Anno diciottesimo marzo 2013 OtticaFisiopatologica ® Guest Editorial Biologia Molecolare del Glaucoma: Ruolo dello Stress ossidativo nel segmento anteriore nel Glaucoma cronico ad angolo aperto - Prima parte Sergio C. SACCÀ1, Aldo VAGGE2, Alberto Izzotti3 Diparitmento Testa/Collo, Ospedale San Martino, Unità Oftalmologica, Genova Dipartmento di Neuroscienze, Oftalmologia & Genetica, Università di Genova, Clinica Oculistica, Università di Genova 3 Dipartmento di Scienza della Salute, Facoltà di Medicina, Università di Genova 1 2 Introduzione I glaucomi sono un gruppo di malattie oculari complesse ed eterogenee che rappresentano la seconda causa di cecità, che colpisce 75 milioni di persone nel mondo (Quigley 1999). La prevalenza di glaucoma aumenta con l’età (Friedman 2006) ed è ampiamente variabile nei diversi reports, con valori che oscillano da un minimo di 1,9% ad un massimo di 8,8% nella popolazione bianca ottantenne. Il glaucoma è una sindrome caratterizzata da una progressiva atrofia ottica derivante da un’apoptosi delle cellule ganglionari della retina (RGCs). Crescenti evidenze derivate da studi chimici e sperimentali dell’ultimo decennio hanno fortemente suggerito il ruolo patogenetico delle specie reattive all’ossigeno (ROS). I radicali liberi possono direttamente indurre la morte dei neuroni con un meccanismo basato su proteasi e fosfatasi che è distinto dall’apoptosi (Sèe e Leoffler 2001). Nel glaucoma i radicali liberi possono danneggiare il trabecolato (TM) (Saccà ed al 2005) mentre a livello del segmento posteriore dell’occhio elevate concentrazioni di radicali liberi nelle cellule gliali stimolano il processo apoptotico delle RGCs (Nakazawa 2006). Il danno finale neurologico si traduce in una progressiva morte delle RGCs, atrofia degli assoni, degenerazione estesa anche alla corteccia cerebrale (area visiva), fino ad arrivare alla caratteristica alterazione papillare ed irreversibile perdita della vista (Weber e Hartman 2005) (Yucel e al 2000). In aggiunta alla perdita delle cellule ganglionari, la maggior parte dei tipi di glaucomi sono caratterizzati da una elevata pressione intraoculare (IOP), che risulta essere il più importante fattore di rischio della malattia; anche se non sono ancora del tutto chiari quali siano gli eventi patogenetici che collegano la IOP con il fenotipo del glaucoma. In alcuni casi, il danno al trabecolato ha un evidente ruolo chiave nell’incrementare la IOP. 1.0 Anatomia funzionale La camera anteriore (CA) e posteriore dell’occhio è ricolma di umor acqueo (UA), un fluido trasparente caratterizzato da una composizione di ioni molto simile al plasma sanguigno e con due funzioni principali: procurare i nutrienti alle strutture dell’occhio (cornea, iride e cristallino) e mantenere la pressione intraoculare. Per tale motivo la CA dell’occhio può 11 Anno diciottesimo marzo 2013 Guest Editorial Biologia Molecolare del Glaucoma: ruolo dello stress ossidativo nel segmento anteriore nel glaucoma cronico ad angolo aperto - Prima parte fig. 1 12 Fig. 1 Schema del Trabecolato corneo sclerale e bene evidenti i suoi rapporti con gli altri tessuti della Camera anteriore. essere considerata come un compartimento vascolare molto specializzato le cui pareti interne sono composte dagli endoteli dell’iride, della cornea e del trabecolato (Brendt e O’Donnel 1999). L’UA è secreto dal corpo ciliare nella camera posteriore dell’occhio, non può attraversare il tessuto irideo integro e, attraverso la pupilla, arriva nella CA. La maggior parte di questo liquido entra nella cosiddetta ”via convenzionale del deflusso”; via composta dal trabecolato iridocorneale (TM), dal tessuto connettivo del tessuto juxtacanalicolare (JCT), ed infine dal rivestimento endoteliale delle pareti interne del canale di Schlemm. Da questo, poi, il flusso arriva ai vasi episclerali ed alle vene episclerali. Questa “via convenzionale” si distingue da quella “non convenzionale” detta via uveosclerale, perché quest’ultima si snoda attraverso la radice dell’iride, la faccia anteriore dei muscoli ciliari, tessuto connettivo interposto tra i fasci del muscolo ciliare ed infine nello spazio sovra coroideale (Fig. 1). Questo percorso permette un’uscita di acqueo inferiore al 10% del flusso totale in un occhio di un adulto (Gabelt e Kauffmann 1989). 1.1 Il Trabelcolato Il TM si trova nel limbus oculare tra la cornea e la sclera ed è costituito da lamelle di collageno interconnesse, chiamate travate trabecolari. Queste hanno un core di fibre collagene ed elastiche, ricoperte da cellule piatte adagiate su una membrana basale. Lo spazio tra le trabecole è riempito da una matrice extracellulare che viene attraversato dall’umor acqueo (Chen e Kadlubar 2007). Le trabecole, OtticaFisiopatologica ® Biologia Molecolare del Glaucoma: ruolo dello stress ossidativo nel segmento anteriore nel glaucoma cronico ad angolo aperto - Prima parte fig. 2 Fig. 2 Fotografia di microscopia elettronica a scansione del trabecolato sclerocorneale umano. (magnificazione 2000 X). La via di deflusso convenzionale consiste in lamelle trabecolari ricoperte da cellule trabecolari umane, davanti una zona a più alta resistenza formata da cellule del trabecolato juxtacanalicolare e la parete interna del canale di Schlemm. Questo tessuto ha proprietà morfologiche e funzionali implicate nella regolazione dell’efflusso di UA. Le cellule endoteliali trabecolari sembrano avere un ruolo di primo piano sull’efflusso dell’UA: probabilmente, la loro architettura tridimensionale e la ripartizione in trabecole aumenta notevolmente la superficie filtrante, la cui degenerazione, con conseguente riduzione della cellularità, provoca un aumento della IOP e glaucoma (Saccà e Izzotti 2008). inoltre, sono incapsulate da un singolo strato di cellule simil-endoteliali (Polansky ed Alvarado 1994). (Fig. 2). La regione del trabecolato più periferica, o regione cribrosa, non è costituita dalla tipica struttura a trama, ma piuttosto da parecchi strati di cellule che alcuni autori affermano essere immerse in una matrice/ materiale extracellulare lasso (Tian 2000). Studi istologici del POAG non hanno trovato una specifica zona “tappo” a livello della zona di deflusso, suggerendo piuttosto che possa essere determinata da un disordine della funzione cellulare fisiologica (Johnson e al 2005). Gli aspetti funzionali e morfologici delle vie di deflusso dell’acqueo non sono ancora stati del tutto compresi (Epstein e Roben 1991). Alcuni autori pensano che l'UA passi attraverso le strutture TM in maniera passiva (Freddo e Johnson 2008 - Tamm 2009) relegando il ruolo del TM a dei filtri passivi. Altri ancora pensano che il TM sia invece un tessuto che sia attivamente attraversato da un fluido attivo (Saccà 2005 - Alvarado 2005 ed al). In ogni caso il locus ad alta resistenza per l'efflusso di UA non è ancora stato determinato. Risultati sperimentali supportano che la zona a più alta resistenza presente sia nell'occhio sano che in quello glaucomatoso, dove comunque risulta aumentata, sia attribuibile alle pareti interne dell’endotelio, la sua membrana basale, JCT o la combinazione di tutti e tre i tessuti. 1.2 Il tessuto iuxtacanalicolare Il JCT è la regione del trabecolato posizionata tra le travate del trabecolato corneosclerale e la lamina basale della parete interna del canale di Schlemm (Fig. 3). La sua maggiore compattezza rispetto al trabecolato suggeriscono una significativa resistenza al deflusso, ma tale aspetto non è supportato da studi idrodinamici (Ethier ed al 1986 - Seiler and Wollensak 1985). Si è osservato piuttosto una minore presenza dei componenti dell’acido ialuronico nella matrice extracellulare (MEC) (Knepper 1996a) o una 13 Anno diciottesimo marzo 2013 Guest Editorial Biologia Molecolare del Glaucoma: ruolo dello stress ossidativo nel segmento anteriore nel glaucoma cronico ad angolo aperto - Prima parte fig. 3 14 Fig. 3 Schematica rappresentazione della via convenzionale in sezione trasversale, le frecce indicano la direzione del flusso. aumentata resistenza dovuta all’eccesso di accumulo di glicosaminoglicani (Knepper 1996b). Negli occhi umani è possibile che anche altri componenti della matrice extracellulare abbiano un ruolo importante nel contribuire ad una maggiore resistenza al deflusso. Parecchie proteine della MEC possono contribuire a modificazioni omeostatiche della resistenza al deflusso dell’UA, innalzando, sottoregolando (Vittal 2005) o abbassando le concentrazioni di lipidi ossidati a bassa densità e quindi stimolando la MEC a rimodellarsi (Bachem 1999). È interessante notare come una incrementata sintesi di fibronectina possa determinare un concomitante incremento di IOP (Fleenor ed al 2006). I fattori di crescita (TGFs) sono una famiglia di citochine che controllano la produzione di una grande varietà di geni MEC, inclusa l’elastina, il collagene, la fibrillina, laminina e la fibulina. Una delle sue isoforme, il TGF-ß2, è elevato nell’UA di occhi glaucomatosi (Tripathi 1994) ed altera il metabolismo dell’ECM (Wordinger 2007). Il TGF nell’UA è inoltre responsabile della deviazione immunitaria associata alla camera anteriore, un meccanismo che protegge l’occhio dalle infiammazioni e dai danni immuno-correlati ai tessuti (Wilbanks 1992). Infatti, il TGF-ß2 è una delle maggiori citochine immunosoppressive nella CA e ha un effetto fibrogenico nelle cellule trabecolari (Alexander 1998). Infine la produzione di ECM nel TM può essere mediata dalla vitamina C (Epstein et al 1990, Sawaguchi e al 1992). L’acido ascorbico si ritiene stimoli l’incremento della sintesi di acido ialuronico in cellule TM umane glaucomatose se comparato con cellule TM umane normali (Schachtschabel and Binninger 1993). Inoltre l’ascorbato riduce la viscosità dell’acido ialuronico, incrementando così il deflusso attraverso il trabecolato (McCarty 1998). Già nel 1966, un ricercatore italiano scoprì che alte dosi di vitamina C decrementano la IOP (Virno 1966). Altre molecole che sembrano avere un ruolo molto importante nel rimodellamento del collagene: le metalloproteinasi (MMPs), le quali sono una famiglia di endoproteasi extracellulari, calcio e zinco dipendenti, che degradano le proteine della ECM (Nagase and OtticaFisiopatologica ® Biologia Molecolare del Glaucoma: ruolo dello stress ossidativo nel segmento anteriore nel glaucoma cronico ad angolo aperto - Prima parte fig. 4 Fig. 4 Il passaggio dei liquidi dalla camera anteriore (AC) al canale di Schlemm (SC) attraverso il trabecolato (TM) è regolato dagli endoteli TM e SC che sono interdipendenti tra loro attraverso un sistema di citochine. 15 Woessner 1999). Le MMPs comprendono una famiglia di almeno 25 proteine che hanno grande importanza sia per il turnover dell’ECM, sia per le interazioni tra le cellule e le loro strutture circostanti (Sternlicht e Werb 2001). Un’incrementata attività dell’MMPs diminuisce la deposizione di collagene, aumentando cosí il deflusso dell’UA (Saccà e Izzotti 2008). Non è chiaro come le specifiche molecole dell’ECM siano coinvolte nella generazione di questa resistenza (Overby e al 1998). In ogni caso il turnover dell’EMC è indispensabile per il mantenimento di un appropriata resistenza al deflusso (Bradley et al 1998). Per analogia con le altre membrane basali nel corpo, la parete interna della membrana basale ha la potenzialità di generare una significativa porzione di resistenza al deflusso. Questa non è costante e può essere correlata al flusso dell’UA dentro il canale di Schlemm (Buller and Johnson, 1994). La resistenza di questo tessuto sembra essere sostanzialmente limitata (Overby et al 2009). Sulla base degli studi al microscopio elettronico è stato proposto che l’umore acqueo possa attraversare le pareti interne dell’endotelio del canale di Schlemm con due meccanismi differenti: un percorso paracellulare attraverso le giunzioni formate tra le cellule endoteliali (Epstein and Rohen 1991) ed un percorso transcellulare attraverso pori intracellulari delle cellule stesse (Johnson ed Erickson 2000). I pori del trabecolato, tuttavia contribuiscono solo al 10% della resistenza del deflusso acquoso (Sit e al 1997). Inoltre le caratteristiche dei pori delle pareti interne dipendono dalle condizioni di fissazione. In particolare la densità dei pori delle pareti interne aumenta con il volume di fissativo perfuso attraverso la via di deflusso (Johnson e al 2002). Infine, Scott e altri (2009) forniscono la conferma che la parete interna e il sottostante tessuto connettivo iuxtacanalicolare lavorano insieme per regolare la resistenza al deflusso. 1.3. Le cellule endoteliali trabecolari Secondo Alvarado nella via di deflusso convenzionale dell'umore acqueo ci sono due barriere di cellule endoteliali che separano la circolazione venosa da quella Anno diciottesimo marzo 2013 Guest Editorial Biologia Molecolare del Glaucoma: ruolo dello stress ossidativo nel segmento anteriore nel glaucoma cronico ad angolo aperto - Prima parte 16 "acquosa" che sono specializzate e posizionate in serie: le cellule del trabecolato endoteliale (TME) e, successivamente, le cellule endoteliali che formano la cavità del canale di Schlemm (SCE) (Fig. 4). Tra queste due barriere c’è il tessuto iuxtacanalicolare che contiene una matrice extracellulare lassa attraverso cui l’UA scorre (Alvarado e al 2004). Le cellule TME rilasciano fattori nell’UA e queste molecole di derivazione dalle cellule del TME, si associano tra loro e regolano attivamente la proprietà di permeabilizzazione delle cellule del SCE. Questi fattori, dopo il legame alle cellule SCE, ne incrementano la loro permeabilità (Alvarado 2005a), inducendo un aumento del 400% di conducibilità grazie all’attivazione di specifici geni TME (Alvarado 2005b). In particolare l’interleuchina-1α e 1β ed il TNFα rilasciato dalle cellule TME induce divisioni e migrazione (Bradley e al 2000) delle cellule vicine alla linea di Schwalbe, mentre introducendo il rilascio delle metalloproteinasi della matrice (Kelley e al 2007) si ottiene un incremento del flusso di acqueo attraverso la matrice del tessuto extracellulare vicino le JCT (Alvarado e al 2005b). In una ricerca condotta dal nostro gruppo, si è dimostrato che le alterazioni delle molecole dell’umore acqueo sono implicate nella patogenesi del glaucoma (Izzotti e al 2010a). È stata analizzata l’espressione di 1264 proteine ed è stato rilevato un cambiamento straordinario nella componente proteica dell’UA dei pazienti glaucomatosi rispetto ai non affetti. Tra le altre, le citochine descritte da Alvarado e rilasciate dal TME che regolano la permeabilità della barriera SCE in maniera attiva (Alvarado e al 2005b), sono espresse maggiormente rispetto ai controlli, probabilmente perché queste sono prodotte per migliorare l’attività del TM, ed in caso di glaucoma, essendo il TM mal funzionante, si verifica una iper-espressione di tali citochine nel tentativo di farlo funzionare meglio. Il volume delle cellule TM influenza anche la permeabilità del tessuto; infatti le soluzioni iperosmotiche incrementano e le soluzione ipoosmotiche diminuiscono la facilità di deflusso (Al-Aswad e al 1998; Gual e al 1997). I meccanismi molecolari che regolano il bilanciamento dell’acqua in molti tessuti sono sconosciuti, ma le cellule del TM esprimono l’acquaporina-1, una proteina che facilita il flusso delle molecole d'acqua all'interno o all'esterno delle cellule mediante canali che trasportano acqua attraverso membrane e che in ultimo possono modulare il volume cellulare (Stamer e al 2001). Le acquaporine, inoltre, favoriscono la migrazione cellulare (Verkman 2005), la proliferazione cellulare, la neuroeccitazione, il metabolismo dei grassi, l'idratazione ed altre funzioni cellulari (Tradtrantip e al 2009). L’acquaporina può essere implicata nella patogenesi della neuropatia ottica glaucomatosa, infatti nei modelli animali un’elevata IOP riduce la sua espressione (Naka e al 2010). In ogni caso, una lesione cronica dovuta allo stress cellulare è un aspetto comune nelle patogenesi di diverse malattie inclusa l’arteriosclerosi, le glomerulonefriti e le fibrosi polmonari (Dunn 1991; Ross 1995). In corso di glaucoma, il danno delle vie di deflusso si sviluppa, come il risultato dello stress ossidativo di derivazione ambientale, o per la disregolazione vascolare, oppure per l’invecchiamento e/o per processi patogeni (Flammer et al 1999). I cambiamenti molecolari nelle cellule sopravvissute determinano l’espressione di nuovi geni (Dunn 1991; Ross 1995) in OtticaFisiopatologica ® Biologia Molecolare del Glaucoma: ruolo dello stress ossidativo nel segmento anteriore nel glaucoma cronico ad angolo aperto - Prima parte dipendenza dalla natura dello stimolo patogeno e dal tipo di tessuto (Mercurio e Manning 1999; Itoh e Nakao 1999). Gli occhi glaucomatosi presentano un’alta perdita di cellule TM, maggiore o uguale ai controlli di pari età (Alvarado e al 1984). Nell’uomo, la diminuzione cellulare del TM è direttamente collegata all’età (Alvarado e al 1984). Grierson ha calcolato che all’età di 20 anni le cellule trabecolari sono circa 763000 (Grierson e Howes 1987) ed il numero di cellule scende a 403000 all’età di 80 anni, con una perdita annuale di circa 6000 unità (Grierson e al 1982). Il meccanismo di perdita cellulare ed i fattori ambientali che lo regolamentano non sono ancora conosciuti. Tuttavia questo fenomeno può essere determinato dalla morte cellulare causata da un insulto nocivo, come un attacco di radicali liberi (Yan e al 1991; Padgaonkar e al 1994). Nella CA i radicali liberi e le lipoproteine ossidate vengono considerati la maggiore causa dello stress tessutale e fungono da segnale locale per l’infiammazione dei tessuti (Xu e al 2009). La sopraregolazione di una gran numero dei geni infiammatori, inclusi i geni coinvolti nell'attivazione del complemento e nella produzione di citochine/ chemochine infiammatorie determinano, a loro volta, anomalie nella interazione leucociti endotelio ed infine danni vascolari (Xu e al 2009). Inoltre il sistema immunitario in generale ed i monociti in particolare, giocano un ruolo chiave nell'omeostasi del deflusso acqueo: normalmente, presumibilmente sotto l'influenza di segnali chemiotattici, le citochine e i monociti circolanti attraverso il trabecolato, regolano la permeabilità delle cellule endoteliali del canale di Schlemm (Shifera e al 2010) ed i monociti aumentano il deflusso dell’ acqueo (Alvarado e al 2010). Questo meccanismo è più facile da comprendere se pensiamo alla CA come ad un vaso, e il suo endotelio come a quello di un vaso specializzato nel quale scorre l'UA; l'endotelio di questo vaso è dato oltre che da quello corneale ed irideo da quello del TM la cui complessa struttura rappresenta il sistema per incrementare l'area di contatto tra le cellule TME e l'UA. Inoltre il TM è composto da elementi contrattili che aiutano a regolare la facilità del deflusso (Wiederholt e al 2000). Quindi aprendo (come un ventaglio) e velocizzando le sue aperture, il TM può variare la quantità di cellule coinvolte nel passaggio di UA dalla CA al CS. Il suo malfunzionamento può portare così ad un aumento della pressione intraoculare. Infine è necessario ricordare che questo flusso di fluido non è uguale all'interno del trabecolato e che esistono delle vie preferenziali a minore resistenza (De Kater e al 1989; Tripathi 1971). Uno dei fattori che contribuiscono al flusso preferenziale potrebbe essere dato dai cambiamenti della matrice extracellulare e le sue interazioni con le cellule del canale di Schlemm nelle regioni dei canali collettori. Quando i canali collettori si alterano a causa dell’età o di una malattia, altri canali si rendono disponibili per assumere il loro carico funzionale (Hann e Fausch 2009). BIBLIOGRAFIA - Al-Aswad LA, Gong H, Lee D, O’Donnell ME et al. Effects of Na-K-2Cl cotransport regulators on outflow facility in calf and human eyes in vitro. Invest Ophthalmol Vis Sci 40: 1695-1701, 1999 - Alexander JP, Fish AS, Samples JR, Acott TS. Effect of matrix metalloproteinases activity on 17 Anno diciottesimo marzo 2013 Guest Editorial Biologia Molecolare del Glaucoma: ruolo dello stress ossidativo nel segmento anteriore nel glaucoma cronico ad angolo aperto - Prima parte 18 outflow in perfused human organ culture. 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