Spe-09 Clostridi - Sezione di Microbiologia

Clostridi
Il genere Clostridium comprende
bacilli anaerobi, Gram-positivi,
capaci di formare endospore,
catalasi-negativi
I clostridi crescono bene su terreni
al sangue dopo 1-2 giorni di
incubazione.
Clostridi
Forma bastoncellare, con
dimensioni comprese tra 3-8
m; formano spore con
caratteristica posizione
terminale o subterminale e
diametro eccedente quello delle
cellule che le contengono.
Sono ampiamente presenti in natura, sul
suolo e in ambiente acquatico, essendo
per la maggior parte mesofili.
Clostridium difficile visto da Andrea Gandolfo
Clostridi
Alcuni membri sono residenti in
diversi siti anatomici dell’uomo senza
essere responsabili di manifestazioni
patologiche. In particolare, numerose
specie fanno parte della popolazione
batterica residente dell’intestino umano
Saprofiti (suolo e intestino animali)
C. botulinum
Patogenicità:
Capacità di sopravvivere in condizioni ambientali avverse
mediante la formazione di spore e alla produzione di
tossine.
Le spore sono notevolmente resistenti al calore, possono
resistere a 100° C per diverse ore, sono distrutte in
autoclave a 121° C per 15 minuti.
Le tossine vengono prodotte in seguito alla germinazione
delle spore, sono resistenti al pH acido e pertanto possono
attraversare lo stomaco senza essere denaturate per poi
essere assorbite nel tratto gastrointestinale ed entrare in
circolo
C. botulinum
Vi è produzione di una neurotossina altamente specifica per le terminazioni
nervose colinergiche (sono state identificate 7 diverse molecole: A, B, C, D, E, F,
G, e una tossina binaria.
A, B, E e F sono codificate da geni cromosomici e sono attive sull’uomo la A è la
più potente tossina conosciuta
C e D sono codificate da geni profagici
G codificata da geni plasmidici
La tossina binaria è costitituita da 2 catene polipeptidiche che prese
singolarmente non hanno effetto tossico mentre sono estremamente tossiche in
associazione. La catena pesante consente il legame alla membrana cellulare, la
catena leggera ha attività enzimatica. A differenza della neurotossina agisce su
vari tessuti: cervello, fegato, polmone, intestino, vasi.
C. botulinum
Manifestazioni cliniche:
Botulismo alimentare
Botulismo infantile
Botulismo delle ferite
C. botulinum
Il botulismo alimentare è diffuso in tutto il mondo, maggiormente
nei paesi a clima temperato e freddo. È dovuto all’ingestione di
tossina preformata presente in cibo contaminato, ove è stata
prodotta dal microrganismo sviluppatosi in seguito alla
germinazione delle spore contaminanti. La maggior parte dei casi è
associata al consumo di cibi inscatolati in casa. I sintomi insorgono
dopo 1-2 giorni dal consumo dell’alimento contaminato: i pazienti
manifestano debolezza, vertigini, stato confusionale, vista offuscata,
pupille dilatate e fisse, bocca secca, incapacità di deglutire, difficoltà
a parlare, dolori addominali, la febbre è assente. Progressivamente si
ha paralisi flaccida che può portare alla morte per paralisi dei
muscoli respiratori. La mortalità è circa del 60%.
C. botulinum
Diversi tipi A-G in relazione alla tossina
Intossicazione da cibi contaminati
Sintomi 18-24h dopo ingestione
Siero antitossinico polivalente e ventilazione
C. botulinum
Il botulismo infantile tipicamente colpisce i
bambini di età inferiore a 1 anno ed è associato al
consumo di cibo (es. miele) contaminato con le
spore: la neurotossina viene prodotta in vivo dal
microrganismo che colonizza il tratto
gastrointestinale. I sintomi inizialmente non sono
specifici, poi la malattia progredisce nella paralisi
flaccida e può sopraggiungere arresto respiratorio.
La mortalità è bassa: 1-2 %.
C. botulinum
Il botulismo delle ferite è molto raro, è
dovuto a produzione di tossina da parte
del microrganismo sviluppatosi in una
ferita infetta. I sintomi sono uguali a
quelli del botulismo alimentare ma il
periodo di incubazione è più lungo: 4 o
più giorni
C. botulinum
Diagnosi:
Isolamento del microrganismo dalle feci e dall’alimento.
Dimostrazione dell’attività della tossina saggiando feci,
alimento e siero del paziente.
Si fa in laboratori di riferimento tramite uno studio in vivo
sul topo: il campione è suddiviso in due parti e una viene
trattata con antitossina, entrambe vengono inoculate nel
topo per via intraperitoneale. I topi trattati con la tossina da
sola muoiono per paralisi flaccida, se il trattamento con
antitossina protegge il topo si ha conferma dell’attività della
tossina.
C. botulinum
Identificazione:
Se il campione è contaminato da altri microrganismi lo si
scalda per 10 minuti a 80° C per uccidere le forme
vegetative, poi il campione trattato al calore viene coltivato
su terreno ricco in anaerobiosi per far germinare le spore.
Caratteristiche colturali: la crescita ottimale si ha a 35°C in
condizioni anaerobie dopo 1-2 giorni di incubazione. Su
agar sangue si osserva emolisi. Se si utilizza agar a base di
rosso d’uovo le colonie presentano una pellicola iridescente
dovuta alla produzione di lipasi.
C. botulinum
Identificazione:
L’identificazione può anche avvenire in base alle
caratteristiche biochimiche, ad es. fermentazione
del glucosio, oppure mediante gas cromatografia
attraverso l’analisi dei prodotti metabolici.
La ricerca di C.botulinum si può anche fare in
immunofluorescenza, oppure si può ricercare la
tossina da esso prodotta mediante tecnica ELISA.
C. botulinum
Terapia:
Ventilazione
Metronidazolo o penicillina
Antitossina botulinica polivalente (contro A, B, E).
Serve a legare la tossina ancora circolante nel sangue e deve
avvenire il più precocemente possibile perché una volta che
la tossina si è legata alla membrana delle cellule nervose
non è più neutralizzabile dall’antitossina
Tossina botulinica
Sulla base del valore di LD50 di circa 1
ng/kg, poche centinaia di grammi di questa
tossina potrebbero teoricamente uccidere
ogni essere umano presente sulla Terra (a
scopo comparativo, la stricnina
richiederebbe 400 tonnellate. Generalmente
le dosi letali orali risultano comprese fra 0,5
e 5 mg/kg di alimento ingerito.
Clostridium tetani
Struttura e fisiologia
Clostridium tetani un microrganismo bastoncellare,
strettamente anaerobio e mobile. Non fermenta gli zuccheri,
non riduce il nitrato e produce idrogeno solforato e indolo.
Produce endospore terminali, rotondeggianti e deformanti lo
sporangio, che gli conferiscono un aspetto a "bacchetta di
tamburo". Le spore di C. tetani si ritrovano comunemente nel
suolo in tutti i Paesi del mondo.
C. tetani possiede un plasmide di grandi dimensioni nel quale
contenuto il gene tetX che codifica per la tetanospasmina, la
principale tossina prodotta dal microrganismo.
C. tetani
Patogenesi
La virulenza di Clostridium tetani
ascrivibile alla produzione di due tossine, la
tetanolisina, un' emolisina labile all'ossigeno
simile alla streptolisina O di Streptococcus
pyogenes, e la tetanospasmina, una
neurotossina termolabile
C. tetani
Patogenesi
La tetanolisina, che ha un' elevata affinità
per il colesterolo e altri steroli, determina lisi di numerosi tipi di cellule (ad
esempio eritrociti, polimorfonudeati,
macrofagi, fibroblasti, piastrine).
Nonostante la sua attività sia nota, il suo
ruolo nella patogenesi del tetano non
ancora stato chiarito.
C. tetani
Patogenesi
La tetanospasmina, prodotta come singolo
polipeptide (150 kDa) è attivata da un taglio
proteolitico che genera due frammenti di circa 100
e 50 kDa, agisce a livello del sistema nervoso
centrale bloccando la liberazione di
neurotrasmettitori (ad esempio acido yaminobutirrico e glicina) dalle sinapsi inibitorie,
provocando una stimolazione incontrollata della
contrazione muscolare (paralisi spastica)
Clostridium tetani
Patogenesi
Nella maggior parte dei casi, il tetano si sviluppa a
seguito della contaminazione di ferite,
prevalentemente lacero-contuse, con spore di C.
tetani che, in condizioni di bassa tensione di ossigeno
(ferite scarsamente irrorate, necrotiche, coinfettate da
germi che contribuiscono all'abbassamento del
potenziale ossido-riduttivo locale),
vanno incontro a germinazione ed esocrescita.
Clostridium tetani
Patogenesi
L’infezione rimane localizzata al sito di inoculo, ma i batteri,
in attiva moltiplicazione, producono la tetanospasmina:
questa si lega alla membrana dei motoneuroni alfa a livello
delle giunzioni neuromuscolari e migra, per via retrograda
intra-assonale, alle corna anteriori del midollo spinale, dove,
mediante un passaggio transinaptico, raggiunge i neuroni
inibitori bloccando il rilascio dei neurotrasmettitori prodotti
da queste cellule. L’assenza di inibizione sui motoneuroni
determina uno spasmo simultaneo dei muscoli agonisti e
antagonisti che provoca rigidità muscolare e convulsioni.
C. tetani
Il tetano può manifestarsi in forma generalizzata (la più
comune) o localizzata.
Nel tetano generalizzato (anche detto tetano
discendente), Il primo segno clinico che compare il trisma
(contrazione del muscolo massetere), che conferisce un
aspetto chiamato risus sardonicus. Progressivamente, la
contrazione spastica si diffonde ad altri muscoli, Lo spasmo
generalizzato si manifesta come opistotono, caratterizzato
da una contrazione esagerata dei muscoli della schiena, con
flessione delle braccia e ipertensione degli arti inferiori.
C. tetani
Il periodo di incubazione , in genere, di circa 2
settimane, ma sono stati descritti casi in cui
l'incubazione variava da 2 giorni a 3 o più mesi.
Durante gli spasmi, i pazienti lamentano intenso
dolore e rimangono sempre vigili. La febbre
infrequente. La mortalità per tetano generalizzato
molto elevata (fino al 90% nei pazienti non trattati)
ed causata, nella maggior parte dei casi, da blocco
dei muscoli respiratori.
C. tetani
Il tetano localizzato (anche detto tetano
ascendente) può manifestarsi in soggetti
parzialmente immuni o per effetto di infezioni con
un ridotto numero di microrganismi.
caratterizzato da una contrazione dei muscoli
circostanti la zona di inoculazione delle spore e
può essere accompagnato da una lieve forma di
trisma dovuta alla diffusione della tossina, per via
nervosa ascendente, al tratto superiore
del midollo spinale.
C. tetani
Il tetano cefalico una forma di tetano localizzato in cui le
spore di C. tetani penetrano attraverso una ferita alla testa
o a seguito di un' otite media. Il periodo di incubazione di
1-2 giorni e la prognosi spesso infausta.
Il tetano neonatale una forma di tetano generalizzato
che può verificarsi a seguito della contaminazione del
moncone del cordone ombelicale con spore di C. tetani. I
sintomi della malattia iniziano dopo 3-14 giorni con blocco
della suzione e irritabilità. Successivamente, compaiono
convulsioni sempre più frequenti e intense e la mortalità
maggiore del 95% nei casi non trattati.
C. tetani
Epidemiologia
Si calcola che attualmente a livello mondiale si verifichi circa un
milione di casi di tetano l'anno. La maggior parte dei casi riguarda i
Paesi in via di sviluppo dove la vaccinazione antitetanica non
diffusamente praticata. In questi Paesi si ha anche un' elevata incidenza
di tetano neo natale. Nei Paesi industrializzati grazie alle strategie
vaccinali di massa praticate a partire dagli anni cinquanta del secolo
scorso, l'andamento dell'infezione tetanica è stato caratterizzato da un
progressivo decremento di incidenza.
In Italia, attualmente vengono notificati circa un centinaio di casi di
tetano l'anno. I casi riguardano, quasi esclusivamente, soggetti di età
avanzata che non sono stati vaccinati o sono stati vaccinati
incompletamente.
C. tetani
Diagnosi di laboratorio
La diagnosi di tetano viene di solito posta su basi cliniche e
la somministrazione di siero antitossina deve essere
effettuata non appena si abbia un sospetto diagnostico.
C. tetani può essere isolato dalle ferite infette in circa il
30% dei casi.
Colorazione di Gram.
Semina su terreno ricco.
I saggi per la dimostrazione della produzione di
tetanospasmina e della sua neutralizzazione da parte di
antisieri specifici vengono effettuati inoculando
sovranatanti di coltura del ceppo isolato in topi non
immuni o protetti mediante somministrazione degli
antisieri.
C. tetani
Terapia e profilassi
Nei casi di sospetto tetano in individui non vaccinati o che
hanno ricevuto una dose di richiamo vaccinale da più di 10
anni, si devono immediatamente somministrare 250- 500
UI di immunoglobuline umane antitossina, in grado di
neutralizzare la tossina non ancora legata alle cellule
nervose. Contemporaneamente, deve essere inoculato
vaccino antitetanico in un'altra sede corporea. Devono
essere presi provvedimenti volti a mantenere la funzione
respiratoria (ad esempio intubazione, ventilazione forzata)
e si devono somministrare benzodiazepine (antagonisti
dell'acido y-aminobutirrico GABA) in grado di prevenire o
ridurre gli spasmi muscolari.
C. tetani
Terapia e profilassi
La vaccinazione contro il tetano, dagli anni 40 in Italia,
viene effettuata con il tossoide o anatossina tetanica, un
preparato purificato di tossina tetanica trattata con
formolo a 37°C. Le modificazioni chimiche indotte dal
trattamento fanno si che il tossoide sia privo di potere
tossico, ma mantenga le caratteristiche immunogeniche
della tossina e sia, pertanto, in grado di indurre nell' ospite
la produzione di anticorpi neutralizzanti. Nel nostro Paese,
la vaccinazione antitetanica viene eseguita prima del
compimento del 7° anno di vita e a distanza di 4-5 anni dal
ciclo primario di vaccinazione; i successivi richiami
vengono eseguiti ogni 10 anni.
Images of People Affected by the
Disease
C. perfringens
Clostridium perfringens è la specie più
frequentemente isolata dai campioni clinici,
associato a semplice colonizzazione oppure causa di
grave malattia e morte. Bacillo di grandi
dimensioni, di forma rettangolare, per il quale la
produzione di spore è stata osservata raramente. E’
uno dei pochi clostridi immobili, a rapida crescita;
è emolitico e metabolicamente attivo. La
produzione delle 4 principali tossine letali (alfa,
beta, epsilon e iota) e un’enterotossina viene
utilizzata per suddividere i ceppi isolati in 5 tipi ( da
A a E).
C.perfringens
perfringens
C.
La tossina alfa, la più importante e la sola ad essere
prodotta da tutti i C.perfringens, è una lecitinasi
(fosfolipasi C) che provoca la lisi degli eritrociti, piastrine,
leucociti e delle cellule endoteliali.
La tossina beta è responsabile delle lesioni necrotiche.
La tossina epsilon è una protossina che aumenta la
permeabilità vascolare della parete gastroenterica.
La tossina iota ha attività necrotica e aumenta la
permeabilità vascolare.
L’enterotossina è una proteina termolabile prodotta nel
colon e rilasciata durante la formazione delle spore,
modifica la permeabilità di ileo e digiuno.
perfringens
C.C.Perfringens
Manifestazionicliniche
cliniche
manifestazioni
Mionecrosi (gangrena gassosa) dovuta alla penetrazione dei
clostridi nei tessuti attraverso un trauma; essi generano una
estesa necrosi a carico dei muscoli. Può portare alla morte
nel giro di 2 giorni.
Cellulite, fascite e altre infezioni dei tessuti molli poiché
sono anaerobi sono in grado di germinare e di crescere in
ferite profonde che diventano necrotiche in seguito a una
minore irrorazione di sangue.
Intossicazione alimentare deriva dall’ingestione di prodotti
a base di carne contaminati da molti microrganismi (1010).
Enterite necrotizzante, setticemia.
C. Perfringens
C. perfringens
Identificazione
L’essudato viene coltivato in brodo tioglicolato e su piastre
di agar-sangue che vengono incubate sia aerobicamente che
anaerobicamente. La presenza di bastoncelli G+ che
crescono solo in anaerobiosi è un indice certo della
presenza di clostridi.
C. perfringens è caratterizzato da violenta fermentazione
nel latte in cui il coagulo è compreso dai gas che si formano
durante la fermentazione del lattosio. I batteri che
producono la tossina alfa possono utilizzare le lecitine in
terreni al rosso d’uovo.
C. Perfringens
C. perfringens
Terapia
Pulizia chirurgica dell’area interessata e dei tessuti
devitalizzati.
Contemporaneo trattamento con penicillina e
ossigenoterapia
Somministrazione di antitossine
C. difficile
Clostidium difficile
E’ la principale causa di diarrea infettiva in
nosocomio
Le infezioni possono essere esogene da
persona a persona (la manipolazione da
parte del personale sanitario rappresenta il
principale veicolo del germe) o endogene
per il sopravvento di ceppi produttori di
tossina dopo trattamento antibiotico.
C. difficile
Alcuni pazienti possono essere colonizzati e
asintomatici, in altri le manifestazioni cliniche
possono variare da diarrea lieve auto-limitante
a coliti pseudomembranose fulminanti con
pericolo di vita.
Solo l’1-5% dei pazienti vanno incontro a
malattia grave con conseguente colectomia,
ricovero in rianimazione e morte (la mortalità
è elevata anche dopo intervento chirurgico)
C. difficile
Colite pseudomembranosa
Uso prolungato di ampicillina
e clindamicina è associato a
questa patologia
Tossina A (enterotossina) e
tossina B (citotossina)
Trattamento: metronidazolo e
vancomicina
Campioni: feci, ricerca delle
tossine
Colite da terapia antibiotica: placche bianche di fibrina, muco e accumulo di
cellule infiammatorie che ricoprono la mucosa intestinale (pseudomembrane)
C. difficile
Fino alla metà degli anni ’70 l’importanza clinica
di C. difficile è stata sottovalutata. Veniva isolato
raramente da colture fecali e associato a malattie
umane. A partire dalle seconda metà degli anni ’70
grazie a studi sistematici è emerso che i ceppi di C.
difficile produttori di tossine sono gli agenti causali
di malattie a carico del tratto gastrointestinale
associate al trattamento antibiotico.
Recentemente da alcuni paesi viene segnalato un
aumento dei numero di casi di malattia associata a
C. difficile
C. difficile
Normale componente della popolazione
batterica intestinale riesce a svilupparsi in
grande quantità tale da provocare la malattia
nei pazienti trattati con antibiotico poiché
questi agenti alterano la normale
composizione delle specie batteriche
enteriche.
Provoca la malattia elaborando
un’enterotossina e\o una citotossina.
C. difficile
La diagnosi viene confermata con l’isolamento del
microrganismo da un campione di feci seminato in terreno
di coltura fortemente selettivo, dalla dimostrazione della
citotossina e dell‘enterotossina mediante test
immunoenzimatico.
Il test più specifico per la diagnosi di malattia da C.difficile
è il saggio di citotossicità. L’impiego discontinuo di
antibiotici è in genere sufficiente per guarire la malattia.
Le recidive possono verificarsi nel 20-30 dei pazienti
dopo il completamento della terapia poiché le spore sono
resistenti al trattamento antibiotico.
C.
C. difficile
difficile
C. difficile produce due tossine: tossina A codificata dal
gene tcdA e tossina B codificata dal gene tcdB
La tossina A è un enterotossina: è chemiotattica per i
PMN, induce la produzione di citochine con ipersecrezione
di fluidi causa necrosi emorragica
La tossina B è una citotossina : induce la
depolimerizzazione dell’actina, con distruzione del
citoscheletro sia in vivo che in vitro, principale effetto
responsabile della malattia
P.S.: C. difficile produce inoltre: fattore di adesione che
media adesività alle cellule del colon umano; ialuronidasi
con attività idrolitica su acido ialuronica del connettivo.
C.
C. difficile
difficile
Un’altra tossina binaria è stata (rara) descritta in C. difficile
codificata da due geni cdtA cdtB a localizzazione
cromosomica ma in un sito diverso rispetto all’isola di
patogenicità che contiene i geni per tossina A e tossina B.
Il prodotto di cdtB media l’adesione alla superficie delle
cellule e la traslocazione del prodotto di cdtA che blocca la
polimerizzazione dell’actina mediante ribosilazione
dell’adenina difosfato e morte della cellula.
La tossina binaria ha un ruolo addizionale (aumenta la
gravità della malattia), ma da sola non è in grado di
provocare malattia nell’animale da laboratorio
C.
C. difficile
difficile
Negli anni ’80-’90 è stato osservato che
alcuni ceppi di Clostridium difficile avevano
la tendenza a causare epidemie. Questi
stipiti sono risultati resistenti ad alcuni
antibiotici quali in primis clindamicina
(ermB), aminopenicilline e cefalosporine.
L’uso di questi antibiotici permette ai clostridi
resistenti di sopravvivere agli altri germi
sensibili
C.
C. difficile
difficile
Studi recenti a partire dal 2001 mostrano un incremento
significativo (26%- 30%) del tasso e della gravità della
patologia associata a C. difficile in alcuni ospedali situati
negli Stati Uniti, in Canada, Inghilterra e Olanda. Si ipotizza
che il fenomeno sia essere dovuto all’emergenza di un
nuovo ceppo di C. difficile caratterizzato da aumentata
virulenza e resistenza ad alcuni antibiotici.
I ceppi virulenti sono capaci di indurre malattia grave non
solo nelle popolazioni ad alto rischio, ma anche in
popolazioni a basso rischio: senza esposizione ad
antibiotico o non residenti in case di cura (giovani, sani).
C.
C. difficile
difficile
Quali sono le caratteristiche del nuovo clone
epidemico di C. difficile.
1- è stato descritto in alcuni paesi quali :USA,
CANADA, UK, OLANDA e BELGIO
2- da’ manifestazione grave con tasso di morbidità
e mortalità elavto da 5 a 7 volte il tasso usuale
3-possiede tossina A, tossina B, delezione in tcdC
che provoca un aumento di produzione di A e B di
circa 20 volte e la tossina binaria che aumenta la
gravità
C.
C. difficile
difficile
Caratteristiche del nuovo clone epidemico di
C. difficile.-
A differenza dei ceppi circolanti prima
del 2002 il nuovo clone è
completamente resistente ai
metossifluorochinoloni (gatifloxacina e
moxifloxacina)
può essere sensibile a clindamicina
C.
C. difficile
difficile
In tutti gli studi i FQ sono risultati la classe di
antibiotici più proni ad indurre malattia da C.
difficile
Questo fatto rappresenta un cambio
fondamentale nell’epidemiologia della diarrea
da C. difficile acquisita in ospedale, in quanto
storicamente associata con l’uso di
clindamicina, cefalosporine e aminopenicilline
C. difficile
Eziologia della diarrea associata all’uso degli antibiotici: poiché si stima che
solo il 20% dei casi sia dovuto a C. difficile un test specifico è necessario per la
diagnosi eziologica
Per il controllo
Diagnosi precoce: la dimostrazione della citotossicità in vitro su colture cellulari
sebbene lungo è considerato il gold standard (alta sensibilità e specificità)
Alcuni test rapidi che richiedono poche ore sono stati messi a punto come la
dimostrazione dell’enterotossina mediante saggio immunoenzimatico, sono
meno sensibili, ma sono molto utili nella routine di tutti i giorni e nello screening
rapido dei pazienti in situazioni di emergenza come le epidemie
Le strategie di controllo includono:
1- diagnosi precoce
2- modificare il trattamento antibiotico
3- miglioramento misure igeniche
4- controllo dell’ uso degli antibiotici
C. difficile
Trattamento abbreviato (10 giorni) con
vancomicna, teicoplanina o metronidazolo in
un quarto dei pazienti con colite fulminante il
trattamento standard con metronidazolo o
vancomicina fallisce. L’antibiotico non può
contrastare gli effetti della tossina, ma solo il
germe e se la malattia è troppo avanti
l’antibiotico non riesce a risolvere il problema
C. difficile
Misure igieniche
La prevenzione della malattia è difficile poiché le spore sono difficili da
distruggere si consiglia:
Isolamento in stanze separate
Riduzione del periodo di ospedalizzazione
Utilizzo di guanti e calzari
Pulizia dell’ambiente con ipoclorito di sodio
Pulizia accurata delle mani con sapone e non alcol (non attivo sulle
spore)
Restringere l’uso dei fluorochinoloni su larga scala, visti i loro molteplici
impieghi, sembra assai difficile, tuttavia, se i fenomeni epidemici continuano ad
aumentare sarà opportuno rivedere l’appropriatezza delle indicazioni attuali