USO DEL
MICROSCOPIO
OTTICO
STORIA DEL MICROSCOPIO
FINE 1500 Olanda - Haus e Zacharias Janssen, esperti molatori, combinando tra loro diversi
tipi di lenti, scoprirono che la capacità di ingrandimento poteva essere ulteriormente amplificata,
ottenendo, al tempo stesso, un miglioramento nella definizione dell'immagine. 30 ingrandimenti
1624 – Galileo Galilei,
"Occhialino per vedere le cose minime" Adattamento del
cannocchiale con una lente concava e una convessa montate su un
tubo rigido
FINE 1600- Anton van Leeuwenhoek
Non era un accademico ma si dedicò all'ottico
finchè le sue lenti divennero le migliori decisivo fu
l'incontro con Regnier de Graaf che lo introdusse
nella Royal Society.
●
Scoperta PROTOZOI
●
Scoperta BATTERI
Robert Hooke -(1635 - 1703)
perfezionò il microscopio avvalendolo di nuovi
sistemi ottici e di un nuovo sistema di
illuminazione, gli permisero una serie di
scoperte esposte nel libro Micrographia:
anatomia degli insetti
cellule (nel sughero)
osservazioni sui cristalli(cristallografia)
MICROSCOPIO COMPOSTO
Per osservare dettagli di un oggetto lo avviciniamo agli occhi oppure usiamo
una LENTE DI INGRANDIMENTO
Una lente semplice non da mai
più di 6-10 ingrandimenti
2° LENTE
1° LENTE
IMMAGINE
VIRTUALE
SISTEMA DI LENTI :permette un ingrandimento maggiore in cui una seconda lente
ingrandisce ulteriormente l’immagine già ingrandita dalla prima lente.
Su questo principio si basa il
MICROSCOPIO COMPOSTO
MICROSCOPIO COMPOSTO
Il principio alla base del funzionamento anche dei più complessi microscopi è il
medesimo,ovvero quello messo a punto da Galilei:
Stativo di Jackson –Lister
OCULARE
Una lente o un sistema di lenti
convergenti detto OBIETTIVO
che ingrandisce l'oggetto
OBIETTIVO
L'immagine viene ulteriormente
ingrandita da una seconda lente
o sistema di lenti detta
OCULARE
INGRANDIMENTO TOT. = INGRANDIMENTO OBIETTIVO X INGRANDIMENTO OCULARE
Sfrutta il fenomeno della RIFRAZIONE
OBIETTIVO
Fornisce un'immagine REALE,
INGRANDITA e CAPOVOLTA.
L'oggetto è posto tra F (fuoco) e
2F.
FUOCO REALE
FUOCO VIRTUALE
OCULARE
Funziona come una lente di
ingrandimento .
Fornisce un'IMMAGINE
VIRTUALE ULTERIRMENTE
INGRANDITA.
L'immagine fornita dall'obiettivo
si forma tra il fuoco e zero.
L'OBIETTIVO
Una lente o un sistema di lenti convergenti che ingrandisce l’oggetto, l’obiettivo. Gli obiettivi
sono avvitati su una torretta girevole revolver e possono essere fino a sei.
Il valore dell’ingrandimento(20x,40x,60x,100x…)
è inciso sulla montatura, insieme ad altre
indicazioni.
●
PLAN da un’immagine piana del campione
●
DIC adatto per microscopia ad interferenza
●
∞ obiettivi del all’infinito
●
∞/0.17 usare vetrini copri- oggetto di 0.17mm
●
160/- obiettivi che si possono usare senza
vetrini copri oggetti
DALL'OBIETTIVO DIPENDE:
●
IL POTERE DI RISOLUZIONE
●
IL POTERE DI DEFINIZIONE
●
IL POTERE DI INGRANDIMENTO
Un obiettivo è un sistema di lenti convergenti più o meno complesso a
corta focale, che proiettal’immagine ingrandita ed invertita del campione
nel piano focale inferiore dell’oculare in modo che questo possa
“vederla”ed ingrandirla ulteriormente
Sulla montatura sono riportate le caratteristiche dell'obiettivo tra cui
l'APERTURA NUMERICA :
parametro indicativo del potere di risoluzione dell’obiettivo, quindi
della sua qualità ottica
APERTURA NUMERICA
Il fascio luminoso che parte dal
campione diretto all’obiettivo, è un
cono di luce di ampiezza 2α.
L'ampiezza dipende dall'indice di
rifrazione n di ciò che c'è tra
campione ed obiettivo
2α BASSO
2α ELEVATO
Se c’è aria,
con n = 1,
il valore di 2α
sarà basso
Se c’è olio di
cedro, con
n = 1.5
il valore di 2α
sarà elevato
A.N.= n sen α
Massima ampiezza del cono di luce che entra nell’obiettivo.
Il potere di risolutivo è la capacità di distinguere come separati due
punti, senza lenti l’occhio umano distingue due particelle da 0.1mm a una
distanza di 25cm solo se queste distano non meno di 5μm quindi il limite
di risoluzione dell’occhio umano è 5μm
5μm
0.1mm
Il microscopio deve poter ingrandire l’oggetto fino a che i punti di cui è
costituita la sua immagine non siano visibili all’occhio, cioè fino a che non
distino tra loro più di 5 μ m
●
APERTURA NUMERICA
●
INDICE DI RIFRAZIONE DEL MEZZO
●
LUNGHEZZA D’ONDA DELLA LUCE
●
CORREZIONE DELLE ABERRAZIONI
I raggi di luce che, partendo da una sorgente luminosa, convergono a formare il puntoimmagine di unpunto-oggetto, producono uno spot luminoso circondato da anelli di
diffrazione. DISCO DI AIRY o DISCO DI CONFUSIONE
R
Il raggio (R) dipende dalla lunghezza d'onda
(λ) della luce impiegata
MASSIMA INTENSITA'
LUMINOSA
R=0.61λ /sen f
Distribuzione dell'energia nel disco di Airy
f è l’angolo che i raggi di luce marginali formano con l’asse ottico. Il valore di sen f
corrisponde aquello dell’A.N. (cioè n senα ).
Tali considerazioni valgono quando il punto-oggetto è perfettamente a fuoco.
Se consideriamo due punti-oggetto di uguale diametro,
adiacenti e molto vicini.
Ciascuno di essi viene visto come un disco di Airy. Se
i loro anelli di diffrazione sono in parte sovrapposti, i due
dischi potranno essere visti come separati
solo se il dislivello d tra le due curve energetiche sarà
abbastanza elevato da essere visibile all’occhio.
I due dischi devono essere separati da una distanza
almeno uguale al raggio di un disco di Airy
LIMITE DI RISOLUZIONE
minima distanza risolvibile, che è l’inverso del potere di risoluzione
R=0.61λ /A.N.
R=0.61λ /n senα
Maggiore è l’apertura numerica, più vicini potranno essere i punti-oggetto visti separati.
POTERE DI RISOLUZIONE
✔
✔
✔
DIRETTAMENTE PROPORZIONALE all' A.N
DIRETTAMENTE PROPORZIONALE all'indice di rifrazione
del mezzo interposto
INVERSAMENTE PROPORZIONALE alla lunghezza
d'onda della luce (λ)
DISTANZA DI LAVORO
L'uso del liquido è utile per fornire un percorso OMOGENEO alla luce.
Obiettivo a secco : CAMBIA L'INDICE DI RIFRAZIONE PASSANDO DA
UN MEZZO ALL'ALTRO
VETRINO COPRI-OGGETTO n=1.53
ARIA n=1.00
VETRO DELLA LENTE n=1.53
Acqua distillata
n=1.334
Glicerina
n=1.450
Olio di cedro
n=1.515
Olio sintetico
n=1.518
LA QUALITA' OTTICA DIPENDE DALL'OBIETTIVO
1. Uso di luce monocromatica
2. I raggi di luce che provengono dall'oggetto devono
essere paralleli all'asse ottico
3. L'apertura delle lenti molto piccola
Queste condizioni non si riescono a verificare
tutte contemporaneamente quindi si dice che il
sistema ottico è affetto da ABERRAZIONI
ABERRAZIONE CROMATICA
Usando LUCE BIANCA la lente si
può comportare come un prisma
L’immagine e i suoi particolari saranno contornati da una frangia
colorata e non saranno mai perfettamente nitidi.
ACROMATICI
Sono corretti in modo che vadano
a fuocodue lunghezze d'onda,
rosso e verde. Per rendere la luce
monocromatica si usano filtri verdi
ALLA FLUORITE
(FL, FLUOR)
Avvicinano ulteriormente i
punti di fuoco dei raggi di
diverso colore
APOCROMATICI
(APO)
Sono corretti per tre lunghezze
d’onda: verde, rosso e blu.
ABERRAZIONE CROMATICA D'INGRANDIMENTO
Le immagini formate da raggi di diversa lunghezza d’onda (colore)
vanno a fuoco nello stesso piano ma hanno dimensioni diverse
Questa aberrazione viene corretta introducendone una uguale e
contraria negli oculari, che sono detti oculari compensatori. Per
evitare di dover usare due gruppi di oculari, compensatori e no,
tutti
gli
obiettivi
presentano
un’aberrazione
cromatica
ingrandimento, e di produrre solo oculari compensatori.
di
ABERRAZIONE DI SFERICITA'
La lente mette a fuoco i raggi
più periferici in piani più vicini
alla lente che non i raggi
parassiali.(ES. vetrino copri-oggetto
di spessore inadatto.)
Il risultato può essere la presenza di un alone policromo ai bordi
del campo, e in ogni caso un’immagine dai particolari poco definiti.
Un obiettivo corretto per l’aberrazione di sfericità è APLANATICO.
C’è sempre un residuo di aberrazione di sfericità anche nei migliori
obiettivi.
CURVATURA DI CAMPO
L’immagine di un oggetto piano, quale può essere una sezione
istologica, viene riprodotta concava o convessa, cioè sfuocata al
centro o ai bordi
Gli obiettivi corretti per la curvatura di campo sono detti
PLANARI e riportano la scritta PLAN sulla montatura. In
fotomicrografia devono essere usati esclusivamente obiettivi
planari.
OBIETTIVI ALL'INFINITO
Gli obiettivi sono calcolati per produrre un’immagine
intermedia, reale e invertita situata nel piano focale
inferiore dell’oculare.
La distanza tra questo piano e il piano focale
superiore dell’obiettivo (lunghezza ottica del tubo del
microscopio) viene di solito calcolata in modo che la
lunghezza meccanica del tubo del microscopio sia di
160 o 170 mm
Se la lunghezza meccanica del tubo varia,
perché si inseriscono sistemi di variazione degli
ingrandimenti, filtri, prismi o altri intermedi,
l’obiettivo non lavorerà al meglio..
Gli obiettivi all’infinito hanno invece il sistema ottico
calcolato per formare l’immagine intermedia all’infinito,
in quanto da essi parte un fascio di luce a raggi
paralleli.
Lente situata nel tubo del
microscopio
farà
sì
che
l’immagine venga messa a fuoco
ancora una volta nel piano focale
inferiore dell’oculare.
LENTE INTERMEDIA
Vantaggio: nel tubo del microscopio,
sotto la lente intermedia, si possono
inserire gli accessori necessari, senza
alterare le caratteristiche ottiche degli
obiettivi.
CONDENSATORE
Il condensatore concentra, o “condensa”, il fascio luminoso che
proviene dall’illuminatore, sul piano del campione, che da qui
raggiunge il piano focale posteriore dell’obiettivo.
Il diaframma del condensatore, (diaframma di apertura)
è importante per poter inviare all’obiettivo un cono di luce
adatto alla sua apertura numerica.
In questa figura la massima A.N.
dell’obiettivo è sfruttata solo da
una parte del fascio di
proveniente dal condensatore.
luce
Aprendo o chiudendo opportunamente
il diaframma di apertura
si avvicina l’A.N. del condensatore
all’A.N. dell’obiettivo.
il condensatore DEVE essere regolato in altezza, pena
la comparsa di distorsioni cromatiche e scadimento della
nitidezza
Il tavolino dà appoggio al campione ed è
provvisto di mollette di fermo o di dispositivi
traslatori del vetrino.
Di solito è rettangolare, ma può essere anche
circolare, fisso o girevole, per studi in
luce polarizzata o semplicemente per meglio
orientare il campione
Il condensatore è un sistema di lenti con la funzione
di inviare all’obiettivo la quantità di luce adatta alle
sue caratteristiche ottiche. Deve essere regolabile
in altezza e lo si deve poter centrare. E' provvisto di un
diaframma di apertura per regolare l'ampiezza del cono di
luce che entra nell'obiettivo
La vite macrometrica serve per un primo grossolano controllo della messa a
fuoco del campione la vite micrometrica permette la messa a fuoco di
precisione
L’illuminatore è ormai incorporato in tutti i moderni
microscopi, anche i più semplici, e la lampada, a
bassa tensione, è regolabilemediante un reostato
MICROMETRICA
ll diaframma dell’illuminatore, o diaframma di
campo, regola l’ampiezza del fascio di luce che
arriva al condensatore e delimita il campo
microscopico visibile, contribuendo in tal modo al
controllo della qualità dell’immagine. Deve essere
aperto fino a scomparire dal campo visivo.
MACROMETRICA
DIAFRAMMA DI CAMPO
L'OCULARE
L’oculare è un semplice sistema di lenti che “vede”ed ingrandisce
l’immagine del campione già ingrandita dall’obiettivo. Può essere unico
oppure doppio, per una osservazione più comoda
MONOCULARE
BINOCULARE
L’oculare porta inciso un numero sulla
montatura, che indica il suo potere di
ingrandimento di solito 10x.
L’occhio deve essere avvicinato all’oculare fino a quando i raggi di luce uscenti dal
microscopio non convergono e il campo visivo non raggiunge la massima estensione.
Distanza interoculare deve essere regolata in modo che i due campi visivi non si fondono in
uno solo.
Aggiustamento diottrico, si mette a fuoco prima con l’occhio destro quindi tenendo chiuso il
destro, si ruota la righiera di regolazione dell’oculare sinistro fino a mettere a fuoco il campione.
I microscopi biologici dispongono di ottiche in grado di
raggiungere ingrandimenti molto elevati, dai 20x fino a
1000x e oltre. L'obiettivo di osservazione è singolo
l'immagine risulterà bimensionale.
Stereo microscopi sono caratterizzati da una
visione 3D di ciò che si sta osservando in quanto
sono dotati di coppie di obiettivi e oculari che
lavorano simultaneamente dando una visione
realistica del soggetto. (10x a 90x fino 180x)
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MICROSCOPIO MONOCULARE
MICROSCOPIO BINOCULARE
MICROSCOPIO TRINOCULARE
MICROSCOPIO INVERTITO
MICROSCOPIO POLARIZZATORE
MICROSCOPIO A CONTRASTO DI FASE
….
ALTRI TIPI
Microscopio a campo chiaro in cui il fondo è chiaro mentre
l’oggetto,il tessuto l’organismo appare colorato.
Microscopio a campo oscuro il fondo appare nero mettendo in
evidenza il preparato che appare chiaro
Microscopio a contrasto di fase Si basa sul fenomeno
dell'interferenza luminosa.Il preparato viene illuminato da un fascio
luminoso in realtà suddiviso a livello del condensatore in due
porzioni di fase differente e con diverso angolo di incidenza
Microscopio a fluorescenza sfrutta fenomeni di fluorescenza e
fosforescenza indotti nel campione
Microscopio polarizzatore polarizza il fascio di luce su un
determinato piano
Microscopio a interferenza differenziale è basato sui diversi
indici di rifrazione delle varie parti del preparato
Microscopio confocale funziona come un laser evidenziando i vari
piani del preparato.
L’illuminazione secondo Kohler
Il metodo è costituito da tre fasi successive:
1. Centratura e regolazione in altezza del condensatore
Si focalizza con un piccolo ingrandimento un preparato, si chiude il diaframma di
campo mentre si apre il diaframma di apertura e si alza al massimo il
condensatore, lo si centra con le apposite manopole.
Lo si regola in altezza fino ad avere l’immagine con i bordi nitidi.
2. Regolazione del diaframma di campo
Il diaframma di campo si deve aprire fin quando non sparisce appena dal campo
visivo, ed è un’operazione da rifare ad ogni cambio di obiettivo.
3. Regolazione del diaframma di apertura
La regolazione del diaframma di apertura garantisce un’immagine con il miglior
contrasto e con la migliore risoluzione.
Quest’operazione è per lo più affidata all’esperienza, ma in linea di massima il
diaframma si deve chiudere lentamente ed appena l’occhio nota una variazione di
contrasto lo si riapre appena,ad ogni modo meglio che il diaframma sia un po’ più
aperto del dovuto piuttosto che troppo chiuso.
Anche questa è un’operazione da svolgere ad ogni cambio d’ingrandimento.
