Il Contesto sociale:
la ragione del Progetto
Negli anni più recenti in Puglia, come nel resto del Paese, l’aumento della
popolazione anziana ha posto nuovi e urgenti problemi di ordine medico e sociale.
In particolare, la patologia tumorale solida, che è divenuta sempre più
frequente, difficilmente risulta trattabile nell’anziano perché si giova di
trattamenti chemio-radioterapici aggressivi ma attuabili con successo nel giovane.
Parallelamente, sul versante delle emopatie, le patologie quali il Mieloma
Multiplo, i Linfomi non-Hodgkin, La Leucemia Linfoide Cronica e le Leucemie
acute , un tempo rare, sono oggi divenute assai frequenti e , pertanto , richiedono
sempre più un’adeguata offerta sanitaria e nuove e più efficaci strategie
terapeutiche.
E’ divenuto, quindi, urgente il bisogno di soddisfare le esigenze terapeutiche
connesse a tali patologie e, soprattutto , a tale categoria di pazienti ricercando
nuove strategie terapeutiche.
In quest’ottica, un’eccellente risposta proviene dal mondo delle cellule staminali.
Il Contesto scientifico:
Le Cellule Staminali e
le Terapie Cellulari
CHE COSA SONO LE CELLULE
STAMINALI?
Le cellule staminali sono cellule immature, non differenziate e
non specializzate, in grado di dividersi per periodi indefiniti per automantenersi
dando origine ad altre cellule staminali e di differenziarsi per dare origine ai
numerosi tipi di cellule specializzate dotate di specifiche attività funzionali che
compongono ogni singolo organo o tessuto , rimpiazzando, la dove è possibile, le
cellule adulte che , terminato il loro ciclo vitale, sono destinate a morire
(esempio: cellule muscolari , cellule del sangue e cellule cerebrali ).
Spetta, dunque, alle cellule staminali il compito di costruire e mantenere
inalterato il complesso, ma estremamente ordinato, insieme di cellule
differenziate che formano l’organismo vivente.
Tuttavia, prima di diventare una cellula specializzata, una cellula staminale
attraversa una serie di decisioni. Combinazioni di segnali interni ed esterni
guidano ogni cellula staminale lungo il cammino verso la specializzazione. Questi
segnali sono normalmente forniti dal corpo ma quando, come e perché una
cellula staminale prende la decisione di smettere di dividersi , orientandosi in
senso differenziativo ed in risposta a quali segnali non è ancora chiaro e
rappresenta la chiave per la comprensione della loro biologia e per il loro pieno
utilizzo futuro in campo terapeutico.
Le Cellule Staminali:
proprietà e caratteristiche
A seconda della potenzialità evolutiva , le cellule staminali si distinguono in :
• Totipotenti: in grado di differenziarsi in qualsiasi tipo di tessuto.
• Pluripotenti (o multipotenti) : in grado di trasformarsi solo in alcuni tipi
di tessuto.
• Unipotenti: in grado di dar luogo solo ad uno specifico tessuto.
Le cellule staminali multipotenti possono essere isolate da alcuni tipi di tessuto
presenti nel bambino e nell’uomo adulto, ove sono presenti per rimpiazzare le
cellule in continuo ricambio.
Oltre alla potenzialità, le cellule staminali possono essere distinte anche in base alla
sede in:
• Cellule staminali embrionali :prelevate cioè da embrioni
• Cellule Staminali adulte: prelevate dal corpo umano (midollo osseo,
sangue periferico ed alcuni organi come fegato, pancreas, cordone
ombellicale)
Le cellule staminali embrionali derivano dalle cellule della “massa cellulare
interna” che si osserva nella blastocisti. Prelevate dalla blastocisti , possono essere
coltivate in vitro dove sono in grado di generare un vasto range di tessuti
endodermici, mesodermici ed ectodermici dell’embrione. Le cellule staminali
embrionali sono le uniche totipotenti; infatti da esse derivano tutti i differenti tipi
cellulari che daranno luogo, a partire dal momento della fecondazione ed
attraverso le varie fasi della vita fetale, al corpo umano. Tuttavia , l’utilizzo, a scopo
terapeutico, di cellule staminali embrionali umane appare prematuro, in quanto
gravato da numerose problematiche tecno-scientifiche irrisolte oltre che da
problematiche bioetiche e biogiuridiche. Pertanto, allo stato attuale, le cellule
staminali embrionali sono oggetto di accese discussioni all’interno del mondo
scientifico per le implicazioni di ordine etico-morale che il loro utilizzo
comporterebbe nonostante , la loro estrema immaturità ed elevata potenzialità
evolutiva , le rendano candidati molto promettenti per applicazioni di medicina
rigenerativa e per la cura di gravi malattie degenerative.
Le Cellule Staminali
Adulte:
Dopo la nascita, in un organismo permangono comunque in ogni organo
o tessuto cellule staminali che, tuttavia, hanno una potenzialità ridotta poiché
di tipo tessuto-specifico. Le cellule staminali presenti in tali sedi sono ,
pertanto , definite Cellule Staminali Adulte o Somatiche.
Le cellule staminali somatiche sono cellule multipotenti, nondifferenziate, che si trovano in un tessuto differenziato e sono capaci di automantenimento e differenziazione. Cellule staminali adulte sono state
identificate nel midollo osseo, sangue periferico, sangue del cordone ombelicale
e più recentemente anche nella cornea, retina, cervello, muscolo scheletrico,
polpa dentale, fegato, pancreas, cute, tratto gastro-enterico, tessuto adiposo.
Tutte le diverse tipologie di cellule staminali si distinguono dalle altre cellule
perché sono cellule non differenziate, o non specializzate, nel senso che non
hanno ancora acquisito una funzione specifica all’interno dell’organo stesso.
Le Cellule Staminali
Adulte:
Emopoietiche e Mesenchimali
La principale caratteristica delle cellule staminali adulte è, dunque,
ancora la potenzialità di dare origine a diverse tipologie di cellule.
In relazione al tipo di tessuti che possono essere generati si parla di:
• Cellula Staminale Emopoietica, in grado di generare le cellule del
sangue (globuli rossi e bianchi , pistrine, linfociti etc)
• Cellule Staminali Mesenchimali: in grado di generare tutti i tipi di
tessuti (ossa, cartilagini, tendini, fibre muscolari, tessuto cerebrale, ecc)
Sfruttando le loro caratteristiche peculiari, l’applicazione terapeutica delle cellule
staminali consiste nella loro utilizzazione a scopo di rigenerazione tessutale. In tal
senso , le cellule staminali dell’adulto costituiscono attualmente la sorgente
esclusiva per il trattamento di patologie neoplastiche e non-neoplastiche.
Le Terapie Cellulari:
I Prodotti per Terapie Cellulari o PTC
In questo contesto si inseriscono ed operano le Terapie Celluari che
rientrano nelle cosiddette “Advanced Therapies”. La ricerca biomedica e
biotecnologica è , infatti, attualmente incentrata sulla abilità di produrre cellule
umane in vitro sfruttando la capacità proliferativa delle cellule staminali, associata
alla loro abilità di diventare specializzate (plasticità).
Quest’area applicativa delle cellule staminali viene definita per l’appunto
Terapia Cellulare. La definizione di Terapie Cellulari è di ampio respiro e
comprende molteplici applicazioni. In una delle accezioni più diffuse , il termine
viene usato per indicare una modalità di cura di alcune malattie in cui, assieme ai
farmaci tradizionali, vengono impiantate come trattamento terapeutico in un
individuo ricevente, cellule sottoposte a particolari procedure di prelievo,
manipolazione, caratterizzazione e conservazione, definite per l’appunto “Prodotti
per Terapia Cellulare” o PTC.
Secondo la FDA i prodotti per le terapie cellulari sono, infatti : “articles
containing human cells that are intended for implantation,
transplantation, infusion, or transfer into a human recipient”.
Scopo di tali prodotti è indurre e determinare, partendo da cellule
totipotenti, un processo di ingegnerizzazione, che specializza la cellula a una
determinata e specifica funzione biologica. Si tratta, quindi, di cellule di un
paziente o di un donatore (cellule staminali, cellule dendritiche, linfociti
T)sottoposte a manipolazione cellulare o genetica che sono poi somministrate ad
un ricevente per diversi scopi tra cui il killing del tumore, l’attivazione del sistema
immunitario, la rigenerazione tessutale etc.
I PTC , Prodotti per
Terapia Cellulare:
I risvolti scientifici
L’impiego di tali cellule nella medicina rigenerativa ha le potenzialità di
sviluppare nuove terapie per numerose malattie degenerative gravi poiché, la
capacità proliferativa associata all’abilità di specializzarsi di tali cellule le rende
candidati ideali per nuovi protocolli clinici da impiegare nel trattamento di
malattie gravi quali morbo di Parkinson, diabete, infarto miocardico,etc. Gli
approcci di terapia avanzata rappresentano, pertanto, un elemento di grande
potenziale nella sinergia tra sanità pubblica, mondo farmaceutico ed area biotech
oltre che una frontiera scientifica di enorme interesse in cui la ricerca incontra
un’applicazione clinica reale e diventa un beneficio per il paziente e per
l‘aggiornamento e il progresso della sanità nazionale.
Il percorso per arrivare alla realizzazione di un protocollo clinico con PTC
è, tuttavia ,complesso, lungo e costoso. Alcuni vincoli sono codificati per legge: si
parte dai dati preclinici per arrivare all’elaborazione di un dossier di
sperimentazione che deve essere sottomesso e approvato dall’ISS. Segue la
convalida della produzione che deve rigorosamente avvenire in una struttura
autorizzata dall’AIFA e l’approvazione del protocollo da parte del Comitato Etico.
Tutti i casi arruolati in studi clinici con PTC devono essere registrati in un
registro nazionale.
Le Terapie Cellulari:
Campi di Applicazione
Gli approcci di terapia avanzata rappresentano, pertanto, un elemento di
grande potenziale nella sinergia tra sanità pubblica, mondo farmaceutico ed area
biotech oltre che una frontiera scientifica di enorme interesse in cui la ricerca
incontra un’applicazione clinica reale e diventa un beneficio per il paziente e per
l‘aggiornamento e il progresso della sanità nazionale. I PTC o più in generale cellule ,
opportunamente selezionate, eventualmente manipolate e/o ingegnerizzate , ed
espanse trovano, infatti, impiego nei :
1. Trapianti di Cellule Staminali in campo onco-ematologico:
manipolazione ed espansione ex-vivo di progenitori emopoietici,
criopreservazione e colture cellulari di cellule staminali emopoietiche che
vengono poi impiantati in pazienti affetti da patologie onco-ematologiche
2. Somministrazione di Cellule in campo oncologico e non:
• Vaccinoterapia : impiego di cellule dendritiche opportunatamente
stimolate nel trattamento di melanomi, carcinomi renali etc,
• Immunoterapia Cellulare Adottiva : impiego di linfociti T
opportunamente stimolati nel trattamento di neoplasie o infezioni virali
• Trattamento della GVHD : impiego di Cellule Staminali Mesenchimali
come strumento immunosoppressivo nel trattamento della reazione di
rigetto dei trapianti.
3. Medicina rigenerativa : impiego di cellule opportunatamente
specializzateper la riparazione tissutale in campi come :
• Cardiologia : somministrazione intracoronarica di cellule CD133+ da
midollo e sangue periferico in pazienti colpiti da infarto miocardico acuto
• neurologia: somministrazione di cellule staminali nella terapia delle
malattie demielinizzanti)
• diabetologia: trapianto di isole pancreatiche umane nei pazienti affetti da
diabete mellito di tipo I
4. Ricerca: impiego delle cellule staminali come modelli sperimentali nello
studio della biologia cellulare, del tumore, della reazione immunitaria etc.
5. Farmacologia-Sperimentazione : impiego delle cellule staminali come
modelli sperimentali per lo studio di nuovi farmaci e di nuovi protocolli clinici.
Le Terapie Cellulari:
Applicazioni, le Cellule Staminali
Emopietiche (CSE)
Nell’ambito delle molteplici applicazioni , tuttavia , il principale prototipo
di riferimento della terapia cellulare nonché l’unico ad avere una concreta e
continua applicazione pratica è il trapianto di midollo osseo, una modalità di
trattamento sviluppatasi nell’ultimo trentennio, cui si è negli anni più recenti
affiancato il trapianto di cellule staminali da sangue periferico ed il trapianto di
sangue da cordone ombelicale. Pertanto, più genericamente si parla di trapianto
di Cellule Staminali Emopoietiche.
Tra i vari tipi di cellule staminali somatiche , le cellule staminali
emopoietiche, prelevabili dal midollo osseo, sangue periferico e cordone
ombelicale, sono le uniche , allo stato attuale, ad avere applicazione clinica su
vasta scala, come sorgenti di trapianto autologo o allogenico, rappresentando
così l’originale terapia cellulare.
Le Cellule Staminali Emopoietiche (CSE) sono funzionalmente
definite da tre caratteristiche peculiari:
1) capacità di automantenimento,
2) capacità di differenziazione
3) capacità di ricostituzione linfo-emopoietica a lungo termine in un ricevente
letalmente irradiato.
La loro funzione è mantenere la produzione di cellule mature del sangue
periferico per tutta la durata di vita di un organismo e al contempo
automantenersi per assicurare una continua e duratura scorta di cellule
staminali.
Oltre ad auto-mantenimento e differenziazione, le
cellule staminali emopoietiche sono dotate di
plasticità, capacità
migratoria,
capacità di
sopravvivere in uno stato cinetico di quiescenza,
capacità di rigenerare estensivamente i differenti tipi
cellulari che costituiscono i tessuti emopoietici.
Le Cellule Staminali
Emopoietiche (CSE):
Caratteristiche e Funzioni
Le CSE danno origine, in particolare a progenitori che, per definizione, non
sono riconoscibili morfologicamente ma solo funzionalmente, in base alla loro
capacità di crescere e proliferare in sistemi di coltura in vitro. I progenitori
ontogeneticamente più precoci perdono progressivamente la capacità di
automantenimento ma sono in grado di orientarsi lungo le varie filiere
differenziative emopoietiche (linfoide, mieloide, eritroide, megacariocitaria)
generando aggregati di cellule progenitrici unipotenti che, a loro volta, generano
precursori emopoietici morfologicamente riconoscibili, destinati a dare origine a
cellule mature terminali dotate di funzioni specializzate ma completamente prive
di potenziale proliferativo.
Le Cellule Staminali
Emopoietiche (CSE):
Le CSE del sangue cordonale
Le cellule staminali emopoietiche sono molto rare. Infatti solo 1 cellula su
10,000-15,000 del midollo osseo è una cellula staminale e deve garantire
giornalmente la produzione di centinaia di miliardi di cellule per rimpiazzare
quelle distrutte.
Un’ulteriore sorgente è il sangue del cordone ombelicale che prima ed al
momento della nascita ne contiene un elevato numero. La percentuale è
equivalente o addirittura superiore a quella del midollo osseo ma le
potenzialità di tali cellule staminali sono di gran lunga superiori rispetto a
quelle già “più adulte” del midollo ed danno luogo ad una probabilità di
rigetto inferiore rispetto a quelle del periferico o da midollo. Ciò è
probabilmente dovuto al fatto che esse non hanno ancora sviluppato le
caratteristiche che possono essere riconosciute ed attaccate dal sistema
immunitario. Inoltre, poiché il sangue del cordone ombelicale non ha ben
sviluppato cellule immunitarie, ci sono meno possibilità che le cellule
trapiantate possano attaccare il ricevente, una possibilità e problema
definito graft versus host disease o GVHD. Pertanto, sia la versatilità che la
disponibilità di cellule staminali del cordone ombelicale li rende una risorsa
potente per le terapie di trapianto ed una sorgente di studio fondamentale
per la ricerca. Infatti, il sangue cordonale raccolto senza alcun rischio o
inconveniente per la madre o il neonato può esse utilizzato come alternativa
al midollo osseo, nei trapianti in pazienti affetti da malattie ematologiche.
Le CSE:
Il Midollo Osseo
L’applicazione terapeutica peculiare delle cellule staminali emopoietiche è
rappresentato dal loro utilizzo nella terapia delle malattie neoplastiche
ematologiche (leucemie, mieloma, linfomi), sia nell’ambito del trapianto autologo
che allogenico. Infatti, in particolari fasi della malattia, le cellule staminali
emopoietiche vengono iniettate, attraverso una vena, nel sangue periferico del
paziente. Nell’arco di pochi giorni, raggiungono il midollo osseo, dove
attecchiscono ed iniziano a proliferare andando a ricostituire le cellule mature
midollari, che erano state completamente distrutte dalla radio-chemioterapia alla
quale era stato sottoposto il paziente.
La funzione del midollo osseo è schematicamente basata sull’esistenza di
quattro compartimenti cellulari:
a) compartimento delle cellule staminali, formato da cellule capaci di
automantenersi e differenziarsi;
b) compartimento dei progenitori orientati, costituito da cellule in grado di
differenziarsi e maturare lungo tutte le filiere differenziative emopoietiche ma
prive di automantenimento;
c) compartimento dei precursori identificabili morfologicamente;
d) compartimento delle cellule mature, costituito da cellule dotate di funzioni
specializzate ma completamente prive di capacità proliferativa.
Le Terapie Cellulari:
Applicazioni, l’ Immunoterapia Cellulare
Adottiva e la Vaccinoterapia
Oltre ad aver curato e guarito molte migliaia di pazienti, i trapianti di CSE
hanno fornito la base conoscitiva per lo sviluppo di vaccini cellulari utilizzabili
contro i tumori o contro alcune gravi infezioni virali e per indurre tolleranza
immunologica. Infatti, parallelamente all’uso delle cellule staminali emopoietiche
nel trapianto di midollo, diventa sempre più concreta la possibilità di utilizzare
cellule del sistema immunitario (linfociti T e cellule dendritiche) come stimolanti
della risposta immunologica del paziente tumorale nei confronti del proprio
tumore, o come veri e propri effettori nelle infezioni virali, cioè come veri e
propri vaccini cellulari. Essa è attuata mediante l’infusione di subset cellulari che,
per loro natura o perché manipolate ex-vivo, sono in grado di regolare la risposta
immune in caso di trapianto o malattie autoimmuni (cellule regolatorie, cellule
NK, cellule mesenchimali) o di produrre una potente e selettiva risposta contro
antigeni tumorali o virali (cellule dendritiche, cloni cellulari citotossici).
Si parla in questi casi di Immunoterapia cellulare adottiva e di
Vaccinoterapia.
L’Immunoterapia Cellulare
Adottiva:
Le caratteristiche
La caratterizzazione molecolare degli antigeni tumorali umani ha, infatti,
consentito, in questi ultimi anni, di pianificare delle nuove strategie di
immunoterapia anti-tumore da affiancare alle terapie convenzionali.
Gli antigeni tumorali sono riconosciuti da specifici linfociti T (T CD8+ e CD4+)
e, mediante tecniche di terapia genica si possono introdurre nei linfociti T dei
recettori ibridi o chimerici (ChTCR) in grado di riconoscere tali antigeni e
uccidere le cellule bersaglio che li espongono. Tuttavia, al fine di indurre delle
risposte immunitarie anti-tumore efficaci, è indispensabile che gli antigeni
tumorali siano presentati ai linfociti T da cellule “professioniste” della
presentazione antigenica: le cellule dendritiche. Tali cellule sono in grado di
veicolare lo stimolo antigenico ed i segnali costimolatori necessari allo sviluppo
di una risposta immunitaria anti-tumore efficace.
Il trattamento prevede di prelevare cellule dendritiche al paziente, di
moltiplicarle in laboratorio e “caricarle” con gli specifici antigeni tumorali, per
poi reimpiatarle nell’organismo del malato per flebocisti. Si attua così una
strategia cosiddetta di “immunoterapia adottiva” in cui i linfociti T infusi
nel malato e opportunamente stimolati contro il tumore, lo aggrediscono con
maggior forza.
La Vaccinoterapia:
Le caratteristiche
I processi infettivi, in particolare quelli causati da agenti virali,
costituiscono la causa principale di mortalità post-trapianto. Fino al 75% dei
pazienti trapiantati sviluppa infezioni nel corso del primo anno post-trapianto.
La causa primaria del fenomeno è riconducibile all’inibizione della risposta
immune cellulo-mediata virus-specifica indotta dai farmaci immunosoppressori
utilizzati per la prevenzione del rigetto. Poiché le cellule T giocano un ruolo
chiave nel controllo e nella clearance delle infezioni virali, lo stato di
immunodepressione facilita casi di infezione primaria, reinfezione o riattivazione
dalla latenza di agenti virali ad elevata prevalenza, quali ad esempio i virus
erpetici, con possibile sviluppo di patologie sistemiche o di organo.
Il trattamento di queste infezioni presenta problematiche rilevanti sia per
la scarsità dei farmaci antivirali utilizzabili, sia per la loro tossicità. Una possibile
alternativa, ormai validata clinicamente, è rappresentata dalla somministrazione
al paziente di linfociti T virus-specifici, prelevati ex-vivo ed espansi in vitro, in
modo da permettere al paziente stesso di sviluppare una risposta citotossica nei
confronti delle cellule infettate, risposta efficace sia come profilassi, sia come
terapia di manifestazioni patologiche virus-indotte potenzialmente letali per il
paziente.
Le Terapie Cellulari:
Applicazioni, Le Cellule Staminali
Mesenchimali
Il trapianto allogenico di cellule staminali ematopoietiche (HSCT) è
diventato oggi il trattamento di scelta per numerosi disordini ematologici
neoplastici e non, tumori solidi, errori congeniti del metabolismo ed
immunodeficienze primitive. Tuttavia, la sua ampia applicazione è limitata
dall’insorgenza di diverse complicazioni, tra cui la malattia del trapianto verso
l’ospite (GVHD) e/o l’insorgenza di infezioni virali.
La Terapia Cellulare , ancora una volta, fornisce una possibile
soluzione: le Cellule Staminali Mesenchimali (MSC). Tali cellule, isolabili
dal sangue midollare, oltre a rappresentare i precursori di cellule della linea
osteo-condro-tendinea, si sono, infatti, rivelate tra i più potenti
immunosoppressori della risposta immunitaria entrando, conseguentemente, in
fase di sperimentazione clinica per il controllo della GVHD o di malattie dovute
all’alterata regolazione del sistema immunitario.
Riduzione malattia
da trapianto contro
ospite
Osteoartrite
Osteogenesi
imperfetta
Distrofia muscolare
Infarto del miocardio
Lesioni
tendinee
Malattie
neurodegenerative
e post-traumatiche
CELLULE
STROMALI
Il Midollo Osseo ed, in particolare, le Cellule Staminali che da esso
possono essere recuperate, sono quindi oggi il punto di partenza delle “avanzate
metodologie terapeutiche”. La struttura nella quale vengono efficacemente
prodotte ed utilizzate in tal senso le cellule staminali e, più in generale, i
prodotti della Terapia Cellulare é definita “Cell Factory”.
La “Cell Factory”:
CHE COSA E’ UNA CELL
FACTORY?
Per Cell Factory si intende una sofisticata struttura di ricerca e di
servizio, costituita da laboratori dove operano in condizioni di microclima
stabile, medici e biologi, ed in cui è possibile , attraverso particolari metodologie,
isolare, conservare e manipolare cellule di ogni organo.
La necessità della creazione di strutture pensate ad hoc per la produzione
di prodotti cellulari deriva dal fatto che le normative europee e italiane vigenti
impongono oggi di effettuare tutte le manipolazioni sulle cellule in condizioni di
lavoro estremamente rigide e controllate, così da poter, alla fine, preparare
cellule da trapiantare nelle stesse condizioni di qualità e di controllo con le quali
un’industria farmaceutica produce un qualsiasi farmaco. Equiparando in questo
modo a tutti gli effetti “le cellule” ad un qualsiasi “farmaco”.
Si parla di “Good Manufacturing Procedure” o GMP.
La “Cell Factory”:
Le manipolazioni cellulari
La Cell Factory opera all’interno del settore della manipolazione
cellulare che racchiude essenzialmente due tipologie di attività:
trattamenti di routine: attività legate a consolidate tecniche di
manipolazione cellulare, quali ad esempio il trapianto di midollo (autologo e
allogenico)
terapia cellulare: attività legata a innovative tecniche di manipolazione
cellulare, quali ad esempio lo studio e l’uso di cellule staminali.
La manipolazione cellulare può essere anche descritta in base alle oprazioni che
vengono svolte sulle cellule; in questo caso si parla di:
• manipolazione minima: azioni che non alterano le funzionalità proprie
della popolazione cellulare (centrifugazione, deplezione, selezione magnetica,
etc)
• manipolazione estensiva: azioni che possono alterare le funzionalità
proprie della popolazione cellulare (espansione in vitro con opportuni fattori
di crescita, addestramento contro precisi marcatori, etc )
Le Cell Factory nascono essenzialmente per sviluppare la terapia cellulare e
presentano attività sia di manipolazione minima che estensiva.
La “Cell Factory”:
il funzionamento,
i Laboratori GMP
COME FUNZIONA UNA CELL FACTORY?
Il Funzionamento di una Cell Factory, in considerazione
della criticità delle operazioni svolte, è fortemente normato al fine di garantire
un elevatissimo livello di sicurezza e di qualità dei prodotti cellulari manipolati.
Per tali ragioni, tali strutture sono dotate di laboratori che operano in regime
di GMP (norme di Buona Fabbricazione dei Medicinali) e sottostanno a severe
leggi e normative (vedi allegato 1).
Occorre sottolineare che il parametro più importante al quale gli ambienti di
lavoro devono conformarsi è la classe di sterilità (così definita dalle norme GMP
; per legge è prescritto che la manipolazione cellulare debba avvenire in camere
di classe B e che le camere dove vengono effettuati i controlli di qualità devono
presentare almeno condizioni di classe C.
I Laboratori GMP:
Essenzialmente in un laboratorio GMP si compiono le seguenti attività:
• Selezione di cellule
• Coltivazione ed espansione in vitro (attraverso l’uso di terreni di coltura
e di fattori di crescita specifici per indirizzare lo sviluppo delle cellule
staminali o l’uso di specifici antigeni per sviluppare la risposta
immunitaria da parte dei linfociti).
• Controlli di qualità per assicurare la qualità del prodotto cellulare
manipolato.
Pertanto, le apparecchiature standard in un Laboratorio GMP sono:
• Cappe a flusso laminare (all’interno delle quali il personale
manipola i prodotti cellulari)
• Incubatori (apparecchiature dove conservare le cellule in espansione)
• Centrifughe e separatori magnetici (per selezionare i tipi cellulari
desiderati)
• Apparecchiature di controllo (microscopi ottici, citofluorimetri,
contaglobuli. Ecc)
La “Cell Factory”:
Settori di attività
Le Cell Factory focalizzano la loro attività in particolare su tre ambiti:
• studio ed utilizzo di cellule staminali: manipolazione estensiva delle cellule
allo scopo di trapianto (autologo e allogenico) per la rigenerazione di tessuti
e di organi.
• Terapia cellulare antitumorale o virale (immunoterapia): “addestramento”
di cellule del sistema immunitarioper riconoscere le cellule malate e
svillupare le immunodeficienza.
• Terapia genica: modifica di parti del DNA per combattere le
immunodeficienze.
In realtà la terapia genica è un ambito solo potenziale in quanto ancora a livelli
di primissima sperimentazione e illegale in molti stati, Italia compresa.
L’ Istituto Tumori “Giovanni Paolo II”, forte delle esperienze
cliniche, delle conoscenze e delle tecnologie sviluppate in passato dai nostri
ricercatori e clinici, soprattutto nel campo dell’immunoterapia dei tumori , con
particolare riferimento a strategie di vaccinazione basate su cellule ha, dunque,
l’obiettivo di attuare un:
“Centro Avanzato Terapie Cellulari”
Panoramica del progetto
Esaminando il panorama delle strutture presenti, emerge che non esistono in
Puglia Istituti di ricerca e cura in grado di coniugare e integrare le competenze
nell’ambito delle malattie oncologiche con la ricerca sulle terapie cellulari.
L’obiettivo prioritario del progetto è, dunque, fornire uno strumento di
innovazione/modernizzazione/dinamismo del SSR che coniughi le esigenze di cure e
di assistenza sanitaria sempre più “eccellenti” nell’ambito delle onco-patologie con
l’esigenza di crescita scientifica e tecnologica, creando una cultura della ricerca delle
sinergie e della condivisione di risorse/conoscenze.
Lo strumento impiegato per tale scopo è la realizzazione di un “Centro
Avanzato per i Trapianti di Cellule Staminali Emopoietiche e Terapie
Cellulari, CATC” , un luogo di ricerca e cura per le malattie neoplastiche ed
ematologiche, che possa contribuire a contrastare l’attuale migrazione sanitaria e sia
polo di attrazione per le regioni limitrofe. Il contesto territoriale in cui si inserisce il
Progetto individua , infatti, i target dell’Istituto nei cittadini pugliesi e in quelli delle
regioni limitrofe, affetti da tumore solido o da emopatie maligne, specificamente
Linfomi e Mielomi, che possano giovarsi della ricerca finalizzata alla medicina
personalizzata con cellule e/o altre biotecnologie.
Il progetto per l’istituzione di un Centro per le Terapie Cellulari persegue, pertanto, i
seguenti obiettivi generali:
Aumentare e qualificare gli interventi assistenziali in settori della medicina
rilevanti per la dimensione della casistica, per le ricadute sul piano della
qualità della vita e dell’economia, e per le prospettive di innovazione
biotecnologica.
Alimentare la crescita professionale del personale sanitario e attirare giovani
dotati in un ambiente in cui i vasti problemi della clinica siano affrontati con
l’ottica positiva della ricerca scientifica.
Oltre all’evidente vantaggio di collegare il mondo clinico alla ricerca, il progetto
manifestamente e prioritariamente si propone ,quindi, di favorire la
sperimentazione, l’uso di nuovi prodotti e sistemi e lo sviluppo della ricerca
scientifica.
Obiettivi del Progetto:
la mission
L’istituzione di un “Centro per i Trapianti di Cellule Staminali
Ematopoietiche e per le Terapie Cellulari, CATC” si propone di perseguire i
seguenti obiettivi specifici:
1.Istuituire un Programma Trapianti di Cellule Staminali Ematopoietiche, autologhe
e allogeniche, per i pazienti affetti primariamente da Linfomi, Mielomi e Tumori
Solidi.
2.Istituire un Centro di Terapie Cellulari per la manipolazione intensiva di Cellule
Staminali da impiegare come PTC nelle malattie neoplastiche ed in altri campi di
interesse (dermatologia, neurologia, ortopedia, ecc)
3.Rafforzare ed approfondire la ricerca nel campo delle Cellule Staminali allo scopo
di studiare, isolare ed espandere gli effettori della risposta immune contro le
cellule neoplastiche in corso di autotrapianto, trapianto allogenico di CSE in
pazienti ematologici ed , in corso di terapia convenzionale, nei pazienti con
patologia tumorale solida, nonché individuare nuovi e più prognostici markers
biologici e genetico-molecolari per la valutazione della malattia minima residua.
Il perseguimento di tali obiettivi produrrà risvolti, in termini clinici e di innovazione
tecnologica, sorprendenti perché permetterà di estendere le applicazioni cliniche
delle CS autologhe, allogeniche o ingegnerizzate al campo dei:
•
•
•
•
trapianti di midollo osseo
immunoterapia cellulare adottiva e vaccinoterpia
medicina rigenerativa
ricerca farmacologica
.
In questo modo altre patologie e altri pazienti
potranno giovarsi delle metodologie e delle
esperienze del progetto
DIAGNOSTICA E
ASSISTENZA
SANITARIA
RICERCA
SVILUPPO E
INNOVAZIONE
TECNOLOGICA
Il Progetto:
ricerca e risultati
La ricerca sarà in particolare focalizzata al raggiungimento dei seguenti
obiettivi:
• Comprensione dei meccanismi biologici delle CSE, delle cellule dendritiche e
delle altre cellule coinvolte nella risposta immune e del del loro ruolo nei
processi di difesa dell’ospite contro i Tumori.
• Sviluppo di metodologie per l’isolamento,l’espansione e la caratterizzazione di
CSE
• Utilizzo delle Cellule Staminali nella la creazione di Modelli Sperimentali per
studio e la sperimentazione di nuovi farmaci
• Sviluppo di strategie terapeutiche che impiegano le cellule per la terapia dei
tumori.
L’attivazione degli ambienti a bassa carica microbica per il Trapianto di Cellule
Staminali Ematopoietiche consentirà la realizzazione di una nuova terapia per i
pazienti e, parallelamente, grazie ai miglioramenti sviluppati nella ricerca e alla
sinergia tra clinici e ricercatori, la messa a punto di nuovi protocolli clinici che
consentiranno di dare ai pazienti altre possibilità di cure e, quindi, più ampie
opportunità di vita.
In particolare tali protocolli saranno sviluppati inizialmente in campo oncoematologico e , successivamente, grazie allo sviluppo di strategie terapeutiche che
impiegano le cellule per la terapia dei tumori, sarà possibile svilupparli anche nel
campo dell’immunoterapia cellulare adottiva , nella vaccinoterapia ed, infine, nel
campo della medicina rigenerativa.
Stato corrente del Progetto:
Il Laboratorio GMP
dell’ IRRCS “G. PaoloII”
Il Centro per le Terapie Cellulari dell’Istituto Tumori “giovanni Paolo II” si
differenzia dalle più usuali strutture ospedaliere presenti nell’area regionale, perché è
dotato di avanzati laboratori e servizi, indispensabili per razionalizzare l’attività di
assistenza e di ricerca e per trasferire in un contesto assistenziale le innovazioni
tecnologiche della ricerca di base o preclinica.
Nell’ IRRCS “Giovanni Paolo II” è stato , infatti, realizzato al I° piano
dell’edificio un laboratorio destinato alla produzione di prodotti per le terapie
cellulari secondo le regole vigenti in Good Manufactoring Procedure (GMP) che
prevedono ambienti differenziati a pressione positiva (progressiva) ed in
monitoraggio continuo di sterilità, controllo di qualità, ecc.
Il Laboratorio GMP
dell’ IRCS “G. PaoloII”
Il laboratorio GMP dell’ IRCCS “Giovanni Paolo II” è composto da 3
ambienti, ciascuno provvisto di una propria entrata e di una propria uscita per
assicurare un flusso unidirezionale del personale, nei quali vengono gestite le
attività di caratterizzazione e separazione cellulare, di manipolazione e coltura
cellulare , e di crioconservazione in regime di controllo continuo della
contaminazione, ciascuno in funzione delle specifiche richieste.
Funzionalmente si individuano 2 aree principali:
• area sterile: che comprende 2 stanze di degenza sterile (classe B) a pressione
positiva con area di isolamento dedicata utilizzate per le procedure di
trapianto di cellule staminali e la Vaccinoterapia dei tumori, ed una stanza
nella quali vengono materialmente eseguite le manipolazioni cellulari e le
colture cellulari (classe A)
• area non sterile: che comprende una stanza dove sono ospitate le
strumentazioni connesse e di supporto alle attività di coltura cellulare.
Il funzionamento dell’intera struttura è gestito da un sofisticato sistema di
controllo computerizzato interfacciato con un sistema avanzatissimo di
monitoragio dei parametri ambientali (attraverso sensori di pressione,
temperatura, umidità, contatori particelle e rilevatori di ossigeno e anidride
carbonica) e con un sistema di monitoraggio strumentale che consente di
controllare in continuo la performance di strumenti critici quali cappe, incubatori,
frigoriferi e congelatori.
Le attività del laboratorio includeranno la donazione, l’approvvigionamento, il
controllo, la lavorazione, lo stoccaggio e la distribuzione di cellule umane destinate
all’applicazione sull’uomo, nonché prodotti derivati da tessuti e cellule umane, tra
cui:
- vaccinazione con cellule somatiche (cellule dendritiche, linfociti, ecc.);
- manipolazione di cellule staminali emopoietiche autologhe ed allogeniche per
procedure trapiantologiche;
- terapie cellulari in altri campi di interesse (dermatologia, neurologia,
ortopedia,etc)
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Il Laboratorio GMP
dell’ IRRCS “Giovanni
PaoloII”
La strumentazione
Il laboratorio GMP presenta una dotazione
strumentale ampia e capace di supportare
attività di ricerca e di sviluppo integrate nei
diversi campi della biomedicina e delle
biotecnologie.
Oltre alla dotazione di base per la biologia
cellulare (cappe a flusso laminare, incubatori
CO2, frigoriferi, congelatori, contenitori per
azoto liquido , microscopi ottici a luce bianca
ed invertiti, centrifughe refrigerate) , nel
laboratorio è presente un citofluorimetro di
ultima generazione per la caratterizzazione
cellulare e la enumerazione delle cellula
staminali.
I Laboratori del CATC:
ricerca e clinica
A livello preclinico l’attività si articola in differenti laboratori che lavorano in
stretta simbiosi con i clinici:
1. laboratori di ricerca che si occupano della biologia delle cellule staminali
emopoietiche,della immunologia ed immunoterapia dei tumori e della
immunologia dei trapianti.
2. laboratori di caratterizzazione cellulare (citofluorimetria, biologia
molecolare)
3. laboratorio per la manipolazione e conservazione delle cellule staminali
emopoietiche autologhe ed allogeniche per procedure trapiantologiche od
altri prodotti cellulari a scopo terapeutico
4. laboratorio dedicato alle procedure aferetiche (cellule staminali,
dendritiche, linfociti)
5. laboratorio per la vaccinazione con cellule somatiche (cellule
dendritiche, linfociti, ecc.);
Il Centro Avanzato
Terapie Cellulari:
Organigramma
L’operatività del “Centro Avanzato Terapie Cellulari e Trapianto Cellule
Staminali Ematopoietiche” è consentito grazie all’attività sinergica di più U.O.:
1. UOS PATOLOGIA MOLECOLARE E SPERIMENTALE(1biologo ed 1
tecnico).
2. UOS LAB. IMMUNOLOGIA APPLICATA (1 medico, 1 biologo e 3 tecnici).
3. UOS LAB. CITOFLUORIMETRIA ( 1 biologo e 2 tecnici).
4. UOS DIAGNOSTICA GENETICA MOLECOLARE E SPERIMENTALE (2
biologi e 1 tecnico).
5. UOC EMATOLOGIA (6+1 medici).
6. UOC ONCOLOGIA MEDICA (2 medici).
Poiché ai fini dell’Accreditamento istituzionale (Centro Nazionale
Trapianti) è indispensabile l’apporto di un Direttore del Programma Trapianto
con documentata e pluriennale attività (10 anni) nel settore, in via provvisoria il
Direttore dell’UO di Ematologia sarà supportato da un consulente con esperienza
coerente con i requisiti JACIE (Joint Accreditation Commettee ISCT-EBMT) .
DIRETTORE
CATC
RESPONSABILE
QUALITA’
U.O.C.EMATOLOGIA
U.O.S.
CITOFLUORIMETRIA
6+1 MEDICI
1 BIOLOGO
+
1 TECNICO
U.O.C. ONCOLOGIA
MEDICA
2 MEDICI
Il CATC:
le aree assistenziali
Le aree assistenziali trovano sede presso l’area a bassa carica microbica dell’UO
di Ematologia per i trapianti di CSE e nelle altre UO per la patologia oncologica
solida.
In particolare nel reparto di Ematologia, sono allestite 2 stanze di degenza a
pressone positiva con area di isolamento dedicata , utilizzate per le procedure di
trapianto di cellule staminali autologhe ed allogeniche.
Il CATC:
la Sede, l’ Istituto Tumori
Giovanni Paolo II
E’ stato realizzato un nuovo gruppo operatorio, composto da cinque sale
operatorie, centrale di sterilizzazione e terapia sub-intensiva; una delle sale è
attrezzata con acceleratore lineare portatile per le tecniche di Radioterapia
Intraoperatoria.
E’ stata allestita una sala per la contemporanea effettuazione di analisi
diagnostiche con angiografo e TAC. Tale sala, prima in Italia e seconda in Europa,
permette di perfezionare le tecniche di termo ablazione di cui l’IRCCS è già da
tempo capofila in Italia.
La sede è dotata di ludoteca, biblioteca multimediale, sala convegni, aule di
formazione informatizzate, sala mensa, cappella, morgue. Sono presenti due TAC,
una Risonanza Magnetica, due acceleratori lineari, un TAC simulatore, due
mammografi digitali, un telecomandato radiologico.
E’ stata completata reingegnerizzazione delle attività dell’Istituto, dotando
l’Ospedale di un sistema informativo in grado di supportare tutti i processi
organizzativi e gestionali che si svolgono al suo interno, con strumenti tra loro
integrati. Le aree di applicazione sono:
Cartella clinica e infermieristica informatizzata, che consenteai medici di
avere in ogni momento, anche durante la visita al malato, tutte le
informazioni diagnostiche e terapeutiche raccolte su un tablet portatile
collegato via wireless alla rete informatica dell’Ospedale;
area Sanitaria (Accettazioni e Dimissioni, Centro Unico Prenotazione)
Gestione sale operatorie
Gestione farmaci
area amministrativa (protocollo, gestione personale, gestione bilancio e
controllo di gestione, gestione risorse tecnologiche)
Il CATC:
Cronogramma
La realizzazione del progetto ed il suo funzionamento a regime prevede tre fasi:
• Fase Organizzativa (WP 1)(2 mesi): finalizzata a:
1 costituzione organi di coordinamento,
2 definizione del regolamento del Centro,
3 individuazione delle risorse umane e tecnologiche.
• Fase Operativa – Sperimentale 1 (WP 2) (12 mesi): finalizzata alla
messa in opera delle attività di selezione , reclutamento e formazione del
personale in funzione delle infrastrutture , attrezzature e delle risorse
disponibili e all’avviamento dei programmi e progetti di collaborazione e
ricerca per favorire l’integrazione fra le Unità Operative dell’ IRCCS
ISTITUTO TUMORI “GIOVANNI PAOLO II”. Sul piano assistenziale saranno
effettuati 10 trapianti autologhi e poste le basi per l’avvio dell’attività
trapiantologica allogenica.
• Fase Operativa – Sperimentale 2 (WP 3, WP 4, WP 5):finalizzata al
raggiungimento della progressiva piena funzionalità del Centro secondo gli
obiettivi e la missione prima indicati e seguendo il presente timing:
(WP 3) messa a punto di programmi tesi a sviluppare vaccini
terapeutici basati sull’uso di cellule dendritiche generate a partire da
cellule del sangue periferico di pazienti oncologici e con particolare
attenzione agli studi clinici di vaccinazione terapeutica di pazienti affetti
da melanoma.
(WP 4), sviluppo di metodologie di preparazione in condizioni GMP di
qualsiasi tipologia di cellule del sistema immunitario utilizzabili in
protocolli di trattamento immunoterapico di pazienti oncologici, incluso
l’uso di linfociti per studi di “immunoterapia adottiva”.
(WP 5), ottenute le opportune autorizzazioni alla terapia cellulare da
parte degli Enti Regolatori in conformità alla normativa vigente, sarà
avviato il programma clinico.
Il Cronogramma:
Il Centro alla fine del periodo sarà in grado di attuare un programma,
autorizzato dagli Enti Regolatori, di terapia cellulare con vaccini nei tumori
solidi e nelle emopatie maligne. Il tempo dedicato a tale fase è piuttosto lungo,
ma occorre considerare che In Italia, nonostante i livelli di eccellenza della
ricerca di base nel settore dell’immunologia e immunoterapia dei tumori, esiste
un notevole ritardo nel trasferimento dei risultati della ricerca alla
sperimentazione clinica. Una delle ragioni principali risiede nella necessità di
operare in conformità con i requisiti stabiliti dalla normativa, un processo la
cui complessità e costo ostacolano fortemente il trasferimento alla clinica di
risultati della ricerca rilevanti per il loro potenziale terapeutico.
La normativa:
Europea, Italiana
L’uso di PTC , in Italia, segue rigide normative:
1. Europee
2. Italiane
• Normative Europee:
1.
Direttiva 2006/86/CE del 24/10/2006
Attua la direttiva 2004/23/CE del Parlamento europeo e del Consiglio per
quanto riguarda le prescrizioni in tema di rintracciabilità, la notifica di
reazioni ed eventi avversi gravi e determinate prescrizioni tecniche per la
codifica, la lavorazione, la conservazione, lo stoccaggio e la distribuzione di
tessuti e cellule umani.
2. Direttiva 2006/17/CE del 8/02/2006
Attua la direttiva 2004/23/CE del Parlamento europeo e del Consiglio per
quanto riguarda determinate prescrizioni tecniche per la donazione,
l'approvvigionamento e il controllo di tessuti e cellule umani.
3. Direttiva 2004/23/CE del 31/03/2004
Definizione di norme di qualità e di sicurezza per la donazione,
l'approvigionamento, il controllo, la lavorazione, la conservazione, lo
stoccaggio e la distribuzione di tessuti e cellule umani.
4. Direttiva 2002/98/CE del 27/01/2003
Norme di qualità e di sicurezza per la raccolta, il controllo, la lavorazione, la
conservazione e la distribuzione del sangue umano e dei suoi componenti modifica la direttiva 2001/83/CE.
• Normative Italiana:
1.Ordinanza 26 febbraio 2009
Disposizioni in materia di conservazione di cellule staminali da sangue del
cordone ombelicale.
2.DL 16 25 gennaio 2010
Prescrizioni tecniche per la donazione, l'approvvigionamento e il controllo
di tessuti e cellule umani, nonché per quanto riguarda le prescrizioni in
tema di rintracciabilità, la notifica di reazioni ed eventi avversi gravi e
determinate prescrizioni tecniche per la codifica, la lavorazione, la
conservazione, lo stoccaggio e la distribuzione di tessuti e cellule umani.
3.DL 16 del 2010 allegato VII
Notifica di reazioni avverse gravi.
4.DL 16 del 2010 allegato VIII
Notifica di eventi avversi gravi.
5.DL 16 del 2010 allegato IX
Modello di notifica annuale di reazioni avverse gravi.
6.DM 18 novembre 2009 UCB uso autologo-dedicato
Disposizioni in materia di conservazione di cellule staminali da sangue del
cordone ombelicale per uso autologo-dedicato.
7.accordo stato-regioni 29 ottobre 2009
Requisiti organizzativi, strutturali e tecnologici minimi per l'esercizio delle
attività sanitarie delle banche di sangue da cordone ombelicale.
8.DL 191 6 novembre 2007
Attuazione della direttiva 2004/23/CE sulla definizione delle norme di
qualità e di sicurezza per la donazione, l'approvvigionamento, il controllo, la
lavorazione, la conservazione, lo stoccaggio e la distribuzione di tessuti e
cellule umani.
