PERMISSIVITÀ DI LINEE FIBROBLASTICHE VERSO
CAPRINE ARTHRITIS ENCEPHALITIS VIRUS (CAEV)
DERIVANTI DA ANIMALI
CON ALTA E BASSA CARICA VIRALE
Rosati S.
Dipartimento di Scienze Veterinarie, Università di Torino.
introduzione
• SRLV e CAEV
• Il virus dell’Artrite Encefalite Caprina
(CAEV) è rappresentato dal sottotipo B1
dei lentivirus dei piccoli ruminanti (SRLV)
• Causa sintomi clinici negli animali adulti
(artrite, mastite, polmonite)
introduzione
• SRLV e CAEV
• Il virus dell’Artrite Encefalite Caprina
(CAEV) è rappresentato dal sottotipo B1
dei lentivirus dei piccoli ruminanti (SRLV)
• Causa sintomi clinici negli animali adulti
(artrite, mastite, polmonite)
CAEV: sottotipo B1
CAEV
SRLV
patogenesi
•
•
•
•
•
•
Via: orale/respiratoria/mammaria scendente
Target: monocita/macrofago
Siti di persistenza
Viremia (n°copie/µg)
Localizzazioni secondarie
Lesioni immunomediate
Frequenza delle forme cliniche
• Artrite
• Mastite induritiva
• Long-term non progressors
Meccanismi di resistenza
• Immunità innata verso i retrovirus
– receptor/co-receptor (difetti di entrata)
– Trim5α (degradazione via proteasoma del capside)
– APOBEC3 (citidina deaminasi: accumulo ipermutazioni)
– Tetherin (inibizione della fase di rilascio)
• Immunità adattativa
– MHC I e II
– Superinfezioni
GAG-PEPTIDE
Immunità
adattativa
ANTIBODY ELISA
4.5
4
-6 dpi
D5
22 dpi
3.5
27 dpi
3
OD
43 dpi
2.5
83 dpi
cutoff
2
1.5
1
0.5
0
#1
#2
#3
#4
#5
BE 10/D2
#6
#7
#8
goat #
MHC I (BE) MHC II (D)
#9 #10 #11 #12
BE 1/D5
Immunità adattativa
• Il ruolo delle superinfezioni
Two Sample t-test
p-value = 0.04
mean of x mean of y
1.601115 1.532695
B1 vs E
l’infezione da genotipo E riduce la carica provirale di
CAEV potenziando l’attività citotossica
Vertebrati e retrovirus: una lunga storia
• 8% del genoma umano è costituito da sequenze retrovirali endogene
• Proteine di fusione espresse a livello placentare
• Milioni di anni di co-evoluzione
• Negli ovi-caprini? 27 eventi di integrazione
• Alcune sequenze sono identiche in pecore e capre
– Evento precedente alla speciazione
• Meccanismi di difesa ed evasione
– Es: Apobec e VIF
il ruolo dell’immunità innata
• Selezione allevamenti CAEV+
• Caratterizzazione del ceppo virale
infettante (sierologica e biomolecolare)
• Sviluppo di una PCR real time
‘allevamento-specifica’
• Classificazione soggetti in base alla carica
virale
introduzione
• In un allevamento in particolare (100%
sieropositivi) è stata registrata una certa
variabilità nella carica provirale
8
6
4
2
High viral load
0
Frequency
10
12
Low viral load
0
500
1000
1500
2000
pvl (N/50ng)
2500
3000
3500
obiettivi…
• Quali sono i fattori responsabili delle
differenze nella carica provirale
– Caratteristiche del virus (origine clonale)
– Caratteristiche dell’ospite
obiettivi…
• Quali sono i fattori responsabili delle
differenze nella carica provirale
– Caratteristiche del virus
– Caratteristiche dell’ospite
metodi…
Ciclo replicativo
Receptors &
Coreceptors
Uncoating & RT
Transcription &
proteins
Integration
metodi…
Receptors &
Coreceptors
Uncoating & RT
Transcription &
proteins
Uncoating e RT
Integration
materiali…
• Isolamento virale da BDM
– solo da animali ad alta carica (HpVL)
– nessun isolamento da animali a bassa carica
(LpVL)
– Verifica del ceppo virale classificato come
B1 (CAEV)
• Biopsie cutanee
– linee cellulari fibroblastiche da entrambe le
classi di animali
metodi…
• Linee fibroblastiche HpVL e LpVL
• Valutazione dell’entrata
– Entry Assay
• Presenza delle proteine virali
– Immunocitochimica
• Presenza di progenie virale
– RT Assay
metodi…
Entry Assay
• Co-trasfezione di HEK293T
– pCAEV AP
– pCMV-env (CAEV B1)
• Infezione dei fibroblasti cutanei con
pseudovirus
• Conta dei foci
MCS
CMV
CMV
1
amp
11046
2210
pCAEV-AP
13256 bp
vpr RU5
8837
5176
1036
amp
pCMVlcn
6212 bp
RU5 gag pol vif
4419
ori
6628
5818 1
1
4141
2071
3106
HPAP
CMV
Antigene capsidico
Fosfatasi alcalina termostabile
SU-TM (env)
Trascrittasi inversa
matrice
Entry assay
Cellula permissiva
Cellula non permissiva
infection
24h
AP stain
metodi…
Immunocitochimica
• Ab policlonale anti-p25
• Fibroblasti infetti con il ceppo virale
isolato dall’allevamento e CAEV Cork
RT Assay
• Valutazione dell’attività
della retrotrascrittasi
fino a 14 dpi
risultati…
Carica provirale
• Elevata differenza tra HpLV e LpVL
8
6
4
2
0
Frequency
10
12
– HpVL: 1571.88 copie/50ngDNA
– LpVL: 54.37 copie / 50ngDNA
0
500
1000
1500
2000
pvl (N/50ng)
2500
3000
3500
risultati…
Entry Assay
• Lieve differenza tra HpLV e LpVL
– HpVL: 1.2 x 103 FFU/ml
– LpVL: 0.5 x 103 FFU/ml
risultati…
Immunocitochimica
• Assenza di segnale in LpLV, anche in
presenza di fusione cellulare e rari sincizi
HpVL
LpLV
SIDiLV
2012
risultati…
RT Assay (detection limit 103 TCID50)
• Assenza di segnale in LpVL
HpVL
LpVL
SIDiLV
2012
discussione…
La linea LpVL sembra in grado di restringere
l’infezione da CAEV rispetto a HpVL
• Minore entrata (CCR5)
• Assenza di proteine del capside (trim5)
• Assenza di attività RT nel sovranatante
(budding)
discussione…
L’immunità innata gioca un ruolo
fondamentale nella restrizione
dell’infezione:
• Polimorfismi nei recettori e corecettori
– CCR5, MR…
• Meccanismi di restrizione post-entry
– TRIM5a, …
• Meccanismi di late restriction
– TRIM5a, tetherin
Conclusioni
• marker genetici per l’identificazione di
individui resistenti a CAEV
• Nuove prospettive per misure alternative
di controllo verso i genotipi virulenti
Ringraziamenti
•
•
•
•
Bertolotti L.1, Profiti M.1
Colussi S.2, Modesto P.2, Peletto S.2, Acutis2
Quasso A.3
Reina R.4
•
1
•
•
•
Dipartimento di Scienze Veterinarie, Università di Torino.
2 IZS del Piemonte, Liguria e Valle D’ Aosta, sezione di Torino.
3 Dipartimento di Prevenzione - Servizi Veterinari - Area Sanità Animale – ASL n. 19 ~ Asti
4 Instituto de Agrobiotecnologia, CSIC-UPNA-Gobierno de Navarra ~ Navarra - Spain
