Consiglio Nazionale delle Ricerche
Corso di formazione integrata scientifica e tecnologica
(A.S. 2002/03)
http://usr-lazio.artov.rm.cnr.it/fiset2002/
Modulo 6:
Aspetti chimico-fisici e biologici
dell’ambiente "suolo"
Daniela Lippi e Maria Rita De Paolis
Istituto di Biologia Agroambientale e Forestale
Area della Ricerca di Roma1 “Montelibretti” - [email protected]
Calendario degli incontri del modulo 6:
Aspetti chimico-fisici e biologici dell’ambiente "suolo”
1. Ecosistema suolo
06/02
Artov
2. Pedogenesi
20/02
Mlib
3. Turnover della sostanza organica nel suolo
27/02
Mlib
4. Ecologia delle popolazioni microbiche del suolo
06/03
Mlib
5. Ciclo dell’Azoto
13/03
Mlib
6. Ciclo del Carbonio
20/03
Mlib
Aspetti chimico-fisici e biologici dell’ambiente "suolo"
5. Ciclo dell’Azoto
Parte teorica
Esperienze di laboratorio
Introduzione
Analisi di attività
Immobilizzazione
batteriche
Mineralizzazione
Azotofissazione
Dosaggio proteine
Azotofissazione
5. Ciclo dell’azoto
Introduzione
La dipendenza reciproca di tutte le forme di vita sulla terra è dimostrata
nei cicli biogeochimici dei principali elementi nutritivi; in particolare nei
cicli dell'Azoto e del Carbonio nei quali troviamo una componente geochimica
e una componente biologica
Riserve di
azoto
60-70 x 1015 t
Litosfera 95-98%
Atmosfera 2-5%
Ciclo molto complesso:
Composti solidi, liquidi e gassosi
Solubili e insolubili
N° ossidazione da +5 a -3
Passaggi pluridirezionali
Numerosi ingressi e uscite
Attività antropiche
Difficoltà di valutare il bilancio
Biosfera 0,01%
Tutti presenti, ma prevale la
forma ridotta (-3), 90% in
natura e 100% nella biosfera
Quindi: NH3 e NH4+
L'azoto è il nutriente più
richiesto da tutti gli organismi
viventi e diviene spesso il
fattore limitante
Anche per quanto riguarda la
capacità di assumere azoto
gli organismi viventi si possono
suddividere nelle tre grandi
categorie:
organismi fotosintetici (produttori)
assimilano azoto solamente sotto
forma di ammonio o nitrati
animali assimilano azoto organico
come proteine e aminoacidi
microrganismi decompongono e
mineralizzano il materiale organico,
liberando CO2 e NH3
Rappresentazione schematica del ciclo dell’azoto
N2
(+1)N2O
Biomassa
(-3) N
Atmosfera
(+2) NO
(+5) NO3
(-3) NH3
(-1) NH2OH
Biosfera
(+3) NO2
Fissazione dell’azoto
Nitrificazione
Assimilazione riduttiva del nitrato
Denitrificazione o dissimulazione riduttiva del nitrato
Assimilazione dell’ammonio
Ammonificazione
5. Ciclo dell’azoto
Immobilizzazione
Esclusa l'atmosfera, l'azoto è presente quasi esclusivamente in forma
ridotta e viene incorporato come ammonio nelle proteine, negli acidi nucleici
e negli altri composti organici nelle cellule degli organismi viventi.
Anche le riserve di azoto nel suolo sono nella forma ammoniacale:
come sostanza organica (residui vegetali e animali o fertilizzanti)
come forma minerale adsorbita sulle rocce, fillosilicati in grado
di legare gli ioni ammonio.
Nel suolo esiste un ciclo interno, distinto dal ciclo complessivo, che porta
all'interscambio di azoto inorganico (NO3- e NH4+) con quello organico.
Mineralizzazione
Azoto
organico
NH4+
NO3-
Immobilizzazione
Assimilazione riduttiva del nitrato
Biomassa
(-3) N
N2
(+1) N2O
Biomassa
(-3) N
(+2) NO
(+5)NO3
(-3) NH3
(-1) NH2OH
(+3)NO2
(+5) NO3
Le piante assorbono solo
ioni nitrato e ammonio
La scelta dipende dalla specie
vegetale, dalla temperatura e
dal pH della soluzione
circolante nel terreno perchè:
nitrati (ione-) in soluzione
ammonio (ione+) "fissato" sull’argilla
più disponibili
meno disponibile
La riduzione del nitrato avviene in due stadi ad opera di due enzimi specifici:
nitrato riduttasi
molibdo-flavo proteina che catalizza il trasferimento
di elettroni per la riduzione del nitrato a nitrito
nitrito riduttasi
ferro-zolfo proteina che riduce il nitrito ad ammonio
utilizzando come donatore di elettroni la ferridossina
ridotta, generata dalla fotosintesi
Struttura e funzione degli enzimi
1. Gli enzimi (catalizzatori biologici)
sono proteine globose, formate da più
sub-unità.
Presentano uno o più siti attivi dove
avviene il legame con il substrato che
Substrato
innesca la reazione.
Siti attivi
Prodotti di
reazione
*
*
*
*
Enzima
2. La perfetta complementarietà tra
enzima e substrato garantisce la
specificità.
1
2
3
3. Al termine l’enzima è inalterato
e pronto per catalizzare un'altra
reazione.
La nitrato riduttasi è un complesso enzimatico che ha la funzione di
catalizzare il trasferimento di 2 elettroni dal NAD(P)H2 (piridin-nucleotide,
donatore di elettroni) al nitrato (+5) che si riduce a nitrito (+3)
NADPH2
NADP+
FAD
HNO3 + 2e- + 2H+
Citocromo
Mo
NO3 NO2 -
HNO2 + H2O
E’ costituito da due parti non separabili fisicamente:
una contiene il FAD (Flavin adenin dinucleotide) ed ha il sito attivo per il NAD(P)H
una contiene Molibdeno e porta il sito attivo per il nitrato
Porta associato anche un citocromo
Il FAD, il citocromo e il molibdeno formano una catena di trasporto attraverso la
quale gli elettroni sottratti al NAD(P)H arrivano al nitrato che si riduce a nitrito
Il molibdeno è un elemento indispensabile per le piante
Assimilazione dell’ammonio
N2
(+1) N2O
Biomassa
(-3) N
(+2) NO
(+5)NO3
(-3) NH3
Biomassa
(-3) N
(-3) NH3
(-1) NH2OH
(+3)NO2
L’assimilazione avviene attraverso reazioni catalizzate da diversi enzimi:
Aminazione: trasferimento di NH4+ a chetoacidi
amminoacidi
Transaminazione: trasferimento del gruppo amminico (NH2-) da un amminoacido
a un chetoacido
Gli amminoacidi sono molto più numerosi dei 20 costituenti principali delle proteine
Gli animali ne formano solo 8;
nelle piante ne sono stati isolati oltre 50 liberi
H
R
5. Ciclo dell’azoto
Mineralizzazione
La mineralizzazione è il processo di degradazione operato dagli organismi
decompositori che porta alla formazione di azoto minerale nitrico e
ammoniacale, detti “azoto scambiabile”
Nel suolo è in equilibrio con l’immobilizzazione che è la simultanea sintesi di
nuova biomassa
L’azoto potenzialmente mineralizzabile è l'8-15% dell'azoto totale
Il contenuto varia con il tempo, da sito a sito e in funzione della temperatura,
del pH, dell'ossigenazione, delle condizioni idriche, della vitalità della biomassa,
del tipo di sostanza organica, ecc.
Anche le più comuni pratiche agricole influenzano le trasformazioni dell'azoto
organico: lavorazioni del terreno, irrigazione, fertilizzazione, tipo di coltura
Processo molto lento: 1) le proteine formano complessi con i costituenti poco
degradabili dell'humus, per esempio la lignina e formano ligno-proteine,
2) le proteine vengono intrappolate e trattenute nell'argilla
Difficile e complesso valutare il potere di mineralizzazione di un suolo
Ammonificazione
-
Prima fase della mineralizzazione
N2
(+1) N2O
Biomassa
(-3) N
(+2) NO
(+5)NO3
(-3) NH3
Biomassa
(-3) N
(-3) NH3
(-1) NH2OH
(+3)NO2
Microrganismi eterotrofi decompositori:
batteri, funghi, attinomiceti (105-107/g)
In serie, per mezzo di enzimi extracellulari,
arrivano a liberare NH3 con due processi
Ammonificazione: proteolisi aerobica di proteine e acidi nucleici con formazione
di amminoacidi e basi
Putrefazione: decomposizione anaerobica delle proteine con formazione di ammine
e altri composti organici volatili
Nitrificazione
N2
(+1) N2O
Biomassa
(-3) N
(+2) NO
(-3) NH3
(+5)NO3
(-3) NH3
(-1) NH2OH
-
(+5)NO3
(-1) NH2OH
-
(+3)NO2
(+3)NO2
Ossidazione dell’ammonio a ione nitrico in due fasi per opera di
batteri aerobi chemiolitotrofi obbligati
NH4+
NO2-
Nitrosomonas
Nitrosococcus
Nitrosospira
NO2-
NO3-
Nitrobacter
Nitrococcus
Nitrospira
Le reazioni liberano
notevoli quantità di
energia, utilizzata per
le biosintesi cellulari
Denitrificazione o dissimulazione riduttiva del nitrato
N2
N2
(+1) N2O
(+1) N2O
Biomassa
(-3) N
(+5) NO3
(-3) NH3
(+2) NO
(+2) NO
(+5)NO3
(-1) NH2OH
(+3)NO2
Tre meccanismi chimici
dipendono dal pH
(+3) NO2
L’azoto nitrico viene
ridotto ed allontanato
in forma gassosa con
diversi meccanismi
La via microbiologica
è la più importante:
produce N2 e N2O
volatilizzazione diretta dell’ammoniaca
pH 7
decomposizione spontanea dei nitriti
con emissione di ossidi di azoto
pH 5,5
reazioni spontanee di acido nitroso con
amminoacidi o sali di ammonio ed emissione
di N2
La denitrificazione microbiologica è, idealmente, l’inverso della nitrificazione
Avviene nel suolo e nelle acque in ambiente riducente, cioè privo di ossigeno
che è il fattore principale di controllo di questo processo
Anche in suoli dotati di buona aerazione si possono trovare, all’interno degli
aggregati, micrositi ad alta attività denitrificante
E’ una respirazione anaerobica che utilizza il nitrato come accettore di elettroni
Soltanto alcuni batteri chemioeterotrofi anaerobi facoltativi,
Pseudomonas e Bacillus, sono capaci di compiere questo tipo di respirazione
che ha come risultato l’emissione e non l’assimilazione di N2
La reazione globale, catalizzata dalla nitrato riduttasi, è
2 HNO3 + 10 H+ + 10 e-
N2 + 6 H2O
il trasporto degli elettroni avviene attraverso la catena dei citocromi
Pseudomonas
fluorescens
Bacillus cereus
5. Ciclo dell’azoto
Azotofissazione
La fissazione biologica è il processo più importante attraverso il quale l'azoto
molecolare inorganico viene ridotto e fissato in una forma molecolare organica
Per questa via viene inserito nel processo di mineralizzazione-immobilizzazione e
messo a disposizione degli organismi produttori e di conseguenza di tutti gli altri
Fissazione industriale
(processo Haber-Bosch)
N2 + 3 H2
2NH3
Fissazione biologica
Necessita anch’essa di molta energia
e di un catalizzatore
* Alta temperatura (300-600°C)
* Temperatura ( 30°C)
* Alta pressione (200-800 atm)
* Pressione normale
* Catalizzatore: miscela Fe-Mo
* Nitrogenasi: Mo-Fe proteina
* Resa 20-40% di NH3
* Varia con condizioni ambientali
* Produzione 70 milioni di t annue
* Produzione 200 milioni di t annue
* Alto inquinamento ( 50% perso)
* Arricchimento naturale del suolo
* Alti costi
* Pronta disponibilità
I microrganismi capaci di fissare l'azoto atmosferico sono detti
azotofissatori o diazotrofi. Appartengono ad alcune famiglie di batteri e di
Cianoficee (alghe verdi-azzurre). Possono essere
Rizosfera
Attività bassa
Liberi
Aerobi
Anaerobi
Azotobacter
Beijerinckia
Derxia
Spirillum
Enterobacter
Klebsiella
Clostridium
Desulfovibrio
Chlorobium
o
Simbionti
Batteri
Rhizobium
Actinomyces
Frankia
Tubercoli radicali
Attività alta
Cianoficee
Nostoc
Anabaena
Nitrogenasi e suo meccanismo di azione
La nitrogenasi, enzima responsabile dell’ azotofissazione biologica, è un complesso
enzimatico costituito da due proteine distinte, indispensabili:
la dinitrogenasi riduttasi, una ferro-proteina formata da due subunità identiche contenenti
4 atomi di Fe e 4 di S
la dinitrogenasi, una molibdo-ferro-proteina formata da 4 subunità contenenti 2 atomi di
molibdeno, 21-35 atomi di Fe e 18-24 gruppi SH
NADH
Mg-ATP
Ferridossina
ridotta
Mg-ADP+Pi
N2
NAD+
Fe-proteina
Ferridossina
ossidata
e-
Mo-Fe-proteina
2NH3
Una serie di reazioni riduce l'azoto ad ammoniaca attraverso trasferimenti di elettroni.
Il primo trasferimento alla Fe-proteina avviene con un flusso casuale mentre in seguito essa
li trasferisce singolarmente alla Mo-Fe-proteina. Ciò deve essere ripetuto più volte affinché
la Mo-Fe-proteina sia in uno stato sufficientemente ridotto, da consentirle di ridurre l’ N2
Proprietà della nitrogenasi
Nel 1966 si è scoperto che la nitrogenasi agisce anche riducendo l’acetilene
ad etilene, rompendo uno dei tre legami tra gli atomi di Carbonio.
HC CH H2C CH2
(1)
N N HN NH
(2)
Basandosi sul dosaggio gascromatografico della riduzione dell’acetilene (reazione 1)
è stato possibile caratterizzare la nitrogenasi e valutare la quantità di azoto
fissato (reazione 2)
Le due proteine componenti
della nitrogenasi vengono
inattivate dall’ossigeno
Gli azotofissatori aerobi attuano diversi
meccanismi fisiologici per proteggere la
nitrogenasi dal danno da ossigeno:
Controllo genetico
Microaerofilia
La capacità di ridurre l’azoto
è molto più diffusa tra i
microrganismi anaerobi
Protezione respiratoria
Protezione conformazionale
Barriere fisiche
Proteine specifiche
Azotofissazione simbiotica
L’azotofissazione (batteri) è accoppiata direttamente alla fotosintesi (piante)
La più nota è la simbiosi tra Rizobi e Leguminose
Batteri Gram-negativi,
aerobi, mobili,
di forma bastoncellare,
possono anche vivere
come eterotrofi nel
Neoformazioni radicali:
suolo: 102-104 per g
Noduli
Simbiosi specifica
Rizobi compatibili
Efficienza
Circa 600 generi e 18.000
specie, includono piante
arboree, arbustive, erbacee
ed anche acquatiche.
Un buon prato di trifoglio
arriva a fissare 100-400 Kg
di azoto per ettaro.
Certe Acacie tropicali
possono fissare fino a
200 Kg/ha/anno
Ciclo dei rizobi nel suolo
1) adesione dei rizobi ai peli radicali a
seguito di segnali molecolari tra pianta
e ospite: induzione geni nod
Bastoncini
mobili
Batteroidi
(5)
(1)
2) incurvamento dei peli radicali
Cocchi
(8)
immobili
3) inizio e sviluppo del filo di infezione
4) rilascio e moltiplicazione dei batteri,
avvolti dalla membrana, all'interno delle
cellule corticali dell'ospite
Rhizobium
Pelo radicale
5) trasformazione dei batteri in
batteroidi, 10 volte più grandi, che
non si dividono
2
Formazione del tubo d’infezione
6) sintesi della leg-emoglobina nel
citoplasma della cellula vegetale
Noduli
7) sintesi della nitrogenasi (geni nif)
e fissazione dell'azoto
8) degenerazione del nodulo e
liberazione dei rizobi nel terreno
dove riprendono la forma di cocchi
Infezione
del pelo radicale
1
7-8
5-6
3
4
Processo di infezione e
formazione dei noduli
Scomposizione del ciclo dell’azoto
Si può immaginare di scomporre il
ciclo dell’azoto in tre sottocicli che
si svolgono in ambiti sempre più ampi
N organico
NH4+
3
2
1° - Flusso di ammonio tra suolo
e piante
N
organico
NH4+
riserve
1
NH4+
soluzione
1. Scambi di ammonio, nel suolo, tra riserve e soluzione circolante
2. Assimilazione degli ioni ammonio da parte dei vegetali
3. Restituzione al suolo dei residui vegetali
2° - Processi ossidoriduttivi
tra suolo e organismi viventi
N organico
NH4+
NO3-
1
2
N
organico
1. Assimilazione dei nitrati
3
NH4+
soluzione
NH4+
riserve
2. Deposizione al suolo dei residui vegetali
3. “Ammonificazione” = degradazione dei residui vegetali
4. Nitrificazione
4
NO3-
soluzione
3° - Processi ossidoriduttivi
tra suolo e atmosfera
N2
N organico
NH4+
NO3-
2
1
1. Azotofissazione
4
2. Denitrificazione
(3. Nitrificazione)
N
organico
NH4+
riserve
NH4+
soluzione
3
NO3soluzione
5. Ciclo dell’azoto
Analisi di attività batteriche
Dosaggio di proteine in una coltura batterica
Lowry et al. (1951)
Preparazione del materiale
Soluzioni
NaOH
1N
NaOH
0,1 N
Na2CO3
2% in NaOH 0,1 N
CuSO4•5H2O
1% in H2O distillata
Tartrato di sodio 2% in H2O distillata
o potassio
Prima di procedere al dosaggio delle proteine in
una coltura batterica è necessario disegnare su
carta millimetrata la curva di taratura utilizzando
g/ml proteine
una soluzione a concentrazione nota di Albumina
Idrolizzare i campioni nel modo seguente:
centrifugare per 20 minuti a 10000 giri/min 3 ml di coltura
batterica
risospendere il pellet in 3 ml di soluzione NaOH 1N
prelevare (in doppio) 1 ml della sospensione ottenuta e metterlo
in una provetta di vetro; chiudere ciascuna provetta con carta
d’alluminio
mettere le provette a bollire per 10 minuti
Proseguire con il metodo di Lowry per la determinazione delle proteine:
preparare la miscela di reazione nella quantità necessaria,
mescolando con le seguenti proporzioni le soluzioni:
Na2CO3
10 ml
CuSO4 5 H2O
0,1 ml
Tartrato di sodio o potassio
0,1 ml
prelevare dalle provette del campione bollito 0,8 ml e metterli in un’altra
provetta
aggiungere 4 ml della miscela di reazione
lasciare i campioni a temperatura ambiente per 15 minuti
aggiungere 0,4 ml di reagente Folin e mettere le provette al buio per 30 minuti
leggere l’assorbanza allo spettrofotometro ad una lunghezza
d’onda di 500 nm
valutare la quantità di proteine dei campioni
dalla curva di taratura
g/ml proteine
N.B. La lettura del campione allo spettrofotometro deve essere fatta
contro un bianco (H2O) sottoposto alle stesse reazioni del campione
Azotofissazione: saggio della riduzione dell’acetilene
Gascromatografia o cromatografia in fase gassosa
Tecnica di separazione di miscele
Fase stazionaria
Solido granulare poroso
riempie
la colonna
Gas
Fase mobile
fluisce attraverso
la colonna
I meccanismi di separazione sono due:
adsorbimento
Dipende dalla diversa forza dei
legami con cui le molecole del
campione sono trattenute sulla
superficie delle particelle solide
che riempiono la colonna
esclusione molecolare
Fase stazionaria costituita da solido
granulare poroso che trattiene le
molecole aventi ingombro inferiore al
diametro dei pori ed escludendo le
altre che vengono eluite con il gas di
trasporto
