Un punto di incontro tra medicina e agricoltura: il "Molecular

UN PUNTO DI INCONTRO
TRA MEDICINA E AGRICOLTURA:
IL “MOLECULAR PHARMING”
di Luana Ilarioni *
With the concept of “Molecular
Pharming” we refer to the production,
through the use of vegetal systems, of
medical and other substances with a high
biological value. This approach could
prove to be a valid alternative also to
chemical synthesis. If the use of plants
for healing purposes is an old practice, the
impulse given to “Molecular Pharming”
is quite near our age due to the growing
intervention by the pharmaceutical
industry in the improvement in the
production of medicines. This last kind
of production guarantees a better
synthesis of high standard products
without pathogens, which could prove
dangerous for the health of men, as well
as low costs at the same time.
L’
uso delle piante a scopi curativi è una pratica comune da
migliaia di anni; vegetali che contengono nei loro tessuti
sostanze utili, vengono ancora oggi impiegati come pro__________________
* Dottore in Scienze e Tecnologie dei Sistemi Colturali
Anno I - n. 3
Con “Molecular Pharming” si intende
la produzione di sostanze medicinali o di
altre sostanze ad alto valore biologico presenti nelle piante utilizzando sistemi vegetali. Questo approccio potrebbe rivelarsi
valida alternativa anche alla sintesi chimica. Se è antica la pratica dell’uso delle
piante a scopi curativi, è relativamente più
vicino a noi nel tempo il forte impulso
dato al “Molecular Pharming”, dovuto al
crescente intervento dell’industria farmaceutica per la messa a punto di sistemi
innovativi relativi alla produzione di farmaci. Questo tipo di produzione garantisce la sintesi di prodotti di qualità elevata
e privi di patogeni pericolosi per la salute
dell’uomo, e nel contempo costi di produzione contenuti.
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dotti farmaceutici attraverso processi di purificazione o di eventuale
modifica chimica.
Il crescente interesse dell’industria farmaceutica per la messa a
punto di sistemi innovativi relativi alla produzione di farmaci ha dato
un forte impulso al cosiddetto Molecular Pharming. Con tale termine si
intende la produzione di sostanze medicinali o di altre sostanze ad alto
valore biologico nelle piante.
Le cellule vegetali sono infatti in grado di sintetizzare proteine strutturalmente e funzionalmente equiparabili a quelle prodotte dalle cellule di mammiferi, garantendo la sintesi di un prodotto di qualità elevata
e contemporaneamente privo di patogeni pericolosi per la salute umana
(vedi Tabella 1).
Anche dal punto di vista economico, le piante presentano vantaggi significativi. La coltivazione di piante per la produzione di biofarmaci non richiede, infatti, accorgimenti particolari (se non quelli legati allo sconfinamento delle piante stesse per motivi di sicurezza
ambientale e di qualità del prodotto) e garantisce, pertanto, costi di
produzione decisamente più contenuti rispetto agli altri sistemi di
espressione.
Inoltre se si opera in modo che il prodotto di interesse venga sintetizzato in tessuti di accumulo, come tuberi o semi, è possibile conservarlo e trasportarlo a temperatura ambiente risparmiando sui costi di
mantenimento della “catena del freddo”.
Un altro interessante vantaggio derivante dall’impiego dei sistemi
vegetali consiste nel fatto che, se viene scelta una pianta edibile come
sistema di espressione, si può pensare di somministrare direttamente il
prodotto ricombinante, ad esempio un vaccino, senza bisogno di
estrarlo e purificarlo, fornendogli al contempo una sorta di “capsula”
protettiva naturale qual è la parete vegetale.
Questo potrebbe rappresentare una garanzia di protezione della
degradazione che si potrebbe verificare durante il transito nel tratto
gastrointestinale, e di permanenza più duratura a contatto con le
mucose.
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Tabella 1 - Potenziali vantaggi del Pharming
Modesta dotazione di impianti
Facilità di incremento del livello produttivo
Immagazzinamento, conservazione e spedizione
senza particolari accorgimenti
Possono essere prodotti più vaccini in uno stesso organo/tessuto
Gli organi vegetali sono esenti da patogeni
che potrebbero attaccare l’uomo
Distribuzione vantaggiosa attraverso l’alimentazione sia dell’uomo
che degli animali eliminando costi per siringhe e materiale annessi
È sufficiente un’assistenza medica ridotta
È importante ricordare che le piante possono essere utilizzate come
biofabbrica anche di molecole endogene, come l’acido acetilsalicilico o
gli oppiacei, semplicemente operando modifiche a carico dei geni che
regolano le vie biosintetiche in modo da aumentare i livelli di espressione basali.
Circa il 70% degli attuali prodotti farmaceutici sono o derivano da
prodotti naturali ed in massima parte dalle piante.
Sebbene siano passati soltanto 14 anni da quando il Pharming è
entrato a far parte del mondo scientifico, i lavori, e di conseguenza le
conoscenze acquisite dagli studi prodotti, suggeriscono che l’utilizzo
delle piante come “bireattori” per produrre vaccini e proteine ad alto
valore biologico, sarà una vera e propria realtà in un prossimo futuro.
Il primo caso di proteina ricombinante di interesse farmaceutico sintetizzata nelle piante si è avuto nel 1986 con l’ormone della crescita
umano, ma solo nel 1990 Curtiss e Cradinean presentarono il primo
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Elimina il timore per la vaccinazione attraverso siringa
(soprattutto per i bambini)
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esempio di utilizzazione delle piante transgeniche come vaccino orale.
Gli autori produssero piante transgeniche di tabacco in grado di esprimere un antigene di parete (SpaA) dello Streptococcus mutans, l’agente
eziologico della carie dentale. L’aggiunta di tessuti di tabacco transgenico alla dieta dei topi da laboratorio indusse nella mucosa degli animali una risposta immunitaria verso la proteina SpaA.
Nel 1995, Haq e collaboratori riportarono un interessante risultato nella vaccinazione orale contro l’epatite B. Topi da laboratorio
furono alimentati con tuberi di patata freschi che producevano la
proteina LT-B in quantità di 2 µg/g. Nonostante la modesta quantità di proteina LT-B presente nei tuberi, gli animali svilupparono anticorpi anti- LT-B e si dimostrarono più resistenti alla malattia. Simili
esperienze sono state riportate da Arakawa e collaboratori in relazione all’espressione della tossina B (CT-B) dell’agente eziologico del
colera.
Topi alimentati con tuberi di patata transgenica che esprimevano
la proteina CT-B, mostrarono una riduzione del 60% nell’accumulo
di fluidi diarreali nell’intestino quando sfidati tramite somministrazione della tossina del colera. Nel 1993, Usha e collaboratori riportarono i risultati dell’espressione di un epitopo del virus footh and
mouth (FMDV) attraverso l’utilizzo di un vettore virale che infetta i
vegetali. Gli autori produssero un costrutto in cui l’epitopo del
FMDV veniva esposto sulla superficie del capside del Cowpea
Mosaic Virus (CPMV) che era poi adoperato per infettare piante di
Vigna unguiculata. Da quella esperienza molti altri epitopi sono stati
espressi tramite vettori. Nel 1998, Modelska e collaboratori furono i
primi a rilevare una risposta immunitaria della mucosa in seguito alla
somministrazione orale di un vaccino prodotto nelle piante tramite
un vettore virale.
Il virus del mosaico dell’erba medica (AIMV) fu ingegnerizzato per
esprimere due epitopi dell’agente eziologico del virus della rabbia. Topi
immunizzati attraverso intubazione gastrica o tramite alimentazione
con spinaci infettati con il virus ingegnerizzato svilupparono IgA specifiche per gli epitopi della rabbia. Successivamente analisi quantitative
del livello di IgA sviluppate tramite le due vie di somministrazione del
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vaccino dimostrarono che l’inclusione del vaccino nella dieta era più
efficiente di almeno 10 volte rispetto all’intubazione gastrica. Gli autori discussero i risultati ipotizzando che le cellule vegetali avessero funzioni come “bioincapsulatori” del vaccino permettendo una più efficiente immunizzazione.
L’anno dopo Brenn e collaboratori presentarono una estesa caratterizzazione dell’immunizzazione ottenibile con vaccini orali contro lo
Staphilococcus aureus. Gli autori effettuarono una ricerca sistematica sull’effetto dell’aggiunta di adiuvanti ai presidi immunizzanti prodotti
nelle piante tramite vettori virali e somministrati ad animali di laboratorio per via orale ed intranasale. Oltre alla usuale analisi del siero e
delle feci furono prelevati anche i fluidi di lavaggio dei bronchi, dell’intestino e della vagina. Anticorpi contro lo Staphilococcus aureus furono
ritrovati in tutti i tessuti analizzati indipendentemente dalla presenza e
dal tipo di adiuvante.
Molto recentemente la sperimentazione è stata estesa all’uomo. Le
prime prove cliniche coinvolgenti volontari umani sono state pianificate, approvate ed eseguite a partire dal 1997. Patate transgeniche che
esprimevano un gene del batterio che causa la diarrea vennero distribuite per via orale ad alcuni dei volontari nelle fasi I e II di prove cliniche. Undici dei quattordici partecipanti al test ricevettero da 50 a 100
grammi di patata transgenica cruda mentre i restanti tre partecipanti
ricevettero 50 grammi di patata non transgenica, cruda. Prima e diverse volte dopo l’ingestione delle patate, campioni di sangue e di feci
furono prelevati e analizzati per la presenza di anticorpi specifici antiLT-B. Dieci degli undici partecipanti alimentati con patate transgeniche
svilupparono anticorpi anti-LT-B mentre nessuno dei tre partecipanti
alimentati con patate non trasformate mostrò la presenza di anticorpi
anti-LT-B.
Molti altri antigeni sono stati espressi nelle piante: tra i più recenti si
ricordano l’antigene dell’epatite B espresso nella lattuga, l’antigene
della rabbia nel pomodoro, l’antigene del colera del tabacco e patate,
l’antigene di un citomegalovirus umano nel tabacco. Per una rassegna
completa vedi Tabella 2.
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Tabella 2 - Produzione di vaccini in piante transgeniche
POTENZIALI
APPLICAZIONI
PIANTA
PROTEINA
SISTEMI DI
ESPRESSIONE
Tabacco
HbsAg ricombinante
AMT
Epatite B
Epitomi dell epatite
Murina
Proteina di superficie
Carie dentale
Tabacco
SpaA di streptococcus mutans
Subunità umana della tosPatata
sina B del Vibro cholerae
Diabete autoimmune
Acido glutammico
Patata
decarbosslasi
Cholera e E. coli della
Enterotossina termolabile
Tabacco Patata
diarrea
LT-B di E. coli
Subunità delle tossine
Vaccino orale contro
Patata
CtoxA e CtoxB
il colera
del V. cholerae
Peptide D2 della proteina
Vaccini mucosali
B Staphilococcus aureus
Cow-pea
che non richiedono
che si lega
additivi
alla fibronectina
Diarrea dovuta al
Tabacco
Proteina del capside del
virus Norwalk
Patata
virus Norwalk
Tabacco
Glicoproteina del virus
Rabbia
Spinacio
della rabbia
Tabacco
Epitopo HIV (gp 120)
Fagiolo
HIV
Cow pea
Epitopo HIV (gp 41)
Tabacco
Epitopo umano del
Rhinovirus (HR 14)
Epitopo del virus Foot &
mouth (VP1)
Epitopo
del virus dell’enterite
Epitopo delle cellule-B
della malaria
TMV
AMT
AMT
AMT
AMT
AMT
CPMV
AMT
AMT
CPMV/AMT
CPMV
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Rhinovirus
Fagiolo
CPMV
Foot & mouth
Fagiolo
Virus dell’enterite
Fagiolo
Malaria
Tabacco
Influenza
Tabacco
Emaglutinina
TMV
Cancro
Tabacco
c-Myc
TMV
CPMV
CPMV
TMV
Legenda: AMT: trasformazione mediata da agrobatterio; TMV: virus mosaico del
tabacco; CPMV: virus del mosaico del pisello
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Per alcuni di questi sistemi sono stati resi pubblici anche i livelli di
protezione immunitaria ottenibili. In generale i risultati dimostrano l’alta fattibilità della produzione di vaccini orali nelle piante.
La società Applied Phytologics ha modificato geneticamente il riso per
produrre l’a-1 anti-tripsina, una proteina con potenzialità terapeutiche
per la fibrosi cistica, per alcune malattie del fegato e per le emorragie.
Dal 1998 sono in corso prove cliniche per verificare l’efficacia della a1 anti-tripsina purificata dal riso transgenico.
La malattia di Gaucher è causata da un disordine lisosomiale che ha
come conseguenza un insufficiente accumulo di idrolisi glucocerebrosidasi. Una sostanza estraibile dalla placenta umana può specificatamente interferire con l’insorgenza dei sintomi clinici della malattia.
Purtroppo l’enorme fabbisogno annuale di placenta umana, calcolato
nell’ordine di 10-12 tonnellate, è difficilmente soddisfacibile. Cramer e
collaboratori hanno presentato nel 1999 un efficiente sistema di produzione di glucocerebrosidasi in tabacco transgenico. I dati fino ad ora
accumulati lasciano sperare che in futuro la produzione di glucocerebrosidasi ottenibili da piante transgeniche possa ricoprire gran parte del
fabbisogno annuale.
Un’altra proteina prodotta nelle piante è l’irudina un anticoagulante
molto adoperato per trattare le trombosi. Originariamente purificato
da Hirudo medicinalis e successivamente prodotto in lievito e nei batteri
è stato di recente prodotto anche nel colza e nel tabacco.
Una lista aggiornata di biofarmaceutici prodotti nelle piante è riportata nella Tabella 3.
Tabella 3 - Produzioni di biofarmaci in piante transgeniche
POTENZIALI
APPLICAZIONI
PIANTA
PROTEINA
SISTEMI DI
ESPRESSIONE
Proteina C
Tabacco
Proteina C umana
Inibitori indiretti della
Tabacco
Irudina variante 2 umana
trombina
Mostarda etiopica
AMT
AMT
segue--->
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Anticoagulanti
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Segue Tab. 3
POTENZIALI
APPLICAZIONI
PIANTA
PROTEINA
SISTEMI DI
ESPRESSIONE
Proteine/Ormoni ricombinanti
Neutropenia
Tabacco
Fattore stimolante macrofagi e granulociti umani
AMT
Anemia
Tabacco
Eritropoietina umana
AMT
Antiperanalgesici
Thale cress
Encefalina umana
AMT
Tabacco
Fattore di crescita
epidermico umano
AMT
Riso
Interferone - a umano
AMT
Cirrosi epatica
Patata
Tabacco
Sieroalbumina umana
AMT
Sostituto del sangue
Tabacco
Emoglobina umana
AMT
Collagene
Tabacco
Collagene
omotrimerico I umano
AMT
Controllo della proliferazione delle cellule
Trattamento
dell’epatite B e C
Inibitori proteici/peptidici
Fibrosi cistica,
malattie del fegato,
emorragie
Riso
Antitripsina -1-a umana
Bombardamento
particelle
Inibitore tripsina
per intervento
di trapianto
Mais
Aprotinina umana
Bombardamento
particelle
Ipertensione
Tabacco
Pomodoro
Enzima che converte
l’Angiotensina I
AMT
Terapia HIV
Tabacco
a - tricosantina del TMV
AMT
Enzimi ricombinanti
Malattia di gaucher’s
Tabacco
Glucocerebrosidasi
AMT
Nutraceuticals
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Deficienza
provitamina A
Riso
Deficienza
di aminoacidi
Patata
Daffodil phitoene
synthase
Amaranthus
hypochondriacus
albumina del seme Ama 1
Legenda: AMT . trasformazione mediata da agrobatterio
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Bombardamento
particelle
AMT
Il calcolo dei costi di produzione di proteine ad uso industriale, farmaceutico analitico e/o diagnostico nelle piante dipende da diversi fattori. In primo luogo, il livello di espressione della proteina nelle piante e la
richiesta del mercato e secondariamente (ed eventualmente) i costi per la
estrazione e la purificazione delle proteine ed il livello di purificazione
necessario. Una valutazione dei costi di produzione, estrazione e purificazione della beta glucoronidasi dai semi di mais transgenico ha indicato
un costo per grammo di circa 43 dollari. Tale valore è riferito ad un livello di produzione di 130 kg con una percentuale di espressione dello
0,015% del peso secco ed un livello di purezza dell’enzima dell’83%.
Nell’analisi non erano inclusi i costi della ricerca e delle royalties.
La produzione di 100 kg di proteina eterologa nel latte di capre transgeniche ha un costo medio di 105 dollari per grammo mentre il valore sale fino a 300-3.000 dollari se la produzione viene effettuata in cellule di mammifero in coltura. In media la produzione agraria di proteine eterologhe è stata valutata dalle 10 alle 50 volte più economica che
in Escherichia coli.
Anche quando il bilancio economico della produzione è riferito a
piante coltivate in ambiente controllato i costi sono estremamente
competitivi. È stato infatti calcolato che la produzione di proteine eterologhe in serra ammonta a circa 500-600 dollari per grammo di proteina, considerando serre di circa 250 mq e tecniche di estrazione e
purificazioni comuni.
Tale valore sebbene molto più elevato di quello riferibile alla coltivazione in pieno campo è ancora molto competitivo rispetto a quello dei
sistemi non-vegetali. Ovviamente, se l’utilizzo del prodotto non richiede una estrazione e purificazione i costi sono comparabili a quelli previsti per le colture non transgeniche ammesso che si possa effettuare
l’ammortamento dei costi di ricerca e delle royalties su di un numero sufficientemente lungo di anni.
Una riduzione dei costi di produzione può derivare dall’affinamento delle tecniche di purificazione e/o dall’aumento del livello di espressione delle proteine eterologhe.
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Glossario
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Antigene: è qualunque molecola che, con il suo ingresso in un organismo animale, provoca la sintesi di un anticorpo specifico.
Anticorpo: sostanza proteica prodotta dall’organismo per reazioni
all’introduzione di antigeni.
Costrutto: vettore di clonazione.
DNA: acido deossiribonucleico; materiale genetico degli esseri viventi.
Eziologia: ramo della medicina che studia le cause delle malattie.
Gene: segmento di acido nucleico che codifica una proteina funzionale o un RNA. Unità ereditaria.
Immunoglobulina: gammaglobulina del plasma sanguigno o delle
secrezioni, con prevalente funzione di anticorpo.
Ingegneria genetica: è costituita da tutte le tecniche che permettono
di isolare geni, creare nuove combinazioni geniche e trasferirle in
diverse cellule.
Organismi transgenici: organismi geneticamente modificati (OGM),
ossia organismi caratterizzati da un patrimonio genetico (genoma)
alterato rispetto a quello tipico della propria specie, per l’introduzione artificiale di uno o più geni provenienti da altri organismi.
Proteina eterologa: proteina la cui sequenza amminoacidica è stata
codificata da un gene clonato esterno, estraneo al menoma della
pianta.
Trasformazione: assunzione e stabilimento di DNA in cellula batterica.
Vaccino: prodotto batterico o virale che, introdotto nell’organismo,
conferisce uno stato di immunità provocando un processo morboso attenuato; usato per la profilassi delle malattie infettive.
Vaccino orale: utilizzo di tessuti e/o organi di pianta, contenenti antigeni (epitomi) o autoantigeni, come alimento che suscita una risposta immunitaria protettiva e duratura nei confronti di un microrganismo impedendone l’infezione o limitandone le conseguenze patologiche.
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Vettore di clonazione: molecola di DNA in grado di trasportare
DNA inserito e atta ad essere perpetuata in una cellula ospite.
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