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malattie genetiche da mutazione in 1 allele
Le mutazioni monoalleliche possono causare disordini a
trasmissione dominante o recessiva legata all’X negli uomini
•
Se la malattia a trasmissione dominante è grave in età fertile e
pertanto limita o annulla la capacità riproduttiva (bassa fitness), le
mutazioni monoalleliche sono nuove e spesso distribuite in modo
casuale
•
Se la malattia dominante non è grave in età fertile e non limita in
alcun modo la capacità riproduttiva (normale fitness), le mutazioni
monoalleliche sono ereditate da un genitore e spesso si
tramandano da molte generazioni
•
Se la malattia è recessiva legata all’X ed è letale ha una vita media
di tre generazioni, perché le donne trasmettono gli alleli mutati in
eterozigosi e gli uomini li eliminano
eredità autosomica dominante a penetranza completa
(malattia che non modifica la fitness riproduttiva)
Cos’è una mutazione causativa?
Una variazione della sequenza del DNA ….
• ..che è trovata solo negli individui affetti
• ..che non è mai ritrovata in quelli non affetti
• ..che spiega il processo patologico
• ..che, quando corretta per tempo, fa recuperare un
fenotipo normale
….che è trovata solo negli individui affetti
..che non è mai ritrovata in quelli non affetti
penetranza incompleta
che è ritrovata più frequentemente negli
individui affetti rispetto ai non affetti…
malattie genetiche da mutazione in 2 alleli
Le mutazioni bialleliche possono causare disordini a
trasmissione autosomica recessiva
•
Se la malattia a trasmissione recessiva è grave in età fertile e limita
o annulla la capacità riproduttiva (bassa fitness), le mutazioni non si
estinguono comunque perché i portatori sani sono 10-10.000 volte
più numerosi degli affetti
•
Le mutazioni in genere si trasmettono da 100-1000 generazioni,
mentre le nuove mutazioni sono rare
•
Solo se la malattia è biallelica le mutazioni hanno una firma etnica
che caratterizza una località di origine e un fondatore comune
eterozigote sano
Malattie genetiche da 2 alleli
•
L’alto numero di portatori è un fattore di rischio per l’eterozigosi
composta (due mutazioni differente nei due alleli). Questo potrebbe
essere causato da una fitness migliore degli eterozigoti nei confronti
di un fattore negativo vedi A
•
La consanguineità è un fattore di rischio per l’omozigosità (due alleli
identici) anche se la mutazione è rarissima vedi B
Imprinting
Imprinting
• Nelle cellule germinali primordiali l’imprinting viene
cancellato del tutto e il DNA è demetilato
• Successivamente nella linea germinale maschile si
determina un pattern di imprinting che in alcuni loci è
complementare a quello della linea germinale femminile
• I cromosomi su cui avviene l’imprinting (7, 11, 15)
manterranno questo pattern e lo riprodurranno ad ogni
mitosi
• Si potranno sempre distinguere l’espressione genica del
cromosoma materno e paterno
Disomia uniparentale
• Due copie dello stesso cromosoma sono
ereditate dallo stesso genitore
• Spesso questo avviene attraverso un
fenomeno transitorio di trisomia, seguito
dalla perdita del cromosoma singolo e
mantenimento del cromosoma doppio
Angelman
• 70% dei casi delezione della regione cromosomica
15q11-q13, che è soggetta al fenomeno dell'imprinting
del cromosoma paterno
• Il gene materno (l'unico espresso) può essere alterato
con 4 meccanismi noti:
–
–
–
–
delezione
disomia uniparentale paterna
difetti nell'imprinting
mutazioni a carico del gene UBE3A (ubiquitin ligasi)
• La diagnosi è clinica e il difetto genetico non si identifica
nel 20% dei casi
Angelman
• "happy puppet syndrome" si
può identificare in Cucciolo
(Dopey) "addormentato", il
più giovane dei nani che non
ha mai imparato a parlare
• ritardo mentale con assenza
del linguaggio, difficoltà
nell'equilibrio, eccessivo
buon umore
Angelman
• L'incidenza è 1/20.000 nati
• crisi epilettiche e comunque
alterazioni dell'EEG e
microcefalia relativa
Prader-Willi
•
•
•
•
•
•
iperfagia>obesità
eccessiva assunzione di liquidi
reazioni abnormi ai sedativi
acromicria, criptorchidismo
insensibilità al dolore, lesioni cutanee
sbalzi di umore
Prader-Willi
1/15.000
Mutazioni dinamiche
Circa il 2% della popolazione ha un
IQ<70 (ritardo mentale)
il 15-20% di tutti I ritardi mentali sono
attribuibili a geni del cromosoma X
Il ritardo mentale legato al cromosoma X
(XLMR) è geneticamente eterogeneo
con 202 loci responsabili di forme che si
sovrappongono clinicamente
46 geni sono stati a tutt’oggi identificati
il locus che contribuisce alla frazione
maggiore causa la sindrome di MartinBell, oggi nota come
sindrome dell’X fragile
X fragile
ritardo mentale: IQ tra 20 e 70
•deficit di memoria a breve termine di
informazioni complesse
•ritardo nel linguaggio
•ridotte abilità visuo-spaziali
•ipersensibilità agli stimoli
•iperattività con deficit di attenzione
•comportamento autistico
•Macrocefalia con fronte, mento e
orecchie sporgenti
•Macroorchidismo (<30ml) dopo la
pubertà
•Anomalie connettivali: prolasso della
mitrale, lassità articolare, piede piatto
•Disfunzioni ipotalamiche?
Nel 1969 Lubs osservò una costrizione (marker X) sul braccio lungo
del cromosoma X in quattro maschi affetti e tre carriers obbligate
della stessa famiglia
Il sito fragile a Xq27.3
rottura o costrizione dei cromosomi
in metafase che insorge quando le
cellule sono esposte ad una
perturbazione della replicazione del
DNA
siti fragili sono su tutti i cromosomi
e prendono il nome della banda
cromosomica, es fra(X)(q27.3)
la nomenclatura HUGO chiama
questo sito FRAXA, cioè il primo
sito fragile identificato sul
cromosoma X
Segregazione, paradosso di Sherman
Il 20% dei maschi che portano l’allele mutato sono normali (NTM)
Il 30% delle carrier presenta ritardo mentale
1
perché è affetta?
I
2
1
II
perché non è affetto?
4
3
1
III
1
IV
2
3
4
5
Fragile X syndrome
X fragile al microscopio a forza atomica
Il gene FMR
Zhong et al. Am J Hum Genet 1995
200
controlli
150
100
50
0
premutazioni
CpG island/5 ’UTR
FMR1 gene
Eag I
EcoRI
EcoRI
probe
2.4kb
2.8kb
(CGG) ~ 6 to 50
(CGG) 59 to ~ 200
(CGG) > 250
Methylation
allele normale:
stabile nella famiglia e
nell’individuo,
instabile nella
popolazione
(polimorfismo)
premutazione:
instabile nella famiglia,
stabile nell’individuo
mutazione piena:
instabile nell’individuo
(mutazioni somatiche)
reprime la trascrizione
di FMR1
diagnosi di X Fragile : analisi mediante
Southern blot di espansione e metilazione
Rousseau et al. NEJM 1991
Premutazioni e mutazioni
•
•
•
Le premutazioni si espandono quando sono trasmesse dalla
madre
La donna con premutazioni ha un maggiore rischio di
menopausa precoce POF (premature ovarian failure)
Il più corto allele descritto che in una sola generazione è
diventato mutazione piena è di 59 triplette
Espansione stabile (CGG)9-AGG-(CGG)9-AGG-(CGG)9
Ha almeno 2 A che interrompono la serie di 9 triplette
Espansione instabile (CGG)9-(CGG)9-(CGG)9- (CGG)9……
NON ha A che interrompono la serie
Il gene FMR1 (fragile X mental retardation 1) è all’interno di deserto
genico: quindi il fenotipo NON è da geni contigui
Mutazioni puntiformi o delezioni di FMR1 causano un fenotipo identico
alle espansioni e questo dimostra che il ruolo del gene non è importante
nelle prime fasi dello sviluppo, quando le triplette non sono ancora
metilate
Trasmissione X fragile
cosa fa FMR1?
•
FMR1 codifica per una RNA-binding protein selettiva associata con i
poliribosomi ed espressa nei neuroni
•
nelle spine dendritiche regola la traduzione degli mRNA, funzione
cruciale per la plasticità sinaptica e la maturazione neuronale
•
interagisce con gli mRNA e con il pathway dei miRNA
•
Nell’X fragile le spine dendritiche sono immature e lunghe
Spine dendritiche nel neocortex lunghe
ed immature anche nel topo KO
Malattie da triplette ripetute
Disease
Fragile X syndrome
Fragile XE syndrome
Friedreich ataxia
Myotonic dystrophy 1
Myotonic dystrophy 2
Spinobulbar muscular
atrophy
Huntington disease
Dentatorubralpallidoluysian
atrophy
SCA type 1
SCA type 2
SCA type 3
(Machado-Joseph disease)
SCA type 6
SCA type 7
SCA type 8
SCA type 12
Gene Locus/Protein
Repeat
Location
Xq27.3/FMR-1 protein
Xq28/FMR-2 protein
9q13-9q21.1/frataxin
19q13/myotonic dystrophy
protein kinase
3q21
Xq13-Xq21/androgen receptor
CGG
GCC
GAA
CTG
Noncoding
Noncoding
Noncoding
Noncoding
CCTG
CAG
Noncoding
Coding
4p16.3/huntington
12p13.31/atrophin-1
CAG
CAG
Coding
Coding
6p23/ataxin-1
12q24/ataxin-2
14q32.1/ataxin-3
CAG
CAG
CAG
Coding
Coding
Coding
19p13/α-1A (voltage-ependent
calcium channel subunit)
3p12-3p13/ataxin-7
13q12/none identified
5q31-5q33
CAG
Coding
CAG
CTG
CAG
Coding
?
Noncoding
Malattie da triplette ripetute non codificanti
Sindrome del
X fragile
mutazione
completa
CGG
Atassia di
Friedreich
220 0 -- >>220 0 00
normale
CGG
CGG
5' UTR
CTG
CTG
CTG
GAA
60-200
60-80
GAA
CTG
GAA
CGG
CGG
CTG
GAA
CGG
CGG
2 0 00-- >>22000 0
GAA
CGG
pre-mutazione
2 0 00-- >>99000
GAA
CGG
CGG
GAA
Distrofia
miotonica
CTG
GAA
6-52
GAA
esone
GAA
CTG
7-22
introne
esone
introne
esone
5-37
CTG
CTG
CTG
3' UTR
anticipazione nella distrofia miotonica
distrofia miotonica DM1
• fenomeno “miotonico”, difficoltà al rilasciamento
muscolare dopo una contrazione
• ipotonia al volto, non debolezza importante
• cataratta precoce
• alterazioni ritmo cardiaco
• disfunzione tiroidea
• trasmissione autosomica dominante (1/8000)
• forma congenita con grave ipotonia neonatale
distrofia miotonica DM1
• La distrofia miotonica di Steinert è la più comune
distrofia muscolare dell’adulto
• è causata da un’espansione CTG nel 3’UTR del gene
DMPK (nell’RNA CUG) a 19q13.3
• presenta eredità autosomica dominante con
anticipazione
• sono state identificate RNA binding proteins che
interagiscono con l’espansione CUG
distrofia miotonica DM2
• cromosoma 3p21
• un’espansione simile nell’ introne 1 di un repeat CCUG
nel gene ZNF9 (zinc finger protein 9) causa la distrofia
miotonica 2
• la DM2 è detta anche distrofia miotonica prossimale
Malattie da triplette ripetute di
poliglutammina
Atassia
Atrofia
spinocerebellare dentatorubraledi tipo 1
pallidoluysiana
Corea di
Huntington
CAG
ammalato
121
CAG
CAG
CAG
CAG
CAG
CAG
normale
36
CAG
34
6
CAG
CAG
81
CAG
CAG
CAG
Malattia di
Machado-Joseph
CAG
CAG
39
6
CAG
CAG
CAG
CAG
49
CAG
25
7
CAG
CAG
CAG
79
CAG
CAG
41
CAG
CAG
88
CAG
CAG
CAG
CAG
CAG
CAG
68
CAG
36
13
CAG
CAG
CAG
ORF
5' UTR
normale
CAG
CAG
CAG
CAG
CAG
CAG
15
29
35
CAG
ammalato
CAG
CAG
CAG
11
34
40
CAG
CAG
59
Atassia
spinocerebellare
di tipo 2
CAG
CAG
CAG
CAG
CAG
4
16
CAG
21
CAG
27
CAG
CAG
CAG
CAG
CAG
CAG
62
Atrofia
muscolare
spinobulbare
Atassia
spinocerebellare
di tipo 6
3' UTR
Còrea di Huntington
• descritta da George Huntington nel 1872, è detta
anche còrea che in greco indica la danza
• alla base vi è una degenerazione programmata
geneticamente dei neuroni dei gangli basali (nuclei
caudato e pallido) e della corteccia
• prevalenza di 1/10,000 e presenta il fenomeno
dell'anticipazione
• si trasmette nel 97% dei casi come carattere
autosomico dominante associato al gene huntingtina
sul cromosoma 4p16.3
• solo il 3% dei casi è dovuto a nuove mutazioni
• un'espansione dinamica della tripletta CAG che
codifica per la glutammina
quante glutammine?
• fino a 28 = numero max di CAG per un soggetto non a
rischio
• 29 - 39 CAG la malattia si potrebbe presentare alla
generazione successiva (premutazione)
• oltre 39 CAG il soggetto è considerato affetto anche se
la patologia non si è ancora manifestata
• il test è in grado di prevedere che la patologia si
manifesterà in futuro
• l'esecuzione in soggetti sani solleva problemi di natura
etica
Caratteri complessi
Vincenzo Nigro
Dipartimento di Patologia Generale
Seconda Università degli Studi di Napoli
Telethon Institute of Genetics and Medicine
(TIGEM)
Caratteri non mendeliani
(non dipendenti dal genotipo in un singolo locus )
• continui (quantitativi)
• discontinui (dicotomi)
Rapporto genotipo-fenotipo
~25,000 gene e altri elementi di
regolazione
Tratti genetici o malattie
L’ereditabilità delle malattie comuni è dovuta a geni multipli ciascuno con
un piccolo effetto
un carattere non Mendeliano ha una
componente genetica?
• i genitori trasmettono
– i geni
– l’ambiente (questo vale specialmente per caratteri quali IQ e i
disordini psichiatrici)
• anche le abitudini alimentari, il clima, ecc.
• Occorre provare il ruolo dei geni al di là della ricorrenza
familiare
geni condivisi
•
•
•
•
•
gemelli monozigoti
fratelli, genitori-figli
fratellastri, zii-nipoti
cugini I grado
cugini II grado
•
•
•
•
•
1/1 consanguineità
1/2 consanguineità
1/4 consanguineità
1/8 consanguineità
1/32 consanguineità
gemelli monozigoti MZ
• hanno lo stesso sesso
• hanno gli stessi alleli
• hanno gli stessi polimorfismi
• se femmine, hanno un differente pattern di inattivazione
dell’X
• hanno un differente repertorio di immunoglobuline
• hanno un differente TCR
• spesso hanno un ambiente più simile
gemelli dizigoti DZ
• hanno lo stesso sesso nel 50% dei casi
• hanno il 50% degli alleli in comune
• hanno il 50% dei polimorfismi in comune
Occorre considerare il rapporto MZ/DZ che può
essere inferiore a 2 o superiore a 2 in
funzione del numero dei geni coinvolti
Errori sistematici di accertamento
• quanti figli affetti ha un coppia di portatori di un tratto
recessivo?
• ¼?
• se hanno due figli
• 8/14 (sarebbero 8/32, ma in 9 famiglie non ci sono
affetti)
correzione (LI-Mantel) p = (R-S)/(T-S)
R = numero di figli affetti
S = numero dei figli affetti singoli
Analisi parametrica
richiede un preciso modello di trasmissione
una piccola parte degli affetti può avere condizioni
Mendeliane indistinguibili dalla maggioranza non
Mendeliana e l’identificazione della causa Mendeliana
potrebbe on essere di aiuto
Breast Cancer (11 loci), Alzheimer (AD1-AD15) ALS (1-8)
Per caso molti fattori di suscettibilità sono presenti nella
maggior parte delle persone studiate e quindi si
considera un gene che fa spostare l’equilibrio
(Hirschsprung)
Analisi nonparametrica
Senza un modello
Non si sa a priori se la trasmissione è dominante o
recessiva o mista o poligenica, ecc
Si valuta quanta parte si condivide dei segmenti di DNA
nelle famiglie o nelle popolazioni
identity by state IBS
identity by descent IBD
significa che gli alleli sono
uguali apparentemente,
ma non è conosciuta la
loro origine
significa che gli alleli sono
uguali perché hanno una
comune origine
affected sib pairs ASP
con una segregazione casuale una coppia di fratelli (sib-pair)
condivide 2 alleli AC, 1 allele AD e BC, oppure o alleli BD per ogni
segmento di DNA
affected sib pairs ASP
Se la ipotetica condizione è dominante, 1 allele deve essere in
comune
necessariamente i fratelli devono avere in comune 2
alleli
‘Non-parametric’ linkage
Misura se gli affetti condividono dei marcatori ereditati da un
comune progenitore IBD più frequentemente rispetto al caso
AB
CD
AB
*
*
*
**
**
*
*
AC
AC
AC
AD
2 alleli
Marker unlinked
to susceptibility
gene
Marker linked to
susceptibility gene
CD
1 allele
25%
AB
AC
CD
BD
0 alleli
50%
25%
sib-pairs share alleles according to chance
40%
55%
5%
sib-pairs share alleles more often than
expected by chance
Problemi con il linkage non parametrico
Meno sensibile e quindi sono richiesti più sib-pairs
Più impreciso
Più difficilmente si può arrivare al gene
Soglia di significatività più elevata
LOD score significativo tra 3.6 e 5.3
LOD score altamente significativo >5.3
Difficoltà a replicare gli studi in una differente
popolazione
Studi di associazione
• Si testa se la presenza di una specifica variante
genica aumenta il rischio di ammalarsi
• Confrontano la frequenza dei markers tra casi e
controlli
Case-control
Family based association tests
(TDT)
Parental alleles:
Trasmitted -> A A
Non trasmitted -> B B
Test for different frequency of an allele in
cases vs controls
AB
AB
AA
Parental alleles not trasmitted to probands
are used as “internal controls”
TdT
• Transmission disequilibrium test
• (a-b)2/(a+b)
• a è il numero delle volte in cui un allele è
trasmesso
• b è il numero delle volte in cui l’altro allele
è trasmesso
Linkage disequilibrium mapping
Se le variazioni nella stessa regione non sono indipendenti
sono in linkage disequilibrium
M=allele of a
marker on the same
haplotype as the *
mutation
GWA (genomic wide association) studies
•
•
•
•
•
•
GWAs servono a comprendere la base genetica dei tratti
complessi
Per alcuni tratti ci sono molti loci: diabete, cancro della prostata e
della mammella, malattia infiammatoria intestinale, ecc
Per altri tratti i loci sono pochi: asma, malattia coronarica,
fibrillazione atriale
Sono diventati il metodo migliore per identificare fattori di rischio
per malattie complesse
Più potente del linkage se le varianti che conferiscono
suscettibilità sono comuni, mentre è meno potente se le varianti
sono rare
È necessario procedere con una mappa che comprende molti
marcatori a breve distanza l’uno dall’altro
usare SNPs comuni
Associazione indiretta
Gli SNPs sono genotipizzati sulla
base del linkage disequilibrium (LD)
Minor allele frequency = MAF
• MAF > 0.05 alleli comuni usati per GWA
• MAF >0.01 e <0.05 polimorfismi non comuni
• MAF<0.01 varianti rare innocue o mutazioni
recessive
Infinium, Illumina
Infinium HD
BeadChip
Markers
(per
sample)
Median Marker
Spacing
Human1MDuo
>1.1 million
1.5kb
Human660W
-Quad
>658,000
2.5kb
HumanCytoS
NP-12
~300,000
10kb
Human510SDuo*
>510,000
3.2kb
genotipizzazione di ciascun SNP
aploblocchi nel genoma
gene nr 24680
100 kb
all common variants
>0.05; 6 000 K
Gli aploblocchi sono dovuti alla mancanza di ricombinazione
punti critici dei GWAs
• Selezione dei casi
– minimizzare l’eterogeneità fenotipica?
– focalizzazione su casi familiari?
– scegliere casi ad insorgenza precoce?
• Selezione dei controlli
– Controlli comuni a differenti tratti?
– 3000 controlli della Wellcome Trust Case Control
Consortium
• Significatività statistica
– GWS genome wide significance = p < 5 x 10–8
– Replica dello studio su una differente popolazione
Tremore
• 02/25/09 Stefansson
February 01, 2009 Nat Genet
Variant in the sequence of the LINGO1 gene confers risk
of essential tremor Essential tremor
• 452 cases
• 14,378 controls
• 15q24.3
• LINGO1
• 1 x 10-9
• Illumina [305,624]
obesità
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
01/15/09Thorleifsson December 14, 200Nat Genet
Genome-wide association yields new sequence variants at seven loci that associate
with measures of obesity
Body mass index
Studio iniziale: 80,969 individuals
Replica: 11,036 individuals
16q12.2 FTO 1 x 10-47
2p25.3 TMEM18 4 x 10-17
16q12.2 18q21.32 19q13.11 1p31.1 3q27.2 16p11.2 11p14.1 11p14.1 1q25.2
12q13.13 1p21.3 11p14.1
FTO MC4R KCTD15, CHST8 NEGR1 SFRS10, ETV5, DGKG SH2B1, ATP2A1
BDNF BDNF SEC16B, RASAL2 BCDIN3D, FAIM2 NR BDN
4 x 10-13 1 x 10-12 7 x 10-12 1 x 10-11 7 x 10-11 3 x 10-10 5 x 10-10 9 x 10-10 6 x
10-8 1 x 10-7 4 x 10-6 8 x 10-6 8.04 [6.96-9.12] % SD 6.12 [4.69-7.55] % SD 5.25
[3.82-6.68] % SD 4.38 [3.16-5.60] % SD 4.18 [2.98-5.38] % SD 3.77 [2.67-4.87] %
SD 4.42 [3.09-5.75] % SD 3.63 [2.49-4.77] % SD 4.58 [3.07-6.09] % SD 3.85 [2.625.08] % SD 3.36 [2.14-4.58] % SD 3.28 [2.06-4.50] % SD 2.6 [1.50-3.70] % SD 3.15
[1.78-4.52] % SD
Illumina [305,846]
Aneurismi intracranici
• Bilguvar November 09, 2008 Nat Genet
Susceptibility loci for intracranial aneurysm in European
and Japanese populations
• 1,580 European cases, 6,276 European controls
• 495 Japanese cases, 676 Japanese controls
• 8q11.23 SOX17 1 x 10-10
• 9q21.3 CDKN2A CDKN2B 1 x 10-10
• Illumina [289,271]
http://www.genome.gov/19518660
Manhattan plot
GWA Diabete di tipo 2
Crom 10 TCF7L2 transcription factor 7-like 2
Crom 16 FTO fat mass and obesity associated
Crom 6 CDKAL1 = CDK5 regulatory subunit associated protein 1-like 1
Studi GWA che hanno raggiunto una significatività per varie
forme di cancro
Breast Cancer FGFR2 10q26.13 Odds Ratio=1.26 p= 2 x 10-60
Testicular Germ Tumour KITLG 12q21 OR=2.69 p= 3 x 10-30
Effetto combinato delle varianti in quattro forme di cancro
ruolo delle delezioni nella predisposizione genetica a una malattia
Associazione sintetica
Il blocco di LD non è
abbastanza grande da
includere le varianti
più rare associate alla
malattia e si potrebbe
pensare che la
variante comune abbia
una funzione
regolatoria
Materia oscura
Dark matter
Concetti generali di terapia genica
•
•
•
•
Inibizione mirata dell’espressione genica per bloccare un
processo patologico
Distruzione mirata geneticamente di specifiche cellule
Supplementazione: fornire una copia funzionante del
gene difettoso
Sostituzione: sostituire il gene mutante con una copia
funzionante in situ
Supplementazione: fornire una copia
funzionante del gene difettoso
• ex vivo: trasferire i geni clonati in cellule in coltura,
selezionare le cellule, espanderle in vitro e poi
immetterle nel paziente
• in vivo: trasferire direttamente i geni nel tessuto
bersaglio o in circolo, facendo in modo che poi arrivi al
tessuto bersaglio
ex vivo
Vettori non virali per la terapia genica
• Liposomi: vescicole sintetiche che si formano
quando alcuni lipidi sono in soluzione acquosa.
Possono essere anionici e circondano il DNA o
cationici e legano il DNA all’esterno
• iniezione diretta di plasmidi o bombardamento
del tessuto del DNA attaccato a pellets di
metallo (biolistico). Il trasferimento è molto
basso e il DNA non è integrato.
Liposomi
Virus per la terapia genica
• Retrovirus: sono ad RNA e sintetizzano cDNA che
integrano casualmente nel genoma dell’ospite quando si
dissolve la membrana nucleare (divisione cellulare)
• Adenovirus: sono a DNA e capaci di trasdurre ad alti
titoli tutte le cellule, ma in forma episomale. E’ molto
forte la reazione immunitaria. Morte di Jesse Gelsinger
nel 1999
• Adeno-associati (AAV) hanno DNA a singola elica e si
potrebbero integrare sul cromosoma 19q13 grazie al
gene rep. Ma il 96% del genoma è deleto. Possono
ospitare fino a 4.5kb
• Lentivirus: sono retrovirus specializzati che infettano
anche le cellule non in divisione. Sono più complessi dei
retrovirus e sono capaci di un’espressione a lungo
termine.
Vettori virali per la terapia genica
Genoma
Stato
Capacità
Target
Dna
Integrato
Episomal
4.7 kb
D/ND
Adeno
Dna
Episomal
< 36 kb
D/ND
Retro
Rna
Integrato
8 kb
D
Lenti
Rna
Integrato
8 kb
D/ND
HSV
Dna
Episomal
>50kb
D/ND
AAV
Virus Adeno-associato
Famiglia: Parvoviride
Genere : Dependovirus
Genoma : DNAss 4.7kb
Bersaglio: Cellule in divisione e cellule non in divisione
Stato : episomale/integrazione sito specifica su 19q13.3
Sierotipi : 10 AAV1-10
ITR
AAV2
ITR
Cap
Rep
Rep78
Rep68
Rep52
Rep40
VP1
VP3
VP2
AAV RICOMBINANTI
REP
ITR
p5
p19
TRANSGENE
CAP
p40
ITR
Plasmide Cis
TRANSGENE TERAPEUTICO MAX 4.5kb
ITR
ITR
Produzione di vettori rAAV
pro rep2
ITR2
Pro
ITR2
Transgene
cap
Trans
pA
E2A
Cis
E4
VAI
Adeno Helper
Tripla trasfezione
HEK 293 cells
(E1)
rAAV
rAAV Pseudotipizzati
ITR 2
ITR 2
gene terapeutico
AAV2/1 (6)
ITR 2
AAV2/8
Cap 3
Rep 2
Cap 4
Rep 2
Cap 5
Rep 2
Cap 7
Rep 2
Cap 8
ITR 2
AAV2/7
ITR 2
Rep 2
ITR 2
AAV2/5
ITR 2
Cap 2
ITR 2
AAV2/4
ITR 2
Rep 2
ITR 2
AAV2/3
ITR 2
Cap 1
ITR 2
AAV2/2
ITR 2
Rep 2
ITR 2
DIFFERENZE TRA SIEROTIPI AAV 1-8
PROTEINE CAPSIDE
¾ ANTIGENICITA’
¾
TROPISMO
¾
AAV1 Muscolo,retina
¾
AAV2 Muscolo,fegato
¾
AAV4 Cervello
¾
AAV5 Cervello,polm.
¾
AAV6 Muscolo,retina
¾
AAV7 Muscolo,fegato
¾
AAV8 Fegato
¾
RECETTORI
¾
AAV2 FGFR1,EPARINA
¾
AAV4
¾
Ac.SIALICO
¾
AAV5
¾PDGFR,
Ac.SIALICO
Vantaggi
•Non patogeni
•Espressione genica efficiente e a lungo termine
•Pochi effetti immunologici
•Ampia varietà di cellule ospiti
•Infezione di cellule in divisione e non in divisione
Svantaggi
•Dimensioni dell’inserto non superiori alle 4.5kb
•Produzione di anticorpi anti-AAV
No risomministrazione del vettore virale
AAV2