Farmacologia preclinica
Riferimenti: Dr. Sabata Pierno
Prof. Diana Conte
Test preclinici
Valutazione del principio attivo prima del test sull’uomo (clinici)
Studi in vitro
Studi in vivo
Colture cellulari
Organismi interi
Test di farmaci su cellule
normali o cellule in cui
viene indotta una
mutazione
Test in vivo su modelli
animali di patologie e
animali sani
Valutazione tossicità
• Acuta
• Subcronica
• Cronica
• Riproduttiva
• Cancerogenesi
Studi in vitro
proprietà farmacologiche
screening iniziale di tossicità
metabolismo
Test di tossicità
Valutazione del rischio potenziale nell’uomo
derivante dall’esposizione ad un farmaco
es. di test in vivo:
inibizione
Misura della durata del sonno da esobarbitale
(farmaco rapidamente disattivato dalle monoossigenasi
epatiche)
Gli inibitori di questo sistema prolungheranno dunque la
loro azione
es. somministrazione cloramfenicolo a topi 1 ora prima
della somministrazione con pentobarbitale prolunga il
sonno in maniera dose-dipendente
Test di neurotossicità
Su nuovi farmaci e agenti chimici
Uso di modelli animali: in genere roditori
Vengono valutati parametri neurocomportamentali
come perdita di memoria, deficit somatosensoriali,
disfunzioni motorie e anche l’aspetto fisico,
reattività, forza muscolare
Supporto dei test in vitro
Meccanismi di tossicità acuta
I canali ionici che facilitano la trasmissione dell’impulso nervoso
sono sensibili a perturbazioni causate da varie sostanze tossiche e farmaci.
(Gli inibitori del trasporto ionico sono indicati in parentesi)
Test in vivo: tossicità acuta
Stabilire effetti tossici da singola dose:
Si costruisce una curva dose risposta con almeno 5 animali per sesso
Effetto quantale (tutto o nulla)
Fine: Standardizzare dosi
definire meccanismi
attribuire eventuale tossicità d’organo
letalità
determinazione requisiti sicurezza imballi
Fattori responsabili della variazione della DL50
Specie
Razza età
Genere
Peso
Stato di salute
Stato nutrizionale
Contenuto intestinale
Via di somministrazione
Stabulazione
Temperatura
Orario
Stagione
Errore umano
Saggio di irritazione oculare
Per valutare l’irritazione dovuta a composti applicati
topicamente nell’occhio
Variazione del test di Draize
Animale da esperimento più adatto: coniglio
Il test consiste nell’applicare il materiale da valutare nel sacco
congiuntivale nell’occhio. L’altro occhio funge da controllo.
Dopo 1, 2, 3 giorni va esaminato l’aspetto della cornea (opacità), iride
(aspetto e reazione alla luce), congiuntiva (arrossamento ed effetto sui
vasi), palpebre (eventuale gonfiore).
La colorazione alla fluoresceina può migliorare l’esame visuale perché il
colorante può essere più facilmente assorbito dai tessuti danneggiati,
che diventano fluorescenti quando l’occhio viene illuminato
Nuove direttive: numero di animali minimo richiesto ridotto da 6 a 3.
Il pH va controllato con attenzione
Test per irritazione cutanea
applicazione topica di sostanze chimiche
Irritazione primaria
Il composto da studiare viene applicato su un’area rasata di 5 cm2 sul dorso di
conigli albini. Dopo 24 ore l’area viene osservata valutando arrossamenti,
lesioni, edemi ecc.
Sensibilizzazione cutanea
Valutazione reazioni allergiche. Ricerca di anticorpi. Animali usati: cavie
Fase di induzione: trattamento ogni 3 giorni per 2 settimane. Poi trattamento
topico di 24 ore simile al test di irritazione cutanea. Segue osservazione
severità lesioni su numero animali
Sicurezza farmacologica
Test per lo sviluppo di nuovi farmaci
Identificare gli organi bersaglio
(SNC, sistema cardio-vascolare, sistema polmonare)
Identificare gli effetti indesiderati
Possibili effetti tossicologici
Identificare il meccanismo che porta agli effetti
indesiderati
Studi di tossicità generale
Acuta: singola somministrazione;
A breve termine (dosi ripetute): 14-28 giorni;
Prolungata (10-25% della vita dell’animale, subcronica): 3-6 mesi
(nel ratto)
Cronica (>50% della vita): 1-2 anni nel ratto (in genere studi di
cancerogenesi)
Rapporto con l’esposizione dell’uomo
¾ gli studi acuti ‘rappresentano’ l’esposizione dovuta ad
incidenti o a sovradosaggi accidentali o volontari.
¾ gli studi subcronici ‘rappresentano’ l’esposizione (a livelli
più bassi di quelli dovuti ad incidenti) frequente a sostanze
di uso professionale (es. solventi) o domestico (es.
detergenti), ad additivi alimentari, farmaci e inquinanti
ambientali;
¾ gli studi cronici ‘rappresentano’ l’esposizione giornaliera,
per tutta la vita, ad additivi alimentari, residui di pesticidi
nel cibo e nell’acqua ecc.
Tipi di tossicità
• Tossicità funzionale: alterazioni delle funzioni di
un sistema (nervoso, cardiovascolare,
endocrino) ⇒ danno d’organo.
• Citotossicità: alterazione irreversibile di proteine
(enzimi, canali ionici ecc.) o membrane (lipidi);
disregolazione del metabolismo ⇒ necrosi,
apoptosi ⇒ tossicità tissutale e d’organo o
sistema (fegato, rene, SNC ecc.).
• Genotossicità: alterazione del DNA ⇒ mutazioni,
alterazioni cromosomiche ⇒ cancerogenesi,
malattie congenite.
• Reazioni allergiche: allergeni, apteni,
modificatori degli antigeni cellulari ⇒ risposta
immunitaria.
Predittività degli studi animali di 221 effetti tossici di 150 farmaci
nell’uomo.
Tossicità subcronica
Provocata da somministazione ripetuta (es. orale 28-90 gg)
Essenziale per stabilire i regimi di dose
Determinazione NOEL (No-observed effect level)
3 livelli di dose;
dose Via di somministrazione con la dieta
N° animali (roditori) = 10-20 (maschi e femmine) per ogni livello di dose
La specie scelta dovrebbe essere quella con maggiore similarità farmacocinetica e
metabolica con l’uomo (il più comune roditore è il ratto il più comune non roditore è il
cane)
Per ridurre la variabilità si usano ceppi di roditori consanguinei
Gli animali devono essere posti in quarantena prima di essere ammessi nell’area di
sperimentazione
Regolare ispezione da parte del veterinario
Valutazione della reversibilità
Cibo normale per 21-28 giorni
Osservazione dei vari parametri
Lista dei parametri da valutare
Dati in vita
Aspetto. Mortalità e morbilità. Pelle, pelo, eventuale presenza di masse
palpabili, lesioni esterne
Occhi. Esame della cornea e della retina
Consumo di cibo. settimanalmente
Peso corporeo. Settimanalmente
Anomalie comportamentali
Frequenza respiratoria
ECG
EEG
Ematologia. Prima e dopo il test. Emoglobina, eritrociti, leucociti, piastrine,
parametri di coagulazione
Ematochimica. Elettroliti, glucosio, lipidi, sieroproteine, transaminasi e
fosfatasi.
Analisi delle urine. pH, densità, proteine, bilirubina
Analisi delle feci. Sangue occulto, agenti tossici, metaboliti
Test terminali
Se vengono riscontrate lesioni viene
esaminato anche il gruppo a dose più
bassa
Necropsia
I tessuti sono rimossi pesati ed
esaminati
per
evidenziare
grosse lesioni, masse, ecc.
vengono poi fissati in formalina
tamponata per il successivo
esame istologico
Istologia
I tessuti elencati, o evantuali masse, vengono inclusi sezionati e
colorati per la microscopia ottica. Inclusione in paraffina,
colorazione con ematossilina-eosina
Identificazione dei cancerogeni
Cancro: crescita incontrollata di cellule anormali
con possibile invasione dei tessuti lontani
L’analisi epidemiologica ha rivelato la
presenza di un accumulo di mutazioni di
geni critici durante lo sviluppo del cancro
Alterazione processo di
replicazione/riparazione DNA
danno ossidativo DNA
danni DNA causati da cancerogeni ambientali
Spesso un clone cellulare necessita di decenni per
accumulare molteplici mutazioni critiche da consentire lo
sviluppo di un cancro evidenziabile clinicamente
Alcuni geni: proto-oncogeni sono presenti nelle cellule
normali e regolano la crescita cellulare.
Tali geni sono frequentemente mutati nel cancro
Durante la cancerogenesi i geni soppressori di
tumore (oncosoppressori) possono subire
mutazioni e perdere attività
Alcuni proto-oncogeni e oncosoppressori alterano la
capacità della cellula di andare incontro ad apoptosi
Agenti terapeutici come potenziali cancerogeni
Agenti alchilanti
Ciclofosfamide
Ormoni
Fenacetina
Metronidazolo
Cimetidina
Saggio di riferimento Gold standard
Condotto x 2 anni sui roditori
Limiti:
Differenze tra specie
Utilizzo di alte dosi
Breve ciclo vitale roditori
Numerosità del campione
Necessità di estrapolazione all’uomo
Costi elevati
Test preliminari
di mutagenicità o tossicità genetica
Saggi di genotossicità / mutagenesi a breve termine
sono stati sviluppati utilizzando batteri, lieviti,
Drosophila, cellule umane o murine
Valutazione della presenza di mutazioni puntiformi,
mutazioni frame-shift, danni cromosomici e
trasformazioni cellulari
Mutagenicità era sinonimo di cancerogenicità nei
roditori solo nel 60% dei casi (meccanismi
epigenetici?)
Saggio di Tennant (Science, 1987)
73 sostanze chimiche
già testate come cancerogene nel saggio sui roditori
sono state analizzate su 4 saggi a breve termine:
1.Saggio di mutagenesi sulla Salmonella (test di
Ames)
2.Saggio del linfoma di topo
3.Formazione di aberrazioni cromosomiche
4.Scambio di cromatidi fratelli in cellule ovariche di
criceto
Tossicologia
genetica
DNA
e
mutazioni
Mutazioni
Variazioni stabili del materiale
genetico trasmesse alla
progenie
Mutazioni spontanee
provocate da fattori chimici
endogeni e da errori nei processi
che si attuano sul materiale
genetico
Mutazioni
indotte
prodotte dall'azione di
particolari agenti fisici
o chimici
Mutazioni
cromosomiche
Alterazione della struttura
del cromosoma
Es. sindrome del ‘cri du chat’
(microencefalia, difficoltà
intellettive)
delezione braccio corto
cromosoma 5
Mutazioni genomiche
riguardano il numero di cromosomi
Aneuploidie = Aggiunta o perdita di cromosomi
le forme di aneuploidia più frequenti sono la mancanza di un cromosoma
da una coppia (monosomia) o la presenza di un cromosoma in più in una
coppia (trisomia) . Più raro è il caso di perdita di una coppia intera
(nullisomia).
Es. trisomia del cromosoma 21 (ridotto sviluppo fisico e mentale,
suscettibilità a malattie dell’apparato respiratorio) frequenza 1/700
nati
La sindrome di Turner è invece un esempio di monosomia; gli individui
nati con questa anomalia possiedono un solo cromosoma sessuale, quello
femminile X.
Mutazioni geniche
Sostituzioni o stop
Es. anemia falciforme
emoglobina S mutante
AT in TA
Valina al posto di ac. glutammico
Delezione o inserzione di 1 o più basi
Scivolamento nella lettura
(mutazioni frameshift)
Dominanti o recessive
a seconda se si esprimano o meno nelle cellule diploidi allo stato eterozigote
Test di Ames
Stabilisce la capacità della sostanza in esame di indurre
mutazioni in un ceppo di Salmonella che porta una mutazione
per un enzima della via biosintetica dell’istidina
Forte correlazione tra mutagenicità e cancerogenicità
L’agente chimico se mutageno potrà determinare una
mutazione (reversione) del gene compromesso permettendo
così al batterio di risintetizzare l’aminoacido essenziale.
Test di Ames
La sensibilità dei ceppi può essere aumentata da mutazioni ulteriori
Esistono ceppi ricombinanti per gli enzimi del metabolismo
Coltura di Salmonella
istidina-dipendenti (medium + istidina)
non-mutageno
Miscela S9
Enz fegato ratto
coltura su
Agar privo di
istidina
incubazione
2 giorni 37°C
mutageno
Potenziale mutageno
Il mutageno può casualmente revertire il fenotipo deficiente
determinando la comparsa di cloni in grado di sintetizzare istidina
2007© J.F. DESAPHY
Tossicità cronica
Durata:
Durata generalmente 1 anno o più
Animali utilizzati:
utilizzati ratti e cani
Studi di cancerogenesi: ratti e topi
Fine dello studio:
studio Definizione dei margini di sicurezza
I parametri da valutare sono gli stessi usati per gli studi
subcronici
I test di cancerogenesi
hanno requisiti in comune con i test subcronici e cronici
L’agente chimico da testare può essere somministrato nel cibo,
acqua da bere, applicazione dermica, sondino, inalazione
La somministrazione va effettuata a cominciare dopo lo
svezzamento
La dose più alta utilizzata è la MTD (max dose tollerata)
Principale parametro determinato: incidenza tumorale misurata
attraverso esami istologici
Necessario un gran numero di animali a causa della possibilità di
comparsa spontanea di tumori (50 o più ratti o topi per sesso e per
gruppo di trattamento)
Necropsia ad uno stadio intermedio (es. 12 mesi) e alla fine del test
Test di teratogenesi
tossicologia della riproduzione
Interferenza con la capacità riproduttiva
Possibilità di introdurre malformazioni congenite
Negli adulti (trattamento precedente l’accoppiamento e
nelle femmine fino alla lattazione)
Negli animali in gravidanza durante il periodo di
organogenesi
Calcolo delle perdite pre- e post- impianto
(riassorbimento precoce e tardivo e morte fetale)
Procedura sperimentale
25 maschi vengono trattati per 70 gg che precedono
l’accoppiamento e 25 femmine per 14 gg prima
dell’accoppiamento
La durata è scelta sulla base dei tempi critici di ovulazione e
spermatogenesi
Il trattamento viene continuato per tutta la gravidanza (21 gg)
e fino allo svezzamento (ancora 21 gg)
3 livelli di DOSE (nel cibo, acqua da bere, con sondino)
La dose alta viene scelta per causare una tossicità non
eccessiva nella madre (es. tale da indurre decremento di peso
corporeo del 10% o effetti su organi bersaglio)
Basse dosi nel range dei no-effect level
Procedura sperimentale
Dopo la nascita i piccoli vengono contati, pesati ed esaminati per
evidenziare eventuali anormalità
Le nidiate sono raggruppate in numero costante (8-10) dopo 4
giorni
Allo svezzamento i cuccioli vengono sacrificati e su di essi eseguita
autopsia per valutare eventuali anormalità interne
Negli studi multigenerazionali vengono salvati 25 animali per sesso
e per gruppo per produrre le successive generazioni
Il trattamento continua per tutto il test, che può essere condotto
per due tre generazioni
Per valutare effetti da parte materna o paterna è
possibile trattare solo un genitore e incrociarlo con
un soggetto del sesso opposto non trattato
Analogamente è possibile distinguere tra gli effetti
mediati dall’utero o dovuti alla lattazione (scambiando
i neonati delle femmine trattate con quelli delle
femmine non trattate e viceversa)
Es.
Antitumorali
Antiepilettici
Cortisonici
Anticoagulanti orali
Effetti della Talidomide
Venduto negli anni 50-60 come sedativo, anti-nausea e ipnotico, rivolto in particolar
modo alle donne in gravidanza. Prodotto in forma di racemo, fu ritirato dal commercio
(1961) in seguito alla scoperta della teratogenicità dovuta ad uno dei suoi enantiomeri,
resa tristemente evidente dalla nascita di migliaia di bambini che presentavano amelia
(assenza degli arti) o vari gradi di focomelia (riduzione delle ossa lunghe degli arti),
generalmente a carico degli arti superiori che quelli inferiori, e quasi sempre bilaterale.
dopo 3 anni di prove su
animali non gravidi
e su donne in
allattamento
Effetti collaterali non
gravi
La specie umana è
risultata essere sensibile
alla dose di 1 mg/kg.
Inibitore
dell’angiogenesi
Teratogenesi: parametri da osservare
Indice della fertilità: n° di gravidanze rispetto al n° di
accoppiamenti
N° dei nati vivi rispetto al n° nati
Perdite pre-impianto: n° corpi lutei rispetto al n° dei siti di
impianto
Perdite post-impianto: n° dei siti di riassorbimento nell’utero
rispetto al n° dei siti di impianto
Durata della gestazione
Effetti sul sistema riproduttivo
Dimensioni e condizioni della nidiata, morfologia dei cuccioli
alla nascita, genere
Sopravvivenza dei cuccioli
Aumento in peso e in prestazioni
Tempi di comparsa dei punti di riferimento dello sviluppo:
apertura occhi, eruzione dei denti, apertura vagina,
separazione prepuzio nei maschi
Anormalità morfologiche
Affinchè un agente venga etichettato
Teratogeno
Occorre un significativo incremento
dell’incidenza di anormalità strutturali e
funzionali sfavorevoli nella prole in seguito alla
sua somministrazione alle femmine nel corso
della gravidanza o direttamente all’organismo
che si sta sviluppando
Gli studi di teratologia vengono condotti su due specie
(roditori come il ratto e non roditori come il coniglio,
cane, primati)
Deve essere utilizzato un sufficiente numero di
femmine in modo che vi siano almeno 20 femmine
gravide per ogni gruppo di dose.
Tempo di somministrazione tale da esporre le madri nel
periodo di organogenesi (6°-15° gg per ratti e topi, 6°18° gg per conigli)
La sostanza viene soministrata direttamente con un
sondino endogastrico (come richiesto da EPA) x un
calcolo più preciso della quantità
3 livelli di dose (dose più elevata non più del 10%
mortalità nelle madri)
Colture cellulari
Test possibili:
Vitalità e citotossicità
Cancerogenesi e mutagenesi
9 COLTURE MICROBICHE
9 COLTURE DI CELLULE ANIMALI O VEGETALI
Isolamento di cellule dal
tessuto, separazione e
allestimento di colture cellulari
Transfezioni transienti e stabili
La trasformazione di cellule animali mediata dal DNA
avviene in due fasi distinte temporalmente
1
trasfezione
2
integrazione
Introduzione
del DNA
nella cellula
incorporazione
eventuale nel
genoma
Espressione transitoria mediante coprecipitazione con fosfato di calcio
Utilizzare cellule che non esprimono
il gene da inserire
Plasmide contenente il gene pRC/CMV
CD-8 (pLEU)
Carrier
CaCL2
2X HEBS
A
B
A+B
Si aggiunge il DNA alle cellule
Incubazione per 36-72h
a 37°C
Particelle
sintetiche
che
possiedeono in superficie
anticorpi per i recettori CD8
co-espressi con il gene da
Dynal Beads studiare (gene reporter utile
per identificare le cellule in
cui è avvenuta la trasfezione)
Metodo del calcio-fosfato
Molto usato
Le cellule incorporano facilmente gli acidi nucleici
quando si presentano sotto forma di un precipitato
di complessi DNA-calcio fosfato.
Da ottimi risultati sia per transfezioni transienti
che permanenti
ESPRESSIONE ETEROLOGA DI PROTEINE
Permette di fare esprimere ad una linea cellulare la proteina che si vuole studiare
attraverso il trasferimento del gene codificante la proteina (trasfezione genica).
Incubazione
per qualche ora
Cellule al 70% di confluenza
Plasmide contenente il cDNA
codificante la proteina
Gene di resistenza ad un antibiotico
Trasfezione transitoria
Il gene penetra in cellula
ma non si integra nel genoma
Selezione clonale
Trasfezione
permanente
Il clone deriva
da una cellula unica.
Sono tutte uguali
alla cellula madre,
Esprimono tutte la proteina
Il gene si è integrato
nel genoma della cellula
Dopo 24 ore, le cellule
esprimono la proteina.
Dopo 3-4 giorni,
l’espressione cessa.
Incubazione con antibiotico
Solo le cellule esprimenti
il gene di resistenza sopravvivono
Isolamento di un clone
esempio
Effetti della mexiletina sulla corrente al Na+ misurata mediante la tecnica del patchclamp da canali WT e mutati (paralisi periodica ipercaliemica A1156T, miotonia potassioaggravata G1306E, paramiotonia congenita R1448C)
I canali mutati sono stati espressi transientemente in cellule tsA201 e la corrente al Na+ è
stata misurata 36-72 ore dopo la trasfezione
Il farmaco è ugualmente efficace su A1156T, meno efficace su G1306E e più efficace su R1448C
Mex, antiaritmico, blocca la corrente al sodio, voltaggio-dipendente, usata anche nelle patologie
del muscolo scheletrico (miotonie da sodio e da cloro) caratterizzate da ipereccitabilità
Saggi per valutare l’attività dei
farmaci
attività analgesica
antiaggregante
antiinfiammatoria
antiepilettica
antiipertensiva
broncodilatatoria
antitussiva
ecc.
valutazione dell’efficacia delle proprietà
analgesiche di determinate sostanze
(Taber 1974)
Test piastra calda (hot plate o tail flick)
nei roditori
test sensibili ai composti oppiacei
Tail flick
attraverso stimolazione termica si rilevano risposte di tipo riflesso
Hot plate
si ritiene si tratti di risposte intenzionali ovvero mediate a livello centrale
Test dell’hot plate
fu descritto per la prima volta da Woolfe e MacDonald, 1944 per
saggiare la sensibilità al dolore di topi e ratti
Consiste nel mettere un roditore su una superficie riscaldata e
misurare l’intervallo di tempo (latenza) che intercorre prima che si
verifichi una determinata risposta (es. leccarsi la zampa)
Il tutto per un periodo di tempo generalmente non superiore a 60 sec
la temperatura della superficie meno di 50°C, temperatura che non
arreca danni alla pelle del roditore
numerosi studi sul comportamento animale si prefiggono di ridurre
ulteriormente tale temperatura
Il test consiste nella valutazione dei tempi di
latenza misurati nei gruppi di animali
introdotti al test
Analisi dei risultati
Test statistici
Conclusione sugli effetti dei farmaci
