Gli enzimi

Proteine globulari
• Enzimi
• Mioglobine ed emoglobina
• Trasportatori
Enzimi
Definizioni
• Gli enzimi sono proteine la cui attività
catalitica dipende dall’integrità della loro
conformazione nativa.
• Praticamente tutte le reazioni
biochimiche sono catalizzate da enzimi.
• Sono catalizzatori molto efficaci che
aumentano la velocità delle loro reazioni
di vari ordini di grandezza (107 – 1014)
Cofattori
• Alcuni enzimi non hanno bisogno di altri gruppi
chimici per la loro attività se non quelli dei loro
residui aminoacidici.
• Altri invece hanno bisogno di componenti chimici
addizionali chiamati COFATTORI.
• Il cofattore può essere:
a) uno o più ioni inorganici (Fe, Mg, Mn, Zn)→ metallo
proteine.
b) molecole organiche complesse legate non
covalentemente→ coenzima.
c) molecole organiche complesse o ioni metallici legati
covalentemente alla proteina enzimatica→ gruppo
prostetico
• L’oloenzima è un enzima cataliticamente
attivo con tutti i suoi cofattori.
• L’apoenzima o apoproteina è la parte
proteica di un enzima.
• Gli isoenzimi sono enzimi esistenti in
forme molecolari diverse catalizzanti lo
stesso tipo di reazione.
Classificazione degli enzimi
•
Gli enzimi vengono classificati in base alla reazione
che catalizzano:
1.
2.
3.
4.
Ossidoreduttasi (trasferimento di elettroni)
Transferasi (reazioni di trasferimento di gruppi)
Idrolasi (reazione di idrolisi)
Liasi (addizione di gruppi a legami doppi o
formazione di doppi legami mediante rimozioni di
gruppi)
Isomerasi (trasferimento di gruppi all’interno di
molecole formando isomeri)
Ligasi (formazione di legami C-C, C-S, C-O, C-N,
mediante reazioni di condensazione accoppiate alla
scissione di ATP)
5.
6.
Catalisi enzimatica
La funzione di un catalizzatore è quella di aumentare la velocità della reazione
senza modificare gli equilibri: es. A ↔ B
Allo stato basale, le molecole A e B contengono una quantità caratteristica di
energia libera.
Tra A e B esiste una barriera energetica che corrisponde all’energia necessaria ad
allineare i gruppi reagenti, a formare cariche transitorie instabili, a riorganizzare i
legami e ad altre informazioni che sono richieste perché la reazione possa procedere in
una delle due direzioni.
Per far avvenire la reazione, le molecole devono superare questa barriera e
raggiungere un livello energetico più alto.
Allo stato di transizione (punto più
elevato della curva) la molecola ha le
stesse probabilità di decadere verso A o
B.
Lo stato di transizione è un momento
molecolare transitorio in cui alcuni eventi
(rottura di legami, comparsa di cariche…)
devono procedere fino a quel punto
preciso in cui il composto può ritornare
substrato o diventare prodotto
La differenza tra i livelli di energia dello stato di base e
dello stato di transizione viene detta energia di
attivazione (ΔG**).
Il catalizzatore aumenta la velocità di reazione abbassando
l’energia di attivazione.
Un enzima può catalizzare sia in direzione A verso B che
in direzione opposta, B verso A.
Il suo ruolo è quello di accelerare l’interconversione tra
A e B.
L’enzima non viene consumato
durante questo processo e
il punto di equilibrio resta
inalterato
Cinetica enzimatica
• E’ lo studio della velocità della reazione e di come varia in funzione
della modificazione di parametri sperimentali.
• Cinetica di Michaelis-Menten (cinetica dello stato stazionario):
l’enzima prima si combina con il substrato, si forma il complesso
enzima-substrato che poi si decompone nel prodotto e nell’enzima
libero:
E + S → ES → EP → E + P
Equazione di Michaelis-Menten: equaz. della
velocita’ di una reazione catalizzata da un
enzima con un solo substrato
V0= Vmax [S]
Km+ [S]
Vmax
Km
[S]
velocità di catalisi massima dell’enzima.
costante di Michaelis
concentrazione di substrato
Interazioni enzima-sustrato
E + S → ES → EP → E + P
Km, costante di dissociazione
• Km è definita come la concentrazione di substrato a cui V0 è
metà della Vmax:
Vmax =Vmax[S]
2
Km+[S]
Dividendo per Vmax si ottiene:
1 =
[S]
2
Km+[S]
Risolvendo per Km si ha: Km+[S]=2[S] →Km=[S]
• E’ una caratteristica di ogni reazione enzimatica e rappresenta
una misura dell’affinità dell’enzima per il substrato: minore è il
valore della Km, maggiore è l’affinità.
Relazione tra concentrazione del substrato e velocità
iniziale per 2 enzimi ( a e b) agenti sullo stesso substrato
• L’enzima a ha una Km più elevata (minore affinità per il
substrato) e produce la Vmax a concentrazioni di substrato
più elevate;
• L’enzima b ha un valore di Km più basso e raggiunge la Vmax a
concentrazioni di substrato più basse (maggiore affinità per
il substrato).
• La reazione catalizzata dall’enzima b è pertanto favorita da
basse concentrazioni di [S], quella catalizzata dall’enzima a è
favorita da concentrazioni elevate di [S].
Interazioni enzima-sustrato
•L’enzima per poter catalizzare una reazione deve
essere in grado di poter interagire con il proprio
substrato.
•Gli enzimi sono molto specifici e possono discriminare
tra molecole molto simili.
•I gruppi catalitici di un enzima interagiscono con il
substrato e lo preparano (attivano) alla reazione.
•L’energia richiesta per abbassare l’energia di
attivazione deriva in genere da interazioni deboli non
covalenti (energia di legame) che si formano tra
substrato e enzima nel sito attivo.
•Queste interazioni tra enzimi e substrato sono
ottimali nello stato di transizione e rappresentano la
maggiore forza trainante della catalisi.
Interazioni enzima-sustrato:
idrolisi del saccarosio da parte della saccarasi
Specificità degli enzimi
• La specificità si riferisce
alla capacità di un enzima di
discriminare tra composti
simili.
• Essa deriva dalla formazione di una molteplicità di
interazioni deboli tra l’enzima e praticamente tutte le
parti della molecola del suo
substrato specifico a livello
del sito attivo.
Sono stati proposti due modelli di interazione fra enzima e substrato:
Modello chiave-serratura:
il sito attivo dell’enzima si
adatta al substrato come una
chiave in una serratura.
Modello dell’adattamento
indotto:
sia l’enzima che il substrato
vengono distorti quando si
legano tra loro, il substrato
viene forzato ad assumere una
conformazione vicina allo stato
di transizione.
Interazioni tra substrato e sito attivo:
carbossipeptidasi A
Meccanismi di catalisi enzimatica
• Sono i meccanismi chimici con cui gli enzimi
convertono i substrati in prodotti.
• I principali meccanismi di catalisi enzimatica
sono:
1. Catalisi acido-basica generale
2. Catalisi covalente
3. Catalisi da ioni metallici
Catalisi acido-basica generale
• L’enzima stabilizza gli intermedi carichi che si
formano allo stato di attivazione mediante il
trasferimento di un protone al o dal
substrato per formare specie chimiche che si
convertono nei prodotti molto più facilmente.
• La catalisi a cui partecipano solo H+ o solo OHpresenti nell’acqua viene chiamata catalisi
acida o basica specifica.
Catalisi covalente
• Coinvolge la formazione di uno o più legami
covalenti transitori tra l’enzima e il
substrato.
• Il legame covalente si forma tra substrato
e gruppi funzionali di cofattori o catene
laterali di aminoacidi dell’enzima e può
attivare il substrato a promuovere una
reazione specifica e dipendente dal gruppo
chimico o coenzima che vi partecipa.
Catalisi da ioni metallici
• I metalli legati all’enzima o assunti dalla
soluzione con il substrato possono
partecipare alla catalisi.
• Le interazioni ioniche tra un enzima con un
metallo legato e il substrato possono
aiutare a orientare il substrato per la
reazione e/o a stabilizzare stati di
transizione carichi.
Gli inibitori enzimatici
• Gli enzimi possono essere inibiti reversibilmente
e irreversibilmente; le sostanze che riducono
l’attività enzimatica sono dette inibitori.
•
•
•
•
Inibizione reversibile:
I.R. competitiva
I.R. non competitiva
I.R. mista
• Inibizione irreversibile
Inibizione reversibile
Competitiva: inibitore e substrato competono per lo
stesso sito attivo di un enzima e la reazione non può
avvenire se si lega l’inibitore perché impedisce il
legame al substrato.
L’inibizione può essere rimossa aumentando la
concentrazione di substrato.
Mista: l’inibitore si lega ad un sito diverso da quello
del substrato, ma si lega solo al complesso enzimasubstrato (variazione di Vmax e Km).
Non competitiva: l’inibitore si lega ad un sito
distinto da quello del substrato, e non
interferisce con il legame del substrato, che si può
legare, ma non viene convertito in prodotti perché
l’enzima è inattivo.
Inibizione competitiva
Un inibitore competitivo riduce quindi la concentrazione di
enzima libero disponibile per legare il substrato. Per elevate [S]
la velocità dell’enzima si avvicina alla Vmax annullando l’effetto
dell’inibitore, quindi si ha un aumento della Km (riduzione di
affinità) ma non della Vmax.
Inibizione non competitiva
L’inibitore provoca una distorsione nel sito attivo rendendo
così l’enzima cataliticamente inattivo. L’inibitore influisce
sull’attività catalitica dell’enzima ma non sul legame tra sito
attivo ed enzima, quindi si ha una riduzione della Vmax
senza modificare la Km dell’enzima.
Inibizione irreversibile
• Gli inibitori irreversibili sono molecole che
si combinano covalentemente o distruggono
un gruppo funzionale dell’enzima,
essenziale per la sua attività catalitica.
• Una classe speciale sono gli inibitori suicidi;
sono in grado di interagire con il sito attivo
dell’enzima trasformandosi in un composto
altamente reattivo che si combina
irreversibilmente con l’enzima. Vengono
chiamati anche inattivatori basati sul
meccanismo.
La regolazione enzimatica
• In ogni sistema o via metabolica c’è un enzima che regola la velocità
complessiva della sequenza di reazioni in quanto catalizza la reazione
più lenta o quella che limita la velocità del sistema.
• Questi enzimi, chiamati enzimi regolatori, presentano un’attività
catalitica aumentata o diminuita in risposta a certi segnali.
• L’attività degli enzimi regolatori è modulata mediante vari tipi di
segnali:
 Modulazione allosterica (enzimi allosterici)
 Modulazione covalente reversibile (es. fosforilazioni del gruppo –
OH di serine, treonine o tirosine)
 Regolazione da parte di proteine di controllo a cui si legano gli
enzimi
 Attivazione per proteolisi (zimogeni, irreversibile)
 Induzione o repressione della sintesi degli enzimi
Modulazione allosterica
• I modulatori allosterici sono molecole che possono
essere inibitori o attivatori dell’enzima stesso.
• I modulatori presentano siti di interazione specifici
diversi dal sito attivo chiamati siti allosterici ed
apportano delle modifiche conformazionali all’enzima
che lo rendono più o meno affine verso il substrato e
ne modulano l’attività di catalisi.
Caratteristiche dei modulatori
• Lo stesso substrato è spesso un attivatore
(modulatore) dell’enzima che viene chiamato
omotropico.
• Se il modulatore è una molecola diversa dal
substrato, l’enzima viene detto eterotropico.
• In alcuni sistemi multienzimatici l’enzima
regolatore viene inibito dal prodotto finale
della via, quando questo si accumula oltre il
fabbisogno, il meccanismo viene chiamato:
inibizione retroattiva o a feedback.
A→B→C→D→E→F
Regolazione da parte di proteine di
controllo a cui si legano gli enzimi
L'inibitore pancreatico bovino della tripsina forma un
complesso stabile con l'enzima tripsina inibendone
l'attività proteolitica nel pancreas.
Modulazione covalente reversibile: fosforilazione
del gruppo –OH di serine, treonine o tirosine
• Molti enzimi possono
essere regolati
mediante
fosforilazione e
defosforilazione di
alcuni residui di
serina, treonina e
tirosina presenti nella
catena polipeptidica.
• Questa modificazione
covalente induce nella
proteine una
variazione di
conformazione che
può aumentare o
inibire l’attività
catalitica dell’enzima.
Attivazione per proteolisi
• Molti enzimi sono prodotti e immagazzinati come
precursori inattivi detti proenzimi o zimogeni
• Gli zimogeni sono convertiti in enzimi attivi per
idrolisi irreversibile di uno o più legami peptidici.
Es:
• Chimotripsinogeno (pancreas)  chimitripsina
(intestino)
• Tripsinogeno (pancreas)  tripsina (intestino)
• Pepsina (pepsinogeno), elastasi (proelastasi),
carbossipeptidasi (procarbossipeptidasi), trombina
(protrombina)
Induzione e repressione della sintesi
• Le cellule possono regolare la velocità di
catalisi modificando la velocità di sintesi
dell’enzima.
• L’aumento (induzione) o la diminuzione
(repressione) della produzione di enzima
determina una variazione della popolazione
complessiva di siti attivi.
• Variazioni dell’espressione di sintesi
dell’enzima richiedono ore o giorni.
• Questo tipo di regolazione è rivolta a enzimi
necessari in un determinato stadio dello
sviluppo o in particolari condizioni fisiologiche.
Gli enzimi nella diagnosi clinica
• Nel plasma sono presenti due gruppi di enzimi:
1) enzimi attivamente secreti nel plasma (es.
zimogeni secreti del fegato per la coagulazione).
2) enzimi liberati durante il ricambio cellulare e
non attivi nel plasma.
• La concentrazione del secondo gruppo di enzimi è
costante in quanto la velocità di rilascio dalle
cellule danneggiate è controbilanciata da
un’eguale velocità di eliminazione dal plasma.
• Un aumento di concentrazione di questi enzimi
può essere indice di un danno tissutale.
Alcuni esempi:
•  ALT (alanina amminotransferasi): danno
epatico
•  GGT (g-glutammil-transferasi): danno
epatico o vie biliari
•  CK (creatina chinasi) e  LDH (lattato
deidrogenasi) isoenzimi cardiaci,  GOT
(glutammato-ossalacetato transaminasi):
infarto del miocardio
•  CK : distrofia muscolare
Quesiti
1)Quale ruolo hanno i Cofattori enzimatici e quali tipi si conoscono?
2)Che ruolo svolge un Coenzima? Indicare almeno 3 esempi di coenzimi e la
rispettiva reazione mediata.
3)Classificazione degli enzimi
4)Quali sono gli aspetti fondamentali della catalisi enzimatica
5)A che cosa si riferisce l’equazione di Michaelis-Menten e quale è il significato della
Km in questa equazione?
6)Quali sono i Modelli usati per descrivere l’interazione Enzima-Substrato
3)Attraverso quali meccanismi chimici gli enzimi operano la trasformazione
substratoprodotto?
4)Quali sono le principali differenze tra inibizione enzimatica di tipo reversibile e
irreversibile?
5)Nel caso di una inibizione reversibile di tipo non competitivo, l’attività enzimatica
può essere ripristinata aumentando la concentrazione di substrato? Motivate la
vostra risposta.
6) Quale è il meccanismo di azione degli inibitori suicidi?
7) Definire che cosa si intende per enzima regolatore di una via metabolica.
Attraverso quali meccanismi può essere modulata la loro azione?
8) Che cosa sono i siti allosterici di un enzima?
9) La fosforilazione dei residui Serinici di un enzima quale tipo di modulazione
rappresenta?
10) Indicare almeno due enzimi di importanza diagnostica.