ADO GHERARDI - AA 21010-2011 [modalità compatibilità]

Metodiche di tipizzazione molecolare
di specie batteriche
Gherardi Giovanni
Università Campus Bio-Medico
Roma
Corso di Laurea Tecniche di laboratorio Biomedico
aa.2010/2011
Diversità genetica:
specificità ospite
Patogenicità
resistenza antibiotica
virulenza
perché identificare i batteri a livello di sub
specie/ceppo?
Aumentata virulenza e trasmissibilità
Resistenza multipla agli antibiotici
Aumentato spettro d’ospite
Possibilità di manipolazione genetica con bioterrorismo
Diversità intraspecie è dovuto a 3 eventi:
trasferimento genico orizzontale
perdita o acquisizione di geni
ricombinazione
…quindi, perché la tipizzazione molecolare :
•ORIGINE CLONALE DEI CEPPI (SE DERIVANO
DA UN ORGANISMO PARENTALE)
•IDENTIFICAZIONE DEI BATTERI A LIVELLO DI
CEPPO
•DALLA DIVERSITA’ GENETICA SPIEGARE
IMPORTANTI CARATTERISTICHE FENOTIPICHE
APPLICAZIONI:
- clinico, disseminazione di infezioni pazientepaziente, animale-paziente, ambiente-paziente)
- ambientale (presenza e diffusione di organismi in
ambienti inanimati)
- industriale (identificazione di organismi di valore
o “minacciosi” nel campo bio-industriale)
Utile per identificare ceppi o cloni all’interno di una specie di patogeni
emergenti (bioterrorismo e in biologia forense)
Distinguiamo:
- comparativa “typing”: di screening
- definitiva “typing” (library): definisce “definitivamente” il clone
Tipizzazione può essere eseguita a diversi livelli:
1.locale, per piccoli studi.
2.regionale o nazionale, in un “reference laboratory”.
3.Internazionale, “networks” internazionali, definendo e sorvegliando
la disseminazione globale di particolari cloni.
PRIMA FASE: SELEZIONE DELLA COLLEZIONE DEI
CEPPI
Ceppi di particolare interesse:
- ceppi non correlati epidemiologicamente
- ceppi appartenenti ad “outbreaks” a
- isolati con determinati criteri di selezione (particolari fattori di virulenza, particolari
tratti di antibiotico-resistenza, ecc)
Il numero dei ceppi e la complessità dipende dagli obiettivi della ricerca
Gli organismi dovrebbero essere conservati in brodo con glicerolo a – 80°C,
secondo le linee guida.
IMPORTANTE! Vi deve essere sempre un database con dati clinici,
epidemiologici e demografici dei ceppi.
a
(outbreak: aumento temporale nella incidenza di infezione o colonizzazione da parte di certe specie batteriche,
provocate da una aumentata trasmissione di un ceppo specifico).
RAGIONI PER LA TIPIZZAZIONE
Sorveglianza delle malattie infettive
Investigazione di outbreaks
Studi di patogenesi e del corso di infezione.
Quando riguarda tipizzazione di gruppi di ceppi con diverso grado di
virulenza, in questo caso possono essere identificati markers di virulenza
correlati alla patogenesi (presenza di determinati fattori di virulenza
associati ad alcuni cloni o ceppi).
Studio della genetica di popolazione batterica
CRITERI PER LA VALUTAZIONE E VALIDAZIONE DEI METODI DI TIPIZZAZIONE
1.”Performance criteria”
- Stabilità
- “typeability”
- Potere discriminatorio
- Concordanza (con il quadro epidemiologico)
- Riproducibilità
- “test population”
2. “Convenience criteria”
- Flessibilità e spettro
- Rapidità
- Accessibilità
- Facilità di esecuzione
- Costo
- Disponibilità per analisi computerizzata e di database elettronici
Performance criteria
STABILITA’
Le caratteristiche testate dovrebbero rimanere stabili per ogni isolato dopo il suo isolamento
primario e durante la conservazione e la subcultura in laboratorio.
Per saggiare la stabilità, subculture multiple dello stesso ceppo, conservato in periodi diversi e in
diverse condizioni, devono essere processate nella stessa corsa per rendere al minimo le variazioni
introdotte in laboratorio
TYPEABILITY
Si riferisce alla capacità del metodo di assegnare un tipo a tutti gli isolati testati con quel metodo. Può
essere espressa come percentuale di isolati tipizzabili sul numero totale di isolati tipizzati (tipizzabili e
non-tipizzabili).
POTERE DISCRIMINATORIO
Si riferisce alla capacità di un metodo di assegnare diversi tipi a due ceppi non correlati campionati
“randomly” all’interno di una popolazione di una data specie. Può essere espresso come probabilità,
mediante il Simpson index. Il Simpson index dovrebbe idealmente corrispondere a 1.00, ma in
pratica dovrebbe essere > 0.95 perché un metodo di tipizzazione possa essere considerato più o
meno “ideale”.
Metodi di tipizzazione che indagano polimorfismi in siti multipli dell’intero genoma hanno più
probabilità di avere un maggiore potere discriminatorio rispetto ai metodi che indagano un singolo
locus.
CONCORDANZA
Concordanza epidemiologica.
I risultati di tipizzazione dovrebbero riflettere, confermare e possibilmente chiarire l’informazione
epidemiologica disponibile sui casi in esame.
RIPRODUCIBILITA’
Si riferisce alla capacità di un metodo di tipizzazione di assegnare lo spesso tipo ad un isolato
testato in occasioni indipendenti, separate nel tempo e/o nello spazio. La riproducibilità può
essere influenzata da vari step in una procedura, come risultato o del protocollo usato o del
grado di stringenza: variazioni nella condizione di crescita, dei metodi usati nella estrazione del
DNA, nei reagenti usati, diversi tipi di apparecchiature, diversità nella osservazione e
registrazione dei risultati, come anche nela loro analisi ed interpretazione.
Da ciò è importante sia la riproducibilità intra-laboratorio che quella inter-laboratorio; entrambe
richiedono standardizzazione dei protocolli e personale adeguatamente attrezzato.
TEST POPULATION
Questo è il prerequisito per valutare la “typeability”, il potere discriminatorio e la concordanza
epidemiologica dei metodi di tipizzazione. La natura della popolazione è definita dal contesto
epidemiologico, cioè dalla specie coinvolta, se lo studio è locale, regionale o globale, e se la
sorveglianza è “long-term”.
Un sufficiente numero di isolati all’interno di una popolazione test dovrebbe essere incluso (circa
100 isolati) e questi dovrebbero riflettere la diversità totale interno di quella specie. E’ anche
importante coprire diverse nicchie ecologiche, come particolari popolazioni di pazienti (età, stato
immunitario, tipo di ospedale e reparto, origine geografica, ecc) e importante serbatoi ambientali
per le infezioni ad esempio “foodborne” e “waterborne”.
Convenience criteria
FLESSIBILITA’ E SPETTRO
Questo riflette il range di specie che sono tipizzabili con modificazioni minime del metodo
(principio, apparecchiature, reagenti, ecc.).
I metodi basati sul sequenziamento del DNA mostrano ottima flessibilità.
RAPIDITA’
Si riferisce al tempo totale richiesto, a partire dagli isolati batterici ai risultati finali di tipizzazione
(interpretazione dei risultati inclusa). I metodi più rapidi sono le cosiddette procedure “coltureindipendenti”.
ACCESSIBILITA’
Dipende dalla disponibilità dei reagenti e delle apparecchiature, e dalle attitudini richieste dal
personale.
FACILITA’ DI ESECUZIONE
Comprende semplicità tecnica, carico di lavoro, utile per processare un gran numero di isolati,
facilità di interpretazione dei risultati.
COSTO
DISPONIBILITA’ PER ANALISI COMPUTERIZZATA E DI DATABASE ELETTRONICI
Disponibilità di analisi computerizzata ed incorporazione dei risultati in database elettronici, fattori
importanti per “studi di confronti longitudinali” tra numerosi isolati.
Studi epidemiologici locali: analisi computerizzata e visiva.
Studi epidemiologici regionali e globali, importante la creazione di database elettronici per valutare
diffusione di specifici cloni.
Importante esempio di database elettronici : MLST.
METODI DI TIPIZZAZIONE FENOTIPICI E GENOTIPICI
METODI FENOTIPICI
- biotyping
- pattern di sensibilità agli antibiotici (antibiogramma)
- serotyping
- tipizzazione fagica e batteriocina (saggia i profili litici esposti a
diversi batteriofagi o batteriocine - tossine batteriche)
- SDS-PAGE, di componenti cellulari e extracellulari
- Multilocus enzyme electrophoresis (MLEE)
- Spettrometria di massa (MS)
diversi approcci “-omics”: proteomics, glycomics,…
MALDI - TOF
Biotyping
Reazioni enzimatiche
Biotipo 1
Biotipo 2
Biotipo 3
Biotipo 4
Fermentazioni di zuccheri
Serotyping
Antibiotyping
Quellung reaction per la sierotipizzazione capsulare dello Streptococcus
pneumoniae (esempio antisiero per sierotipo capsulare 14)
Serotyping
Tipizzazione fagica
SDS-PAGE
MALDI – TOF MS
Moura et al. FEMS Immunol Med
Microbiol 2008, 53:333-342
Moura et al. FEMS Immunol Med
Microbiol 2008, 53:333-342
METODI GENOTIPICI
METODI BASATI SULL’IBRIDAZIONE
- ibridazione diretta
- ribotyping
METODI BASATI SU FRAMMENTI
- tipizzazione plasmidica
- metodi RFLP (restriction fragment length polymorphism):
• Restriction endonuclease analysis (REA); Ribotyping; Tipizzazione della sequenza IS6110 di M.
tuberculosis
• PFGE
- PCR fingerprinting (esempio sequenze BOX in S. pneumoniae o sequenze IS256 per S. aureus)
Per aumentare la risoluzione della PCR fingerprinting la PCR è seguita da restrizione con un
enzima di restrizione (PCR-RFLP analisi).
- amplified fragment length polymorphism (AFLP) analisi, esempio di metodo di tipizzazione
basato sulla PCR.
- multilocus variable number tandem repeat (VNTR) analisi (MLVA)
METODI BASATI SUL SEQUENZIAMENTO DEL DNA
- single-locus sequence typing (SLST): emm typing per lo S. pyogenes, spa typing per S.aureus.
- MLST
- SNP genotyping
METODI BASATI SULL’IBRIDAZIONE
Direct (and reverse) hybridisation:
Il DNA immobilizzato viene ibridizzato con sonde di DNA selettive;
alcuni templates vengono riconosciuti, altri no. Essenzialmente è la
tecnologia del ‘Southern hybridisation’.
Esempi:
• Binary typing per lo S. aureus
• Spoligotyping per M.tuberculosis, amplificazione di locus con
tandem repeat con variazioni nella sequenza interna. Tali varianti
vengono evidenziate con sonde tandem repeat-specifiche
Ribotyping:
Stima il numero dei loci genici ribosomiali e la loro localizzazione
lungo il cromosoma
Usa sonde di DNA
Gli operoni rRNA comprendono geni conservati, ciascuno dei quali è
fiancheggiato da regioni di DNA variabili. Variazioni di sequenze in
queste regioni porta a diversi profili RFLP quando si utilizzano sonde
di DNA per i domini conservati dei geni 16S e 23S rRNA.
Ribotyping:
Vantaggi:
• Automatizzata
• Riproducibile
• Operoni rRNA sono universali
• poche bande prodotte
• economica
Svantaggi:
• Basso potere discriminatorio
• richiede grandi quantità di DNA genomico ad alta qualità
• labor e time consuming
• sistemi di rilevazione complessi, quali radioisotopi
METODI BASATI SUI FRAMMENTI
Plasmid typing:
Dipende dal numero, dalla dimensione e dai profili di restrizione con
REs.
Svantaggi:
• Mancanza di stabilità nel contenuto dei plasmidi rende tale tecnica
poco utilizzata
REA:
REstriction endonuclease analysis (REA), utilizzando enzimi ad alta
frequenza di taglio.
L’analisi REA viene accoppiata a Southern blot e poi ad ibridazione,
esempi:
• Rybotyping
• IS 6110 M.tuberculosis
IS6110 typing- RFLP
PFGE
SCELTA DELL’ENZIMA DI RESTRIZIONE (RE con bassa frequenza di taglio)
STANDARDIZZAZIONE DEI PROTOCOLLI, SVILUPPO DI DATABASE GLOBALI
(PulseNet: per foodborne deseases quali Escherichia coli O157:H7, Salmonella
non-typhi, Shigella, e Listeria monocytogenes)
LIMITAZIONI
PERSONALE SPECIALIZZATO (concentrazione del DNA nelle plugs, percentuale
di agarosio, voltaggio, temperatura forza del tampone, attitudini tecniche, ecc)
LABORIOSA E LUNGA
SCARSA RIPRODUCIBILITA’ INTERLABORATORIO
RICHIEDE DNA AD ALTA QUALITA’
BANDE QUASI IDENTICHE, MA DIVERSE: SCARSA RISOLUZIONE
PFGE
Dendogramma
Dice coefficiente:
no. bande A + no. bande B uguali
no. bande A + no. bande B totali
Un evento mutazionale può differire da 0 a 4 bande (frammenti di DNA).
Quando non vi sono bande di differenza osservabili, gli isolati devono
essere chiamati “indistinguishable” e non “identical”, ed assegnati allo
stesso tipo e subtipo.
Quando gli isolati differiscono per 1 - 4 bande, questi devono essere
assegnati allo stesso tipo, ma con diverso subtipo.
Da 5 a 8 bande di differenza possono essere attribuibili ad almeno due
eventi mutazionali.
In generale:
-fino a 4 bande di differenza: isolati correlati geneticamente.
-da 5 a 6 bande di differenza: da considerare le informazioni cliniche ed
epidemiologiche
-sopra le 6 bande di differenza: isolati non correlati geneticamente
Sempre: correlare i dati ottenuti con la PFGE con le notizie cliniche ed
epidemiologiche.
Interpretazione visiva + computer-assistita.
La PCR (reazione a catena della
polimerasi) utilizzata per
amplificare sequenze di DNA
(a) Il DNA da amplificare (DNA bersaglio) viene prima
riscaldato per separare le due eliche
(DENATURATION), poi vengono aggiunti in eccesso
due oligonucleotidi come inneschi (primers)
(ANNEALING), uno complementare ad ogni elica, e la
DNA polimerasi.
(b) In seguito all’appaiamento del primer l’estensione
del primer da parte della DNA polimerasi genera una
copia della sequenza originale di DNA (EXTENSION).
(c) Due cicli aggiuntivi di PCR generano
rispettivamente 4 e 8 copie della sequenza originale di
DNA.
(d) Risultati ottenuti dopo 20 cicli di PCR su una
preparazione di DNA contenente solo 10 copie del gene
bersaglio.
Utilizzo della PCR:
1.Clonaggio e sequenziamento
2.Studi comparativi ed evoluzionistici (gene del 16S rRNA)
3.Amplificare piccole quantità di DNA
4.Microbiologia diagnostica
5.Fingerprinting in medicina legale
PCR
PCR fingerprinting:
Utilizzo di primers conosciuti che vanno ad amplificare
frammenti ben noti di specifiche specie batteriche (a differenza dei
primers “sconosciuti” che vanno ad amplificare arbitrariamente
frammenti di DNA)
esempi:
• BOX-PCR per S. penumoniae
• IS256-PCR per S. aureus
BOX-PCR
Per aumentare la risoluzione della PCR fingerprinting la PCR è
seguita da restrizione con un enzima di restrizione (PCR-RFLP
analisi).
Permette di evidenziare mutazioni puntiformi nel sito di taglio dell’enzima: è una variante
del metodo Single nucleotide polimorphislms (SNPs)
REP-PCR
Sequenze di DNA ripetute in multiple copie sono presenti nei genomi batterici. La
loro funzione non è nota, ma sono utili per il fingerprinting dei batteri.
Utilizzati specifici primers che amplificano frammenti di DNA che si ritrovano tra le
sequenze ripetute.
3 famiglie di sequenze ripetute sono state utilizzate nella REP-PCR:
- le sequenze 35–40-bp repetitive extragenic palindromic (REP)
-le sequenze 124–127-bp enterobacterial repetitive intergenic consensus (ERIC)
-le sequenze 154-bp BOX element
I frammenti si visualizzano mediante elettroforesi su gel agarosio o elettroforesi capillare.
VANTAGGI
Basso costo, rapidità, facilità, poco laboriosa, riproducibilità sia su eucarioti che su
procarioti
usata su: Acinetobacter spp., Streptococcus pneumoniae, M. tuberculosis , Clostridium
difficile, L. monocytogenes
Un kit commerciale: REP-PCR DiversiLab (Spectral Genomics Inc., Houston, TX),
con il DIVERSILAB software che fornisce la interpretazione e la conservazione dei
dati in un database. Inoltre permette di lavorare sulle cellule intere senza estrarre il
DNA.
SVANTAGGI
rischi di contaminazioni, Artefatti, Necessità di controlli multipli
AP-PCR (Arbitrarily primed PCR) o RAPD
E’ una PCR random di regioni genomiche sconosciute usando primers scelti
arbitrariamente.
Usando primers corti (generalmente di 10 bp) in combinazione con basse temperature di
annealing, l’AP-PCR permette l’amplificazione di loci multipli, con ampliconi di diversa grandezza.
VANTAGGI
economica
rapida
Sensibile
SVANTAGGI
Riproducibilità inter-laboratorio
Influenzata da diversi paramentri( temperatura di annealing e sequenza dei primers, qualità e
concentrazione del DNA template, apparecchiatura di PCR e reagenti)
Ottimizzazione Standardizzazione della procedura mediante “Ready-To-Go RAPD analysis beads
(Amersham Pharmacia Biotech)”, che fornisce Taq, dNTPs, buffers e un protocollo generale della
RAPD
AP-PCR (Arbitrarily primed PCR) o RAPD
AP-PCR (Arbitrarily primed PCR) o RAPD
I primers arbitrari devono legarsi al template secondo uno specifico ORIENTAMENTO
I primers arbitrari devono legarsi al template entro una RAGIONEVOLE DISTANZA l’uno dall’altro
Amplified Fragment Length Polimorphism
Analysis (AFLP):
AFLP consiste di 2
amplificazioni: una preselettiva
ed una più selettiva, che genera
frammenti che possono essere
usati come markers
discriminatori
Il successo della AFLP dipende da
tre fattori: reagenti ottimizzati, una
robusta ed affidabile piattaforma
elettroforetica, un efficacie analisi
software (elettroforesi capillare).
Vantaggi: possono essere amplificati
più loci in una reazione di PCR, poco
DNA richiesto, buon potere
discriminatorio, riproducibile,
economica, automatizzata
Tranne che per pochissime specie
bateriche (es Acinetobacter
baumannii), la riproducibilità
interlaboratorio è scarsa data la
necessità assoluta di software
dedicati per l’interpretazione dei
risultati specialmente utilizzando
primers marcati e l’utilizzo di
apparecchiature di sequenziamento
automatizzato)
MLVA
(multilocus variable number tandem repteat
analysis)
Metodica introdotta nel 2000
MLVA
Variable number tandem repeats (VNTR) sono sequenze di DNA ripetute in
tandem (“testa-coda”), che variano nel numero di copie e sono ampiamente
disperse nel genoma, sia in regioni non codificanti che nei geni, che evolvono
rapidamente.
Utilizzando primers specifici a sequenze altamente conservate si ottengono
frammenti che variano per dimensione e per numero di unità ripetute, i cui profili
si analizzano mediante software specifici.
Marcando gli ampliconi di PCR con diversi coloranti e separandoli mediante
elettroforesi capillare in un sequenziatore automatico, la MLVA può essere
eseguita come multiplex PCR, aumentando l’efficacia.
Il primo passo è individuare i loci VNTR lungo il genoma (diversi programmi, come
TANDEM REPEAT FINDER, il Tandem Repeat database, e il Microsatellite Repeats
database). Tali programmi permettono anche di stabilire delle relazioni filogenetiche.
VANTAGGI
Alto potere discriminatorio, Rapida, Facile, Economica, Riproducibile, Utilizzabile per le outbreaks
SVANTAGGI
VNTR evolvono rapidamente: non utilizzabile per gli studi epidemiologici “long-term”.
In alcune specie (es E. faecium) potere discriminatorio più basso rispetto alla MLST e PFGE.
Utilizzata su:
Francisella tularensis, Bacillus anthracis, Yersinia pestis, e M. tuberculosis. Più recentemente su
methicillin-resistant Staphylococcus aureus, Burkholderia pseudomallei, e C. difficile.
La stabilità è principalmente associata alla lunghezza dell’unità ripetuta, al numero di copie
dell’unità ripetuta, e alla purezza.
Vi è un programma (SERV), che serve alla selezione e al confronto delle VNTR, che si basa
proprio sulla lunghezza dell’unità ripetuta, al numero di copie dell’unità ripetuta, e alla purezza.
Con la conoscenza delle sequenze genomiche di nuove specie batteriche sarà possibile
migliorare la metodica MLVA, trovando nuove VNTRs e nuovi primers.
Metodi basati sul sequenziamento del DNA
Sequenziamento del DNA
I dideossinucleotidi
e il sequenziamento
con il metodo di
Sanger
(a) Un deossinucleotide
normale ha un gruppo
idrossilico sul carbonio
al 3’ mentre un
dideossinucleotide ne è
privo.
(b) La terminazione
della reazione di
elongazione avviene a
seguito
all’incorporazione del
dideossinucleotide
Sequenziamento del DNA
utilizzando il metodo di Sanger
Si richiede un DNA a singolo filamento e la sequenza
viene determinata in seguito a sintesi del filamento
copia utilizzando una DNA polimerasi, che sintetizza a
partire da un innesco specifico (primer), usando i 4
deossiribonucleotidi trifosfati. Nelle miscele di
incubazione, costituite da 4 provette separate, vi sono
piccole quantità di analoghi dideossi dei
deossiribonucleotidi. Poiché lo zucchero nei dideossi
manca la catena si interrompe e la reazione di
sequenziamento termina. (a)
Si devono correre quattro diverse reazioni, una per
ogni dideossinucleotide.
Si ottengono frammenti di lunghezza variabile in
dipendenza dei tempi di incubazione. Analizzando i
vari frammenti e confrontandoli è possibile leggere la
sequenza copia del DNA.
•Utilizzo di dideossi radioattivi, rilevazione con
sviluppo di lastre radiografiche (b)
•Utilizzo di dideossi fluorescenti, sequenziamento
ottenuto con metodo automatico (c), bande
riconosciute per spettroscopia a fluorescenza. Utilizzo
di 4 diversi coloranti fluorescenti
A:blu
G:rosso
C:verde
T:giallo
Single-locus sequence typing
(SLST)
emm typing per lo Streptococcus pyogenes
spa typing per lo Staphylococcus aureus
emm sequence typing
emm sequence typing
From B. Beall
Amplificazione di circa 1500 bp.
Le sequenze della regione ipervariabile possono essere
ottenute da tutti i sierotipi di Lancefield ceppi di riferimento.
In generale, queste sequenze condividono soltanto circa 40
– 80% di identità di sequenza dei 50 codoni delle regioni
determinanti il “sequence type”.
Sequence hypervariable (HV) typespecific region adjacent to primer 1
From B. Beall
emm gene
Emm gene database
From B. Beall
Attualmente sono stai descritti> 180 “sequence
types” che condividono > 95% identità di
sequenza della regione determinante il tipo.
Shortcut per il sequence typing:
HindII + HaeIII
D ice (O p t :1 . 00 % ) ( T o l 1 . 5 % - 1 .5 % ) ( H > 0 . 0 % S > 0 . 0% ) [ 0 .0 % -1 0 0 .0 % ]
e mm
100
90
80
70
60
50
40
30
20
em m
..
..
..
...
...
..
..
...
...
...
...
...
emm1
emm12
emm3
...
D ic e
(O p t :1 . 00 % ) ( T o l 1 . 5 % - 1 .5 % ) ( H > 0 . 0 %
S > 0 . 0 % ) [ 0 .0 % -1 0 0 .0 % ]
e mm
DdeI
100
95
90
85
80
75
70
65
60
55
em m
....
...
....
....
....
....
....
....
....
...
...
...
emm12
emm3
emm1
emm
Ha Hi
Dd Ha Dd
From B. Beall
emm PCR
PCR--RFLP typing
(hindII + haeIII restriction enzymes)
emm 4
emm 87
emm 12
emm 78
emm 87
emm 89
emm 4
emm 3
emm 9
emm 5
emm 5
Dicuonzo G, Gherardi G et al, JCM 2001
emm 75
st 448
emm 77
emm 1
emm 28
emm 6
emm 11
emm 14
emm 22
emm 59
emm 80
emm 29
emm 22
emm 44/61
emm 2
emm 87
emm 28
spa sequence typing
MLST
Interpretation of MLST
In the interpretation of results, strains
with identical allelic profiles or differing
at a single locus (single locus variant –
SLV) were considered to be genetically
related, and strains differing in 2 of the 7
loci (double locus variant – DLV) were
assumed likely to be genetically related.
An example of population analysis by eBURST
DNA microarrays
Vetrini trattati (chips) che
contengono numerose reazioni in
un’unica reazione.
Utilizzo di più metodiche di tipizzazione combinate
Metodi di “typing” solo per la
ricerca?
NO!!!!!!!!!!!!
…anche per l’attività clinica nelle
misure di controllo dell’infezione.