allegato

Large Animals Review, Anno 10, n. 3, Giugno 2004
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MONICA GIAMMARIOLI, ANTONIO DE GIUSEPPE,
CLAUDIA PELLEGRINI, GIAN MARIO DE MIA
Istituto Zooprofilattico Sperimentale dell’Umbria e delle Marche - Via G. Salvemini, 1 - Perugia
Riassunto
Sono stati valutati due diversi metodi di reazione a catena della polimerasi (PCR) per differenziare ceppi vaccinali deleti da
virus wild-type (WT) della malattia di Aujeszky. È noto che la grande maggioranza di stipiti virali vaccinali correntemente usati
contiene una delezione a carico del gene gE, al contrario degli stipiti di virus WT. Sfruttando questa caratteristica, abbiamo valutato comparativamente le due diverse metodiche di PCR in grado di amplificare il gene gE e ne abbiamo determinato la specificità e la sensibilità sia da campioni patologici, sia da estratti di colture cellulari infette sottoposti a diluizioni logaritmiche. Il
metodo descritto da Jacobs e coll.4, leggermente modificato, è stato selezionato per le migliori performances evidenziate, soprattutto in termini di sensibilità. Riteniamo perciò che possa rappresentare un valido presidio diagnostico per la dimostrazione del genoma del virus Aujeszky WT. Inoltre potrebbe trovare un utile impiego anche per indagini epidemiologiche, per studi
sulla latenza virale e in caso di controversie di natura medico-legale.
Summary
Two different polymerase chain reaction (PCR) techniques for differentiating between vaccine deleted strains and wild-type
(WT) strains were evaluated. Most of the Aujeszky’s disease vaccines used currently contain glycoprotein E (gE) gene deletion, whereas WT typically Aujeszky’s viruses contain intact gE gene. Utilizing this difference, we evaluated comparatively the
two simple PCR approachs based upon the amplification of gE gene. The specificity and sensitivity of the two methods were
evaluated on host material and on ten-fold dilutions of DNA extracts from virus-infected cell cultures. The method described
by Jacobs et al.4 with slight modifications was selected on the basis of its sensitivity and specificity. Thus this method could
prove to be an useful diagnostic tool for genome detection of Aujeszky’s WT virus and suitable for epidemiological investigation, diagnostic differentiation, latency studies and forensic purposes.
INTRODUZIONE
La malattia di Aujeszky costituisce una delle infezioni
economicamente più rilevanti per l’allevamento suinicolo
ed è sostenuta da un virus appartenente alla famiglia herpesviridae. Il virus ha la proprietà, comune a tutti i virus
erpetici, di stabilire nell’ospite naturale infezioni latenti
che possono riattivarsi in condizioni sperimentali o naturali. Un gran numero di Paesi europei e non, ha da tempo intrapreso piani di eradicazione nei confronti di tale
malattia. In Italia, è attivo dal 1997 un piano nazionale di
controllo (Decreto 1 aprile 1997) volto essenzialmente ad
abbassare la prevalenza dell’infezione e basato sulla vaccinazione obbligatoria con vaccino deleto (gE-) in grado
di evocare anticorpi distinguibili da quelli indotti dal virus wild-type (WT). Sebbene la vaccinazione prevenga in
genere i segni clinici di malattia, non sembra invece impedire né la possibilità d’infezione con virus WT né la
trasmissione di questo ad altri soggetti. La diagnosi eziologica si basa essenzialmente sull’isolamento virale convenzionale o sulla reazione a catena della polimerasi
(PCR) che, rispetto alla prima, è da ritenersi una metodica non soltanto più rapida e meno indaginosa, ma soprattutto più sensibile, in special modo, nella diagnosi delle
infezioni latenti2,7,9,11. In letteratura sono riportati diversi
lavori sull’impiego della PCR per la diagnosi di Aujeszky1,5,8. In genere, le metodiche descritte si basano sull’amplificazione del gene che codifica per la proteina gB,
SUINI
EVIDENZIAZIONE DEL VIRUS
AUJESZKY WILD-TYPE MEDIANTE
REAZIONE A CATENA DELLA POLIMERASI (PCR)
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Evidenziazione del virus Aujeszky wild-type mediante reazione a catena della polimerasi (PCR)
in quanto molto conservata. In questi ultimi anni, con il
diffondersi dell’impiego dei vaccini deleti, si è anche optato per l’amplificazione del gene gE6,10 che avrebbe il
vantaggio di distinguere il virus Aujeszky WT da quello
vaccinale, nel caso in cui il vaccino impiegato presenti
una delezione a carico del gene gE.
Scopo del presente lavoro è stato quello di ottimizzare e
confrontare tra loro metodiche che consentano di evidenziare stipiti di virus Aujeszky WT differenziandoli da quelli vaccinali.
MATERIALI E METODI
Stipiti virali
Uno stipite di virus Aujeszky WT di recente isolamento
e lo stipite vaccinale Bartha K61 sono stati utilizzati per allestire e confrontare le performances di due diverse PCR
WT specifiche, in grado di differenziare i due virus.
Al fine di verificare la specificità delle prove in questione, in aggiunta ai virus sopracitati sono stati impiegati i virus erpetici della Rinotracheite infettiva del bovino
(BHV1) e della Rinopneumonite equina (EHV1).
La sensibilità delle singole prove è stata invece valutata
su diluizioni logaritmiche di DNA estratto da colture cellulari infettate con il virus Aujeszky WT e su analoghe diluizioni di DNA estratto invece da sospensioni d’organo
positive ottenute da materiale patologico.
PCR e analisi dei prodotti
I PCR: è stata applicato la PCR descritta da Scherba e
coll.10. Questa procedura utilizza una coppia di primers A e
B, specifici per il gene gE che dà luogo ad un frammento di
262 paia di basi. La PCR è stata condotta in 50 µl di volume finale contenente PCR buffer 10x (10 mM Tris-HCl pH
8.4, 50 mM KCl, 25 mM MgCl2), 40 mM di ciasun dNTP,
30 mM di ciascun primer, 1 U di Taq DNA polimerasi. Il
protocollo di amplificazione prevede 5 cicli di denaturazione a 94,5°C per 1 min., annealing a 47°C per 2 min., estensione a 72°C per 2 min., seguiti da 30 cicli di denaturazione
a 94,5°C per 1 min., annealing a 58°C per 1,5 min., estensione a 72°C per 2 min., II PCR: è stata applicata la PCR
descritta da Jacobs e coll.4, che utilizza la coppia di primers
Auj F e Auj R, specifici per il gene gE che amplificano un
frammento di 182 paia di basi del virus WT. La PCR è stata condotta in 50 µl di volume finale contenente PCR buffer 10x (10 mM Tris-HCl pH 8.4, 50 mM KCl, 1 mM MgCl2), 0,25 mM di ciasun dNTPs, 10% dimetilsulfossido
(DMSO), 10 ng di ciascun primer, 1 U di Taq DNA polimerasi. Il protocollo di amplificazione prevede 40 cicli di
denaturazione a 94°C per 1 min., annealing a 60°C per 1
min., estensione a 72°C per 1 min. In ogni prova sono stati
inseriti due controlli negativi rappresentati da un omogenato d’organo di suino normale e da H2O + DEPC.
I prodotti di PCR sono stati analizzati mediante gel di
agarosio al 2% con etidio bromuro (EtBr) in TBE buffer e
visualizzati mediante transilluminatore UV. L’esatta sequenza di ciascun primer utilizzato nelle tre PCR è riportata in Tabella 1.
Protocolli di estrazione
Sono state impiegate comparativamente tre diverse procedure al fine di valutare sensibilità del metodo ed anche
rapidità e facilità di esecuzione.
I metodo: a 200 µl del surnatante o della sospensione
d’organo sono stati aggiunti 2 volumi di soluzione di lisi
(isotiocianato di guanidina 4M, citrato di sodio 25mM
pH 7,0, sarcosyl 0,5%), addizionata dello 0,7% di βmercaptoetanolo, 2 volumi di fenolo/sevage (fenolo pH
8,0) e 100 µl di cloroformio. La sospensione così ottenuta è stata centrifugata a 13.000 r.p.m. per 15 min. e il
DNA è stato precipitato con 2 volumi di alcool etilico
assoluto freddo e 0,1 volumi di acetato di sodio 3M
pH 5,2.
II metodo: a 150 µl del surnatante o della sospensione
d’organo sono stati aggiunti 400 µl di isotiocianato di guanidina 6M, 400 µl di cloroformio saturo e 220 µl di NaCl
5M. I campioni sono stati centrifugati a 13.000 r.p.m. per
10 min. e quindi il DNA precipitato con 1 µl di glicogeno
(20 mg/ml) e 360 µl di etanolo assoluto.
III metodo: 40 µl di ciascuna sospensione sono stati
addizionati con 360 µl di PCR buffer (10 mM Tris-HCl,
50 mM KCl, 2,5 mM MgCl 2 , 0,45% Nonidet P40 e
0,45% Tween 20, pH 8,4) + 4 µl di proteinasi K (10
mg/ml), incubate a 55°C per 1h e sottoposte ad ebollizione per 10 min. Le cellule infettate sono state raccolte
al 50/60% di effetto citopatico, pellettate e contate.
6x106 cellule sono state risospese con lo stesso PCR buffer + 6 µl di proteinasi K (10 mg/ml) e processate come
sopra riportato.
RISULTATI
Come mostrato nella Figura 1A, la reazione ottenuta
con i primers AB amplifica un frammento di 262 paia di
basi dal solo virus Aujeszky WT e non dal virus vaccinale.
Analogamente, con la coppia di primers Auj F e Auj R, si
rileva una banda di 182 bp che è visibile con il solo virus
Aujeszky WT (Fig. 1B). Nessun amplificato è stato osservato con i virus BHV1 e EHV1, né con i controlli negativi.
In Tabella 2, sono riassunti i risultati di prove comparative effettuate con tre diverse procedure di estrazione a
partire da diluizioni scalari di virus da coltura e da materiale patologico. Ciascun estratto è stato analizzato con
due diverse PCR. Come si vede, i metodi di estrazione I e
III hanno dato luogo a performances migliori, in termini di
sensibilità, rispetto al metodo di estrazione II.
Tabella 1
Sequenza dei primers utilizzati nelle diverse PCR
Primer
I PCR
II PCR
Sequenza
A
TCC CAG CTC ACA ATG AAG TGG G
B
TCC GAG GAG CGG GAC GAT ACG T
Auj F
TGC GAC GCC TGG CGG TGA CCA
Auj R
ACG GTC AGG TGC GGC GAC CAC C
Large Animals Review, Anno 10, n. 3, Giugno 2004
Per quanto riguarda il confronto tra le due metodiche
di PCR, a partire dall’omogenato d’organo tal quale, la
PCR II ha evidenziato la presenza del virus da tutti e 12 i
campioni analizzati, mentre la PCR I solo da 11.
La sensibilità in vitro delle due PCR WT è stata valutata
analizzando diluizioni logaritmiche di DNA estratto da
colture infette e da omogenato d’organo. Come è mostrato
in Tabella 3, la PCR II è risultata essere almeno 100 volte
più sensibile rispetto alla PCR I nell’evidenziare il DNA
virale sia da coltura infetta, sia dalla sospensione d’organo,
quando associata al metodi di estrazione I o III.
Tabella 2
Confronto tra tre diverse procedure di estrazione
su diluizioni scalari di virus da coltura e da materiale patologico
262 bp
Protocolli
di estrazione
Coltura
infetta
Diluizioni
Metodo I
PCR I
PCR II
PCR I
PCR II
10-1
+
+
+
+
-2
+
+
+
+
-3
–
+
–
+
10
-4
–
+
–
+
10-5
–
+
–
–
-6
–
–
–
–
-1
+
+
+
+
10
-2
–
+
+
+
10-3
–
–
–
+
-4
–
–
–
–
-5
–
–
–
–
10
-6
–
–
–
–
10-1
+
+
+
+
-2
+
+
+
+
-3
+
+
–
+
10
-4
–
+
–
+
10-5
–
+
–
+
-6
–
–
–
–
10
Figura 1A
10
10
Metodo II
10
182 bp
10
10
Metodo III
10
Figura 1B
10
FIGURA 1A e 1B - Elettroforesi in gel di agarosio al 2% dei prodotti
di PCR. MW, peso molecolare; 1, virus della Rinotracheite infettiva
del bovino BHV1; 2, virus della Rinopneumonite equina EHV1; 3,
omogenato d’organo negativo; 4, H2O + DEPC; 5, virus Aujeszky
WT; 6, virus Aujeszky Bartha K61.
Sospensione
d’organo
10
Tabella 3
Valutazione della sensibilità delle due PCR wild-type specifiche su coltura infetta e su omogenato d’organo
10-1
10-2
10-3
10-4
10-5
10-6
10-7
10-8
10-9
10-10
+
+
+
–
–
–
–
–
–
–
PCR II
(Auj F/Auj R)
+
+
+
+
+
–
–
–
–
–
PCR I
(AB primer)
+
+
–
–
–
–
–
–
–
–
+
+
+
+
+
–
–
–
–
–
PCR I
(AB primer)
Coltura
Omogenato
PCR II
(Auj F/Auj R)
SUINI
Tutti e tre i metodi sono di facile esecuzione, ma il metodo III risulta vantaggioso in termini di tempo, richiedendo appena 1,45 h invece delle 2,45 h e 3,00 h rispettivamente, necessarie per i metodi I e II. Il metodo III presenta inoltre indiscutibili vantaggi per la sicurezza degli operatori non richiedendo l’impiego di sostanze pericolose
(DLgs 52/97).
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40
Evidenziazione del virus Aujeszky wild-type mediante reazione a catena della polimerasi (PCR)
CONCLUSIONI
L’impiego di vaccini marker nei confronti della malattia
di Aujeszky è attualmente sempre più diffuso. Infatti, la
possibilità di distinguere gli anticorpi indotti dal virus
wild-type da quelli vaccinali, è di fondamentale importanza ai fini del controllo della malattia e, in special modo,
nell’ottica di una strategia di eradicazione. Nella pratica
comune, i vaccini che corrispondono a queste caratteristiche, sono in genere i vaccini deleti e, tra questi, quelli che
presentano una delezione a carico del gene gE, sono di
gran lunga i più usati, tanto che in Italia il loro impiego è
reso obbligatorio. Come detto, l’immunità indotta dal vaccino impedisce l’insorgenza dei segni clinici di malattia,
ma non garantisce dalla eventualità d’infezione da parte
del virus da strada, né tanto meno la trasmissione di questo ai soggetti vicini e, perfino, la possibilità di una trasmissione inter-specie4. Ciò complica in qualche modo la
diagnosi di questa malattia. Non è infrequente, ad esempio, l’evenienza di una concomitante presenza dei due virus nello stesso soggetto.
Nel presente studio, abbiamo voluto considerare la possibilità di applicazione di una metodica molecolare in grado di differenziare le due situazioni. Abbiamo, in primo
luogo ottimizzato le condizioni di estrazione del campione
patologico e le condizioni di amplificazione di due metodiche wild-type specifiche aventi per target il gene gE e,
successivamente, le abbiamo messe a confronto. La metodica di estrazione III è rilsultata sensibile, rapida, e di facile esecuzione ed è pertanto da preferire anche perché più
sicura per l’operatore. La PCR II, oltre a evidenziare correttamente tutte le sospensioni d’organo analizzate, si è dimostrata 100 volte più sensibile della PCR I. È noto che il
virus Aujeszky ha un contenuto relativamente alto in basi
G+C che richiede condizioni di denaturazione più stringenti3. La presenza di cosolventi, come il DMSO nella miscela di reazione della PCR II, così come l’aumento della
temperatura di annealing intorno ai 60°C, hanno la capacità di aumentare l’efficienza dell’amplificazione. Ciò potrebbe giustificare le migliori performances offerte da questa prova.
Vale inoltre la pena sottolineare anche la elevata specificità dimostrata, non soltanto per non aver evidenziato il
ceppo Aujeszky vaccinale, ma anche per la totale assenza
di crossreattività nei confronti dei due virus erpetici del
bovino e dell’equino (BHV1 e EHV1). In conclusione,
riteniamo che il metodo da noi indicato sia senz’altro da
ritenersi vantaggioso non soltanto nei confronti dell’iso-
lamento virale convenzionale, ma anche nella prospettiva
di una diagnosi differenziale tra virus vaccinale e non.
Ciò troverebbe un utile impiego, oltre che per fini specificatamente diagnostici, anche per indagini epidemiologiche e, da ultimo, nel caso di implicazioni di natura medico-legale.
Parole chiave
Malattia di Aujeszky, virus Aujeszky wild-type, PCR differenziale.
Key words
Aujeszky’s disease, Aujeszky wild-type virus, differential
PCR.
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