Diagnosi genetiche
molecolari
INDICAZIONI per la diagnosi genetica
Ricorrenza nella famiglia di una malattia genetica
- identificazione dei portatori
- confermare la diagnosi basata sul quadro clinico
- accertare la condizione presintomatica di patologie ad esordio tardivo
- accertare la suscettibilità a sviluppare patologie complesse
- diagnosi prenatale
In certi casi l’indagine è limitata
ad una specifica mutazione (saggi diretti)
o ad un polimorfismo associato al gene (saggi indiretti)
in altri casi si deve analizzare un gran numero di mutazioni note o
cercare mutazioni sconosciute
INDICAZIONI per la diagnosi genetica
Screening neonatale
è indicato per malattie molto comuni, come la PKU o la CF, per le quali
un intervento terapeutico immediato assicura un beneficio
In questi casi l’indagine va eseguita per molte mutazioni
o almeno per le varianti più frequenti in una data popolazione
LE STRATEGIE
La scelta del saggio da utilizzare è cruciale
ll metodo deve garantire
- specificità
- sensibilità
- esecuzione rapida
- bassi costi
Un metodo è INAFFIDABILE se ci sono
Falsi positivi il saggio indica che la mutazione è presente quando non lo è
Falsi negativi il saggio non individua la mutazione che è presente
LE STRATEGIE
Problemi dei test predittivi
Tecnici:
Medici:
Etici:
molti geni- molte mutazioni
significato clinico spesso incerto
consulenza genetica
fattori ambientali
prevenzione e trattamento
riservatezza dell’informazione
coinvolgimento di altri membri della famiglia
LE STRATEGIE
Test genetico predittivo - una definizione
Offre la possibilita’ di prevedere il rischio
statistico che un soggetto sviluppi una malattia e
di rispondere con un intervento terapeutico mirato
sulla base della determinazione del genotipo per
una o piu’ mutazioni geniche
LE STRATEGIE
La malattia è causata
- da una sola mutazione o da un
piccolo numero di mutazioni diverse
ben caratterizzate in un gene noto
saggi allele-specifici
- da numerose mutazioni diverse in
un gene noto
saggi che permettono di
rivelare differenze
rispetto al gene normale
- da mutazioni in un gene di cui si
conosce il locus ma non la sequenza
saggi che seguono la
trasmissione del locus nella
famiglia (saggi indiretti)
TIPI DI MUTAZIONI
• piccole delezioni
• espansioni di triplette (TRE)
• mutazioni missense
• mutazioni troncanti (non sense o frameshift)
• mutazioni in regioni non codificanti (regolatrici) o nei siti di splicing
TIPI DI CELLULE
- cellule embrionali preimpianto (fecondazione in vitro)
- coriociti o villociti o trofoblasti (8a-9a settimana di gestazione)
- amniociti (dalla 16a settimana di gestazione)
- linfociti
- fibroblasti
- cellule epiteliali
- spermatozoi
La quantità del materiale di partenza (DNA o RNA)
può essere minima se può essere amplificata con la
PCR
AMNIOCENTESI
AMNIOCENTESI
VILLOCENTESI
o CVS (corion villi sampling)
VILLOCENTESI
o CVS (corion villi sampling)
PCR - Reazione a Catena della DNA-Polimerasi
Denaturazione al calore
Appaiamento degli inneschi
Sintesi del filamento complementare
PCR - Reazione a Catena della DNA-Polimerasi
Amplificazione di
un frammento di DNA
Denaturazione al calore
Appaiamento degli inneschi
Estensione degli inneschi
con la DNA polimerasi
Denaturazione al calore
Appaiamento degli inneschi
PCR - ASO (allele specific oligonucleotide)
A
T
G
C
ARMS Amplification Refractory Mutation System
Si allestiscono due reazioni
diverse in cui ciascuno dei
due inneschi viene
accoppiato ad uno stesso
primer reverse
L’amplificazione procede
solo se è presente il DNA
con la sequenza
complementare all’innesco
T
C
omozigoti
T
T
C
omozigoti
C
T
C
eterozigoti
T/C
DELEZIONI
DNA normale
DNA deleto
Shift della banda
N/ N
D/D
N/D
Su gel di poliacrilammide si possono osservare shift anche per
tre sole bp come la mutazione F508 della CF
Espansione di triplette ripetute (TRE)
CAG CAG CAG……… CAG CAG CAG
sequenza
fiancheggiante
omozigoti
normali
CAG(n)
sequenza
fiancheggiante
eterozigoti omozigoti
con espansione
RFLP - polimorfismo dei frammenti di restrizione
sito presente
omozigote
++
sito assente
omozigote
--
eterozigote
RFLP - Diagnosi indiretta
GENE D
Il gene D è associato al sito RFLP
La mutazione che causa
la malattia è in linkage
con l’allele 2 (+) dell’RFLP
+/ricombinante
RFLP - Diagnosi diretta
Mst II
Gene della beta-globina
Hb A Pro – Glu - Glu
CCT-GAG-GAG
Mst II
Hb S Pro – Val - Glu
CCT-GTG-GAG
AA
SS
AS
I saggi basati sulla chemioluminescenza
I nucleotidi marcati con BIOTINA
si legano
alla streptavidina o avidina
Ogni molecola di avidina ha quattro siti
La fosfatasi alcalina o la perossidasi
marcate con BIOTINA si legano alla
streptavidina o avidina
Si aggiunge un substrato
dell’enzima che dia un prodotto
fotoemittente o
chemioluminescente
PCR-OLA (oligonucleotide ligation assay)
La sonda X può appaiarsi con il
DNA di uno solo dei due alleli
con T ma NON con G
La sonda Y si appaia a valle della sonda X
LIGASI
DNA normale
LIGASI
DNA mutante
PCR-OLA (oligonucleotide ligation assay)
Il pozzetto è ricoperto con
streptavidina e lega l’estremità
biotinilata della sonda X
Se è avvenuta la ligazione
con la sonda Y
la DIGOSSIGENINA si lega
all’anticorpo coniugato con la
fosfatasi alcalina
Rivelazione colorimetrica
La fosfatasi alcalina reagisce con il
substrato cromogeno e si sviluppa il colore
Faro molecolare
Non emette
fluorescenza
Emette fluorescenza
solo quando trova la
sequenza
complementare
Se la sequenza è deleta non si osserverà comparsa di fluorescenza
permette di identificare solo omo- o emizigoti
per esempio per la diagnosi delle delezioni DMD
MASDA multiplex allele-specific diagnostic assay
Sonde specifiche per diverse mutazioni fissate ad una membrana
DNA da saggiare amplificato con diverse coppie di primer specifici
ibridizza SOLO con la sonda complementare
La rivelazione (SPOT) può essere
colorimetrica o per chemioluminescenza o per fluorescenza
PTT protein truncation test
Il primer contiene a monte
la sequenza del promotore di T7
e la sequenza di inizio della traduzione
allineata con la sequenza di ATG del gene
PCR
ATG
Il prodotto ottenuto può essere TRASCRITTO e TRADOTTO in vitro
in presenza di mutazioni sconosciute che causano il troncamento
della proteina (non sense o frameshift)
il prodotto proteico mutante sarà più corto del prodotto normale
Analisi completa delle mutazioni sconosciute
Metodi che rivelano la presenza di una mutazione
ma non la sua posizione e la sua natura
- SSCP single strand conformational polymorphism
- DGGE denaturing gradient gel electrophoresis
- CMC chemical mismatch cleavage (heteroduplex)
- EMC enzymatic mismatch cleavage (heteroduplex)
Metodi che identificano
l’esatta posizione e natura della mutazione
- MICROARRAY o CHIP a DNA
- Sequenziamento del DNA
