CRESCITA BATTERICA
Giovanni Di Bonaventura, PhD
Università «G. d’Annunzio» di Chieti-Pescara
CdS Infermieristica
CdS Assistenza Sanitaria
AA 2016-2017
TERRENI DI COLTURA
Terreno di coltura: mezzo nel quale o sul quale può avvenire lo sviluppo e la crescita in vitro di un
microrganismo
Caratteristiche:
▪ concentrazione adatta di nutrienti per la crescita batterica
▪ adeguato grado di umidità
▪ reazione (pH) adatta
▪ sterili (privi di ogni forma di vita) e protetti da qualsiasi inquinamento
TERRENI DI COLTURA
CONTENUTO QUALITATIVO
▪ Peptoni: insieme di composti idrosolubili, ottenuti per idrolisi (acida od enzimatica) delle proteine
(caseina, soja, ecc.)
▪ NaCl: in concentrazioni adeguate per le necessità osmotiche richieste, in vivo, da alcuni microrganismi
▪ Zuccheri: glucosio, lattosio, mannite, aggiunti per scopi specifici in terreni particolari
▪ Estratti di lievito, carne, d’organo: forniscono fattori di crescita e sali inorganici
▪ Arricchimenti: sangue lisato, emoglobina, latte disidratato, vitamine; necessari per la crescita di
batteri più “esigenti” dal punto di vista nutrizionale
▪ Supplementi selettivi: specifici (antibiotici) o ad ampio spettro (sali biliari, cristalvioletto, sodio-azide)
▪ Indicatori: coloranti (fenolo, blu di bromo fenolo, rosso fenolo, verde di bromo cresolo, ecc.); a valori
critici di pH del terreno ne causano il viraggio, fornendo in tal modo informazioni sul metabolismo
fermentativo del batterio
TERRENI DI COLTURA
CLASSIFICAZIONE
In base allo stato fisico:
▪ Terreni LIQUIDI (brodi): componenti sciolti in acqua e sterilizzati.
▪ Terreni SOLIDI (agar): brodi solidificati per aggiunta di un agente gelificante (agar, gelatina, silica-gel)
In base alla composizione chimica:
▪ Terreni MINIMI: per la crescita dei soli batteri autotrofi. Gli elementi essenziali (N, C, S, P) sono presenti
come sali inorganici in composizione e quantità note.
▪ Terreni SINTETICI (o Definiti): nota la formulazione chimica di ogni ingrediente; le singole sostanze di cui il
batterio necessita sono presenti in quantità note.
▪ Terreni COMPLESSI: a composizione chimica ignota; comprendono la maggior parte dei terreni (estratto
di carne di bue, cuore, cervello).
TERRENI DI COLTURA
CLASSIFICAZIONE
In base alla funzione:
▪ Terreni di ARRICCHIMENTO (o ELETTIVI): la specie microbica di interesse vi cresce in un tempo assai
più breve rispetto ad altre specie microbiche.
▪ Terreni SELETTIVI: contengono sostanze batteriostatiche (sali biliari, tellurito di K, NaCl, azide sodica,
cetrimide, cristalvioletto, antibiotici) a concentrazione nota che inibiscono o rallentano lo sviluppo di
molte specie microbiche, ma non di altre. Utilizzati per l’isolamento di specifici microrganismi da
campioni altamente contaminati (espettorato, feci).
▪ Terreni DIFFERENZIALI: contengono sostanze indicatrici di particolari reazioni biochimiche che
avvengono nel terreno stesso. Usati per la identificazione di specifici microrganismi.
TERRENI DI COLTURA
UTILIZZO IN MICROBIOLOGIA DIAGNOSTICA
Streptococcus pyogenes
Columbia Blood Agar Base
▪ non selettivo, di uso comune, addizionato di sangue per favorire la crescita
di stafilococchi, streptococchi, Helicobacter pylori, etc.
Cetrimide Agar
▪ selettivo per l’isolamento e l’identificazione presuntiva di Pseudomonas
aeruginosa. Magnesio cloruro e potassio solfato stimolano la produzione di
pigmento. Cetrimide – composto ammonio quaternario verso cui P.
aeruginosa è resistente - inibisce la crescita di gran parte dei microrganismi.
Mannitol Salt Agar
▪ selettivo e differenziale per stafilococchi; elevata [NaCl] inibisce crescita di
altri batteri. Sistema fermentante (mannitolo e rosso fenolo): S. aureus,
fermentante, produce colonie giallastre, mentre stafilococchi coagulasinegativi (es. S. epidermidis), non fermentanti, formano colonie rosso porpora
Pseudomonas aeruginosa
TECNICA DI SEMINA
SEMINA IN TERRENO LIQUIDO (BRODOCOLTURA)
▪ La semina in brodo consiste nel sospendere i batteri in
un terreno liquido con l’ausilio di una ansa sterile
▪ Il brodo viene incubato in termostato (37°C, 16-20 ore)
▪ La crescita batterica si mostrerà come un intorbidimento
del brodo
▪ Il grado di torbidità è direttamente proporzionale al
numero di cellule batteriche presenti in coltura.
▪ Possibile formazione di un sedimento sul fondo della
provetta
TECNICA DI SEMINA
SEMINA IN TERRENO LIQUIDO (BRODOCOLTURA)
TECNICA DI SEMINA
SEMINA SU TERRENO AGARIZZATO
Semina per isolamento
▪ Tecnica più frequentemente utilizzata per ottenere la crescita di colonie separate.
▪ Lo striscio avviene mediante utilizzo di un'ansa sterile (bisogna evitare contaminazioni crociate con altri
microrganismi presenti sulla superficie di tale oggetto).
▪ Prevede una serie di semine in differenti aree della superficie dell’agar, in modo da disperdere le
varie cellule presenti sull'ansa (prelevate da brodocoltura o da altra crescita su agar).
Ansa
TECNICA DI SEMINA
SEMINA SU TERRENO AGARIZZATO: FORMAZIONE DI UNA «COLONIA»
▪ La crescita di un batterio su terreno agarizzato dà luogo alla
formazione di «colonie».
▪ Una colonia è un aggregato di cellule che derivano da una iniziale
cellula madre (la «unità formante colonia», UFC).
▪ La «dimensione» di una popolazione batterica viene generalmente
espressa come numero di UFC.
Crescita coloniale su agar
Microscopio elettronico: singola colonia
TECNICA DI SEMINA
SEMINA SU TERRENO AGARIZZATO: FORMAZIONE DI UNA «COLONIA»
TECNICA DI SEMINA
SEMINA SU TERRENO AGARIZZATO
FATTORI CHE INFLUENZANO LA CRESCITA BATTERICA
TEMPERATURA
Crescita vs Tolleranza
▪ la crescita presuppone attiva divisione cellulare (riproduzione) e, quindi, aumento di biomassa; si usa il suffisso
“-fili”
▪ in condizioni non permissive per la crescita, alcuni microrganismi possono sopravvivere ma non riprodursi, si usa il
suffisso “-tollerante”
Esempio:
- un batterio “termofilo” cresce in presenza di elevate temperature
- un batterio “termotollerante” sopravvive ad elevate temperature, ma cresce a temperature inferiori
Obbligato (stretto) vs facoltativo
▪ “Obbligato” (o “stretto”): una data condizione è necessaria per la crescita
▪ “Facoltativo”: il microrganismo può crescere in quella condizione, sebbene non necessaria; viene spesso usato in
presenza di condizioni sub-ottimali.
Esempio:
- un “termofilo obbligato” necessita di elevate temperature per la sua crescita
- un “termofilo facoltativo” può crescere sia ad alte che basse temperature
FATTORI CHE INFLUENZANO LA CRESCITA BATTERICA
TEMPERATURA
La maggior parte dei batteri cresce in un intervallo termico di circa 20°C, esibendo la massima velocità di
crescita ad un certo “optimum termico”
▪ Psicrofili: crescono nel range 0 – 20 °C (Listeria monocitogenes)
▪ Mesofili: crescono nel range 10 – 50 °C (maggior parte dei batteri a rilevanza clinica)
▪ Termofili: crescono nel range 40 – 75 °C
▪ Ipertermofili: crescono nel range 70 – 110 °C
FATTORI CHE INFLUENZANO LA CRESCITA BATTERICA
pH
La maggior parte dei batteri cresce a valori di pH compresi tra 6
ed 8, esibendo la massima velocità di crescita ad un certo
“optimum di pH”
▪ Acidofili: crescono al di sotto di pH 6 (pH 2-6,
generalmente); funghi e lieviti generalmente più tolleranti
vs batteri (pH 5-6)
▪ Neutrofili: crescono a pH 6-8; la maggior parte dei batteri
a rilevanza clinica
▪ Alcalofili: crescono a pH > 8 (pH 8-9.5, generalmente)
FATTORI CHE INFLUENZANO LA CRESCITA BATTERICA
PRESSIONE OSMOTICA
▪ La pressione osmotica è la differenza di pressione tra due soluzioni a diversa
concentrazione separate da una membrana semipermeabile.
▪ La membrana cellulare batterica regola il transito di composti da e per la
cellula, agendo da membrana semipermeabile, ossia consentendo il passaggio
di alcuni componenti di una soluzione.
▪ Alofili: microrganismi in grado di crescere in presenza di elevate
concentrazioni saline (6-15% NaCl) (stafilococchi), sopportando elevate
pressioni osmotiche. Queste condizioni sono incompatibili con la vita di gran
parte dei microrganismi (E. coli, P. aeruginosa, etc.)
FATTORI CHE INFLUENZANO LA CRESCITA BATTERICA
CONCENTRAZIONE O 2
▪
▪
▪
▪
▪
Aerobi obbligati: crescono soltanto in presenza di alte concentrazioni di O2 (Bordetella pertussis)
Anaerobi obbligati: crescono in assenza di O2 (Clostridium tetani)
Anaerobi facoltativi: crescono meglio in assenza di O2, ma anche in sua presenza (P. aeruginosa)
Anaerobi aerotolleranti: crescita in anaerobiosi, ma sopravvivono (tollerano) in presenza di O2
Microaerofili: crescono in presenza di ridotta concentrazione di O2 (O2 5%, CO2 10%, N2 85%) (H. pylori)
CRESCITA BATTERICA
ATMOSFERA «CONTROLLATA»: ANAEROBIOSI E MICROAEROFILIA
Cappa (camera) per anaerobiosi
Giara e sacchetto per anaerobiosi e microaerofilia
DIVISIONE BATTERICA
FISSIONE BINARIA
▪ I batteri si replicano per fissione (scissione) binaria:
▪ la più diffusa modalità di riproduzione asessuata dei procarioti
▪ una cellula «madre» dà origine a 2 cellule «figlie»
▪ ciascuna cellula «figlia» ha lo STESSO corredo cromosomico della
cellula «madre»
▪ La gran parte dei batteri ha un tempo di generazione
cellulare che oscilla:
▪ tra 20 e 60 minuti, in condizioni ottimali (in vitro, ossia in laboratorio)
▪ tra 5 e 10 h, al sito di infezione (in vivo, ossia nell’ospite)
DIVISIONE BATTERICA
FISSIONE BINARIA
CINETICA DI CRESCITA BATTERICA
▪ Misurazione delle variazioni temporali del numero di
cellule vitali presenti in una popolazione batterica in
coltura liquida (brodo):
▪ Rappresentazione grafica di tipo “semilogaritmica”:
▪ Si articola in 4 fasi (periodi), distinte e sequenziali:
▪ Fase di latenza (lag phase): i batteri si adattano al nuovo
ambiente, sintetizzando enzimi (necessari al loro
metabolismo) e proteine strutturali. Il numero cellulare non
cambia. Aumento volumetrico.
▪ Fase esponenziale (log phase): tutte le cellule sono in
replicazione attiva. Aumento costante (logaritmico) del
numero cellulare.
▪ Fase stazionaria: Arresto della riproduzione e metabolismo
rallentato per aumento cataboliti tossici e limitazione
nutrienti e O2. Numero cellulare costante (cellule morte =
cellule vive). La cellula sopravvive e può formare spore.
▪ Fase di morte: diminuzione numero cellule vitali per morte
cellulare a velocità esponenziale.
CINETICA DI CRESCITA BATTERICA
Nt = N 0 x 2 n
Nt = n. cellule al tempo t
No = n. cellule al tempo 0
n= n. generazioni al tempo t
TECNICHE PER LO STUDIO DELLA CINETICA DI
CRESCITA BATTERICA
▪ CONTA VITALE CELLULARE MEDIANTE SEMINA SU TERRENO SEMISOLIDO (AGAR)
Diluizioni seriali (10-fold) del campione
Semina (su terreno solido) delle
diluizioni del campione
Incubazione (37°C, 24h)
Conteggio del numero di colonie (UFC)
Calcolo n cellule nella popolazione
UFC/ml = n UFC x fattore diluizione
COPYRIGHT
Questo materiale non può essere distribuito, modificato o pubblicato né in forma
cartacea, né su un sito, né utilizzato per motivi pubblici o commerciali.
E’ possibile utilizzare il materiale solo per motivi personali e non commerciali, purché
ogni copia di questo materiale preservi tutti i diritti di copyright e di proprietà
intellettuale, sempre dopo richiesta rivolta al Prof. Di Bonaventura.
SPOROGENESI BATTERICA
Giovanni Di Bonaventura, PhD
Università «G. d’Annunzio» di Chieti-Pescara
CdS Infermieristica
CdS Assistenza Sanitaria
AA 2016-2017
LA SPORA BATTERICA
“TO DIE TODAY BUT LIVE AGAIN SOMEDAY ”
▪ In alcune specie batteriche, l’evoluzione ha selezionato la capacità di sopravvivere in condizioni
ambientali “estreme”, ossia non compatibili con la vita della maggior parte dei microrganismi,
mediante la formazione di spore.
▪ Spora = forma di resistenza: protegge la cellula batterica da insulti di natura fisica (irraggiamento,
calore, essiccamento, etc.) e chimica (es. disinfettanti, antibiotici)
▪ endocellulare (endospora), in quanto si differenzia a partire dalla forma vegetativa (cellula madre o
sporangio)
▪ metabolicamente quiescente, sprovvista di attività riproduttiva
26
SPECIE “SPORIGENE” DI RILEVANZA MEDICA
Clostridium botulinum
Causa tossinfezioni alimentari (botulismo)
Clostridium tetani
Agente eziologico del tetano
Clostridium perfringens
Causa gangrena gassosa
Bacillus cereus
Causa tossinfezioni alimentari
Bacillus anthracis
Agente eziologico del carbonchio (antrace)
SPORULAZIONE E GERMINAZIONE
SPORULAZIONE
1. Addensamento centrale del cromonema (disposizione “a sbarra”)
2. Duplicazione DNA
3. Separazione dei nucleoidi e formazione del setto sporale di membr
4. Separazione di ciascun nucleoide all’interno di una membrana
5. Formazione della prespora
6. Apposizione di nuove membrane attorno alla prespora; degradazio
7. Sintesi della cortex tra le due membrane
8. Sintesi delle coats
9. Liberazione spora per autolisi dello sporangio
GERMINAZIONE
1. Attivazione
▪ Danneggiamento (calore, acidi, enzimi) e conseguente permeabilizzazione, degli involucri sporali; eliminazione di dipicolinato
e ioni Ca2+. Può essere indotta oppure è fisiologica (invecchiamento).
2. Iniziazione
▪ Recettori cellulari «avvertono» condizioni adeguate per la crescita; ingresso di nutrienti e degradazione cortex
3. Esocrescita
▪ Assunzione di acqua ed ioni (aumento volumetrico)
▪ Ripresa delle principali funzioni metaboliche (sintesi macromolecole)
▪ Fuoriuscita della nuova cellula vegetativa (esocrescita)
SPORULAZIONE
1. Addensamento centrale del cromonema (disposizione “a
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
sbarra”)
Duplicazione DNA
Separazione dei nucleoidi e formazione del setto
sporale di membrana
Separazione di ciascun nucleoide all’interno di una
membrana
Formazione della prespora
Apposizione di nuove membrane attorno alla prespora;
degradazione DNA sporangio
Sintesi della cortex tra le due membrane
Sintesi delle coats
Liberazione spora per autolisi dello sporangio
GERMINAZIONE
1. Attivazione
▪ Danneggiamento (calore, acidi, enzimi) e conseguente
permeabilizzazione, degli involucri sporali; eliminazione di
dipicolinato e ioni Ca2+. Può essere indotta oppure è fisiologica
(invecchiamento).
2. Iniziazione
▪ Recettori cellulari «avvertono» condizioni adeguate per la
crescita; ingresso di nutrienti e degradazione cortex
3. Esocrescita
▪ Assunzione di acqua ed ioni (aumento volumetrico)
▪ Ripresa delle principali funzioni metaboliche (sintesi
macromolecole)
▪ Fuoriuscita della nuova cellula vegetativa (esocrescita)
SPORULAZIONE E GERMINAZIONE
SPORA BATTERICA: STRUTTURA
▪ Parte centrale (core):
▪ citoplasma - contenente dipicolinato di calcio, enzimi, ribosomi - circondato dalla membrana
plasmatica alla cui faccia interna è addossato il DNA.
▪ parete cellulare rudimentale, assai sottile.
▪ Esternamente al core troviamo una serie di involucri sporali:
▪ Cortex (corteccia):
▪ è l’involucro più spesso, composto da dipicolinato di calcio e peptidoglicano.
▪ rimuove osmoticamente l’acqua dal protoplasto, proteggendolo in tal modo dal danno
associato al calore e irraggiamento.
▪ Coats (interno, esterno):
▪ proteine dotate di elevata stabilità per la presenza di legami sulfidrilici (simil-cheratina),
lipidi (1-2%).
▪ forniscono protezione agli agenti enzimatici e composti chimici (es. H2O2).
▪ Esosporio (tunica):
▪ membrana lipoproteica contenente carboidrati.
SPORA BATTERICA: FORMA E POSIZIONE
▪ sferica (Clostridium spp)
▪ ellittica (Bacillus spp)
▪ Dimensioni (vs sporangio):
▪ diametro superiore (C. tetani)
Clostridium spp
▪ Forma:
▪ Posizione:
▪ terminale o sub-terminale (Clostridium spp)
▪ centrale o para-centrale (Bacillus spp)
Bacillus spp
▪ diametro inferiore (B. anthracis)
▪ laterale (rara)
La posizione e la forma della spora possono avere una rilevante valenza diagnostica
La completa risoluzione di malattie causate da
microrganismi sporigeni è difficoltosa o, spesso, impossibile
RILEVANZA MEDICA DELLE SPORE BATTERICHE
Caratteristiche delle spore
Implicazioni mediche
Elevata termoresistenza; resistono ad
ebollizione (100OC), ma vengono inattivate a
121°C (autoclave)
I materiali chirurgici (ferri, fili per suture) debbono essere sterilizzati
mediante autoclavatura (121°C, 15 min, 1 atm)
Elevata resistenza a disinfettanti
Utilizzo di prodotti ad azione “sporicida” (che causi la morte delle spore)
Sopravvivono per molti anni nel terreno e su
oggetti inanimati
Ferite contaminate da terra possono essere infettate con spore prodotte da
C. tetani (tetano) e C. perfringens (gangrena gassosa)
Metabolicamente quiescenti
Inefficacia degli antibiotici nei confronti delle spore
Si formano soltanto in carenza di nutrienti
Le spore non si formano generalmente al sito di infezione, dove la
concentrazione dei nutrienti non è limitante. Si ha sporogenesi quando i
fattori necrotici limitano l’accesso dei nutrienti (gangrena).
Sopravvivono in ambiente acido
Impiegate come probiotici (B. clausii) per la cura del dismicrobismo:
aderendo alla mucosa intestinale, le spore esercitano un'azione battericida
vs eventuali patogeni (competizione per i siti di adesione mucosali,
secrezione di batteriocine) ed immunomodulatrice.
«CONTROLLO» DELLE SPORE
E’ possibile inattivare la vitalità della spora mediante trattamento con:
▪ calore secco (incenerimento)
▪ calore umido (mediante autoclave: 121°C, 15 min, 1 atm)
▪ tindalizzazione (ripetute esposizioni a 60/80°C per 30 min per indurre lo stato di
attivazione, quindi la inattivazione delle forme vegetative)
▪ prolungata esposizione ad energia radiante (raggi , raggi X)
COPYRIGHT
Questo materiale non può essere distribuito, modificato o pubblicato né in forma
cartacea, né su un sito, né utilizzato per motivi pubblici o commerciali.
E’ possibile utilizzare il materiale solo per motivi personali e non commerciali, purché
ogni copia di questo materiale preservi tutti i diritti di copyright e di proprietà
intellettuale, sempre dopo richiesta rivolta al Prof. Di Bonaventura.
