soluzione e la sublimazione della matrice. Una certa energia è trasferita alle molecole di analita che si ionizzano. Il MALDI permette il desorbimento e la ionizzazione di analiti ad altissimo PM (>100000 Da). E’ usato nell’analisi di proteine ad alto PM, polimeri e biopolimeri. 1. Sample is mixed with matrix and dried on a sample plate 2. Sample plate is introduced into MALDI source 3. Sample spot is irradiated with laser + + + + + + + To Time of Flight MALDI PROCESS Irradiation Desolvation Desorption H+ Matrix Sample Proton transfer Sample Molecules are ionized by proton transfer from the matrix MALDI-TOF Spectrum of Cytocrome C, Ubiquitin and Myoglobin Matrix Selection Solubility in sample-solvent system Absorption at the laser wavelenght Photostability Volatility Reactivity Matrix Application a-cyano-4-hydroxycinnamic acid (CHCA) Peptides (<10 KDa), lipids, carbohydrates Sinapinic acid (SA) Peptides and large membrane proteins Gentisic acid Peptides, proteins, carbohydrates, glycoproteins, glycolipids, polymers, lipids, organic molecules Trans-3-indoleacrylic acid (IAA) Synthetic polymers 3-hydroxypicolinic acid (HPA) Oligonulceotides > 3.5KDa 2,4,6-trihydroxyacetophenone (THAP) Oligonucleotides < 3.5KDa Dithranol (DIT) Polymers proteins (10-150KDa), glycoproteins, Prestazioni Generali della Sorgente MALDI Vantaggi: Analisi di composti con un PM oltre 300000 Da Alta Sensibilità (da 100 fmol a 2 pmol) No Ioni multicarica Tolleranza alla presenza di sali, tamponi o altri additivi Analisi di miscele complesse Svantaggi: Analisi di composti con un PM sotto i 600 Da è difficile La risoluzione dell’analizzatore TOF è limitata No analisi di complessi non-covalenti Accoppiamento On-line con un LC or CE è molto difficile. Paragone tra tecniche di ionizzazione MS 200,000 ESI 15,000 1,000 PM FAB EI/CI 10 NON POLARE MOLTO POLARE
