Il ciclo cellulare
e
la sua regolazione
Le cellule possono essere classificate in base alla loro capacità
di crescere e di dividersi:
•Cellule che hanno perso la capacità di dividersi (cellule
neuronali, globuli rossi)
•Cellule che normalmente non si dividono ma che possono essere
indotte a dividersi (cellule epatiche)
•Cellule che continuano a dividersi (oogoni, spermatogoni, cell.
epiteliali, cell. staminali)
•La durata del ciclo cellulare è variabile da 30 minuti a diversi
mesi
Esperimenti che hanno consentito
la comprensione dei meccanismi
del ciclo cellulare noti:
•Esperimenti di fusione cellulare
•Esperimenti con i lieviti
•Esperimenti con uova di Xenopus
•Esperimenti con embrioni di riccio di mare
CICLO CELLULARE
M
G2
G1
S
•Serie ordinata di eventi che porta alla divisione cellulare
•La durata del ciclo cellulare varia da cellula a cellula
•Una cellula si divide per permettere la riproduzione, per
l’accrescimento corporeo o per rimpiazzare altre cellule
• Il ciclo cellulare inizia con la divisione cellulare e termina con la
formazione di due cellule figlie
CONSIDERAZIONI GENERALI
SUL CICLO CELLULARE
•Di solito viene studiato su colture di cellule sincrone
•Così è facile determinare la lunghezza totale del ciclo
cellulare: tempo di generazione
•E’ sufficiente contare le cellule al microscopio e
determinare in quanto tempo la popolazione raddoppia di
numero
•Nelle cellule di mammifero in coltura 18-24 ore
%
Per determinare la lunghezza della fase S:
si espongono per breve tempo le cellule con 3H-timidina →
Autoradiografia → conta della frazione di cellule di
mammifero che presentano grani di argento: cellule che
erano in fase S → frazione (0,33) x lunghezza totale ciclo
= 6-8 ore
•La mitosi dura in genere 30-45 min (indice mitotico)
•La variazione totale della durata del ciclo cellulare
dipende dalla durata variabile della fase G1
Interfase
Per la maggior parte del tempo le cellule si trovano nella
fase di crescita che intercorre tra due divisioni, detta
interfase.
In questo periodo i costituenti cellulari vengono
sintetizzati e assemblati in modo continuativo.
La massa cellulare aumenta gradualmente fino al momento
della divisione.
Durante la fase S avviene la duplicazione del DNA.
Replicazione - trascrizione - traduzione
REPLICAZIONE
mRNA
Proteine
DNA
Regolazione a livello:
•Le elicasi
richiede:
•Trascrizionale
•le proteine che destabilizzano la doppia elica
•Post-trascrizionale
•le topoisomerasi
•Traduzionale
•una emielica stampo
•Post-traduzionale
•un innesco,necessario alla DNA polimerasi
•la primasi
•le DNA polimerasi (hanno anche att. esonucleasica)
•le ligasi
•i quattro desossiribonucleosidi trifosfati 5’
Esperimento di Meselson and Stahl
Repliconi multipli nel DNA eucariotico
Il
problema
della
replicazione delle estremità
dei cromosomi lineari.
Le molecole di DNA
lineare,
ad
ogni
replicazione, rischiano di
generare molecole figlie
sempre più corte.
Telomerasi
Ribozima
trascrittasi inversa
Sintetizza DNA su
stampo di RNA
Il suo RNA è usato come stampo
per riempire il vuoto lasciato dalla
rimozione dell’innesco
Telomerasi:
Negli
organismi multicellulari,
la telomerasi è attiva
quasi
esclusivamente
nelle c. germinali da cui
originano le uova e gli
spermatozoi.
La att. telomerasica è
presente anche nelle c.
tumorali.
I telomeri contengono 1001500 copie in tandem della
sequenza TTAGGG.
Schema generale del meccanismo di riparo
per excisione dei danni al DNA.
MITOSI
Processo di divisione nucleare in cui i cromosomi duplicati vengono
separati gli uni dagli altri fedelmente per dare origine a due nuclei
ognuno con una copia di ciascun cromosoma
•La mitosi è una divisione equazionale
•Le due cellule figlie generate sono geneticamente uguali fra di loro e
geneticamente uguali alla cellula madre
•Durante la mitosi la maggior parte delle attività metaboliche sono
ridotte, le cellule non rispondono agli stimoli esterni
La mitosi è in genere associata alla citocinesi = processo che comporta
la divisione del citoplasma in due parti più o meno uguali
Mitosi
Cambiamenti
della profase:
caratteristici
-Condensazione
della
cromatina in cromosomi
-Dissoluzione
membrana nucleare
della
-Cessazione della sintesi di
mRNA e rRNA
-Dispersione nel citoplasma
delle proteine nucleari
-Ristrutturazione
del
citoscheletro e formazione
del fuso mitotico
- Riduzione
proteica
della
sintesi
IN PARTICOLARE DURANTE LA PROFASE:
• Il DNA si condensa e i cromosomi divengono visibili come tali
(la condensazione del DNA richiede la fosforilazione di istoni e
di altre molecole, tra cui la condensina)
• Si forma il cinetocore a livello dei centromeri
• Le proteine della lamina vengono fosforilate e si
depolimerizzano; anche molte proteine del poro si fosforilano e
il poro si disaggrega: in tal modo l’involucro nucleare può
essere allontanato ad opera dei microtubuli; inoltre si perde la
connessione DNA-lamine
• I microtubuli si riorganizzano e contribuiscono a disaggregare
l’involucro nucleare (fosforilazione delle MAP: proteine associate ai microtubuli)
• I centrioli (centrosoma) iniziano ad allontanarsi verso i poli
• Il citoscheletro di actina si riorganizza (fosforilazione della
miosina e di altre proteine associate all’actina)
I microtubuli del cinetocore diventano via via più corti!
I microtubuli polari si allungano!
I microtubuli del cinetocore esercitano una forza di “trazione” che muove i
cromosomi verso il polo a cui sono attaccati i microtubuli.
La seconda forza tende a “spingere” i cromosomi allontanandoli dai poli del
fuso.
All’inizio dell’anafase, la regione centromerica di ciascun cromosoma si
divide in 2, consentendo ai 2 cromatidi fratelli appaiati di separasi e di
muoversi verso i poli opposti.
La topoisomerasi II è responsabile della divisione del centromero.
Motori mitotici. MT: microtubuli.
Nella citocinesi si divide il citoplasma: si forma un solco di clivaggio, dovuto a un
fascio di microfilamenti di actina → anello contrattile ⁄⁄ al solco.
I microfilamenti di actina interagiscono con la miosina (l’E è data dall’ATP)
Controllo del ciclo cellulare
Attivazione
dell’anafase e
della citocinesi
Uscita da M
Entrata in
M
M
G2
Attivazione
dell’apparato
mitotico
Formazione del
fuso mitotico
Completa
divisione
cellulare
G1
Replicazione del
DNA
S
Entrata
in S
Attivazione dei
meccanismi di
replicazione del
DNA
• I checkpoint assicurano che la cellula sia
competente, sia in grado cioè di passare allo stadio
successivo del ciclo cellulare
• Le proteine inibitorie di Cdk in G1 sono attivate dal
danno del DNA
• Lo stop delle cellule in G1 permette alla cellula di
riparare il DNA prima della replicazione
• Il blocco del ciclo cellulare rappresenta
meccanismo di protezione per la cellula
un
Esperimenti di fusione cellulare che dimostrano il ruolo di segnali
citoplasmatici nella regolazione del ciclo cell.
Evidenza sperimentale della esistenza di MPF.
Questa procedura fu utilizzata come saggio per identificare MPF e successivamente
per isolarlo.
Fluttuazione dei livelli di ciclina mitotica e dell’attività di MPF durante il ciclo cellulare.
Identificazione
della ciclina
nei primi stadi
embrionali di
riccio di mare
Dimostrazione che la ciclina deve essere neosintetizzata e demolita nel corso del ciclo
cellulare
Protein-chinasi attivate ciclicamente
• Fosforilazione attiva o inattiva proteine chiave per
l’inizio o la regolazione della replicazione del DNA,
della mitosi e della citocinesi
• Protein-chinasi controllano la fosforilazione,
Fosfatasi controllano la defosforilazione
• Protein-chinasi sono presenti in tutte le fasi del ciclo
cellulare ma sono solo attivate in determinate fasi
• Cicline si legano alle chinasi (protein chinasi ciclinadipendenti) e le attivano
• La concentrazione di cicline varia
cellulare
durante il ciclo
Complessi ciclina-CdK
CDK: proteinchinasi ciclina dipendente da 1 a 5.
Cicline A → F.
Ad ogni complesso ciclina/CdK corrisponde un gruppo ≠ di proteine
bersaglio alle quali CdK aggiungono Pi → promuovono o inibiscono
attività di proteine bersaglio.
Fosforilazione e defosforilazione nella attivazione
di un complesso CdK-ciclina.
MPF attivo fosforila:
1. Le lamine della lamina nucleare → depolarizzazione delle lamine
2. Compl.multiprot. (condensina) → superavvolgimenti DNA
3. Proteine associate ai microtubuli → assemblaggio fuso mitotico
Meccanismi di blocco del ciclo cellulare
•Produzione di proteine che inibiscono l’attività chinasica
del complesso Cdk-ciclina
•Blocco del meccanismo di replicazione del DNA
•Fattori di trascrizione che inibiscono l’attività di geni
fondamentali nel ciclo cellulare
Mutazioni a carico di questi geni danno origine
ad anomalie del ciclo cellulare -> Tumori
Profase: la
condensazione del DNA
il ruolo della
condensina
Modificazioni
della lamina
nucleare indotte
da MPF
Il complesso mitotico CdKciclina
(MPF)
contribuisce
all’attivazione del complesso
che
promuove
l’anafase
(complesso
multiproteico,
ubiquitina ligasi).
**
I meccanismi di check point controllano:
• l’attacco dei cromosomi al fuso
*
Il complesso CdK-ciclina G1 regola la progressione attraverso il punto di
restrizione fosforilando la proteina Rb.
Nel suo normale stato defosforilato, la proteina Rb lega il fattore
trascrizionale E2F inibendolo.
I complessi ciclina-CDK dei mammiferi
Il complesso ciclina E-CDK2 fosforila l’inibitore del
complesso ciclina-CDK di fase S , il quale viene così
degradato e
la fase S può iniziare
Le origini della replicazione:
• i complessi ciclina-CDK di fase S fosforilano il complesso di prereplicazione
• Si avvia la replicazione
• Perdurando la fosforilazione di alcune proteine, ai siti di
inizio non può riassemblarsi il complesso di prereplicazione
I meccanismi di check point controllano:
•Il completamento della replicazione
L’esistenza di questo check point è stato dimostrato trattando le cellule con inibitori
che impediscono il completamento della replicazione del DNA.
In tali condizioni, il passaggio finale di defosforilazione coinvolto nell’attivazione
del complesso Cdk-ciclina mitotico è bloccato attraverso una serie di eventi
indotti da proteine associate al DNA che si sta replicando.
La risultante assenza dell’attività MPF arresta il ciclo cellulare alla fine della fase
G2, finchè non sia completata la replicazione di tutto il DNA.
Solo dopo la mitosi si possono riassemblare i
complessi di pre-replicazione
Morte cellulare
Le cellule possono morire
attraverso due diversi
meccanismi:
la necrosi e l’apoptosi, una
serie di eventi programmati
geneticamente, che portano la
cellula all’auto-distruzione.
I meccanismi di
check point
controllano:
•I danni del DNA
Membrana del linfocita killer
p53, il guardiano del genoma
Nelle cellule, p53 può associarsi ad una proteina di 90kD, il
prodotto del’oncogene mdm-2, che è amplificato in molti tumori. Il
legame con mdm2 inattiva le funzioni di p53 (inibizione, avvio alla
distruzione,
sequestro
nel
nucleolo…)
Alti livelli di p53 (normale, non mutante) portano all’arresto del
ciclo cellulare e/o all’apoptosi.
Come fattore del checkpoint, la sua funzione equivale a quella del
gene fad9 del lievito.
Fattori di crescita
Molecole proteiche (presenti nel siero) che stimolano la divisione e la
crescita cellulare
Agiscono attraverso l’interazione con recettori della membrana
plasmatica, quindi agiscono solo su cellule bersaglio
I fattori di crescita possono indurre le cellule quiescenti (G0) a dividersi
Segnali mediati da fattori di crescita e via
di Ras.
6 : I complessi Cdk-ciclina che si formano
catalizzano la fosforilazione di Rb e quindi
inducono il passaggio da G1 a S.
Mutazioni che alterano la via di Ras sono
presenti frequentemente nelle cellule tumorali
(tumori del pancreas, colon, polmoni, vescica
e in 25-30% di tutti i casi del cancro
nell’uomo).
I fattori che attivano la crescita possono anche attivare la via di
segnalazione mediata da PI3-Akt
I fattori che inibiscono la crescita agiscono
inibendo le CdK.
TGF-β
β a seconda del tipo di cellula bersaglio può
avere sia funzione di stimolazione che inibizione
della crescita.
Quando agisce come inibitore, stimola una serie
di eventi in cui il recettore catalizza la fosforilazione
delle proteine Smad, ↑ la proteina p15 e p21,
inibitori delle Cdk che sopprimono la attività dei
complessi CdK-ciclina
→
si
blocca la
progressione del ciclo cellulare.
Cause del cancro
(mutazioni)
•Composti chimici
I cancerogeni hanno la caratteristica di
•Radiazioni ionizzanti
modificare il genoma, perché convertiti
•UV
in sostanze in grado di interagire con il DNA
I virus oncogeni trasformano le cellule che infettano dal momento che
portano dei geni i cui prodotti interferiscono con i controlli della crescita
cellulare. Sono responsabili solo di alcuni tumori umani; ma sono stati
molto utili per identificare i geni coinvolti nella tumorigenesi
•Virus a DNA= polioma virus, SV40, adenovirus
•Virus a RNA= retrovirus (HTLV-1) simili ad HIV
Es: Virus di Epstein-Barr = Linfoma di Burkit;
Virus dell’epatite B = Epatocarcinoma; HTLV-I = leucemia a cellule T.
• Oncosoppressori: geni che controllano la
proliferazione cellulare
– P53 (guardiano del genoma) controlla che
non ci siano danni al DNA, agisce fra G1 e
S e dopo la sintesi
– Rb (retinoblastoma) controlla il passaggio
da G1 a S e fa sì che questo avvenga solo
in presenza di appropriati segnali da parte
di fattori di crescita
Lo sviluppo di un tumore
necessita di più mutazioni
in geni coinvolti nel controllo
della proliferazione cellulare;
mutazioni ereditate in geni
oncosoppressori aumentano
il rischio di tumore.
• In presenza di un’alterazione dei meccanismi di controllo della crescita
cellulare si può avere una proliferazione incontrollata --> tumore
• I tumori vengono distinti in benigni e maligni in base alla loro capacità
di invadere altri tessuti e/o organi
• Tumori benigni: masse localizzate ben circoscritte che non invadono i
tessuti circostanti
• Tumori maligni: cellule tumorali che invadono i tessuti circostanti e
possono dare localizzazioni a distanza (metastasi)
Le mutazioni che inducono il cancro sono a carico di 3 classi di geni:
1. Oncogeni
2. Geni oncosoppressori
3. Geni di riparo danni DNA
Mutazioni di geni normali
1. Oncogeni: derivano
Altri sono introdotti da virus oncogeni
Gli oncogeni codificano per proteine che stimolano in modo eccessivo la
proliferazione cellulare.
Gli oncogeni derivano da proto-oncogeni.
Le mutazioni possono trasformare un gene normale, cioè PROTO-ONCOGENE,
in ONCOGENE:
a)
Mutazione puntiforme
b) Riarrangiamenti del DNA .
-
Delezioni
-
Scambi di sequenze tra proto-oncogene e i geni vicini
-
Virus oncogeni: inducono il tumore perché integrano una copia del DNA del loro genoma nel
cromosoma dell’ospite in una regione dove è localizzato un proto-oncogene
c) Amplificazione genica:
↑ di un numero di copie di un proto-oncogene
d) Traslocazione cromosomica (linfoma).
La maggioranza degli oncogeni codifica per componenti delle vie del segnale mediato da fattori di
crescita:
- PDGF alterato → continua autostimolazione
- Recettori (att. tirosina-chinasica costitutiva)
- Prot. G associata a membrana (RAS mutato che lega sempre GTP e non più GDP
- Proteine chinasi
- Fattori trascrizionali
- CdK-cicline
Eccezioni:
Oncogene Bcl-2 codifica per prot che blocca apoptosi. Una funzione dell’apoptosi è eliminare le
cellule con DNA danneggiato.
Se la prot Bcl-2 viene prodotta in eccesso blocca apoptosi → prolunga sopravvivenza di cellule con
danni DNA.
Un tumore può essere causato dalla perdita di 2) geni oncosoppressori che , in condizioni normali,
frenano la proliferazione cellulare:
- Gene Rb: assenza di proteine Rb funzionale, dovuta alla perdita o alterazione di entrambe le copie
del gene Rb
- Gene p53 e apoptosi
