Diapositiva 1 - Istituto Superiore di Sanità

La tecnica HPTLC per un rapido screening
qualitativo di prodotti cosmetici a base
vegetale
Francesca Romana Gallo
Giuseppina Multari
Dipartimento del Farmaco
Istituto Superiore di Sanità Roma
Giornata informativa sui prodotti cosmetici: aspetti regolatori e
problematiche emergenti
Roma ISS, 20 giugno 2013
REQUISITI DI QUALITA’ E SICUREZZA
Farmaco
Gmp: determinano la qualità, la sicurezza e l’efficacia,
direttiva 2001/83/EC;
Glp: si riferiscono a procedure secondo cui le prove non cliniche di
laboratorio sono programmate, condotte e controllate. Le procedure di
certificazione di conformità dei centri di saggio alle GLP sono regolate
dal Decreto 4 luglio 1997;
Gcp: sono le norme di buona pratica clinica che devono essere seguite nelle
sperimentazioni cliniche. Attuazione alle direttive europee con i decreti
legislativi: D.Lvo 211/2003 e D.Lvo 200/2007.
Cosmetico
La norma UNI EN ISO 22716 linee guida di riferimento per dimostrare
la conformità alle Gmp richieste dal Reg. 1223/2009, in vigore dall’11
luglio 2013.
Integratore
Alimentare
Regolamento 178/2002/CE (GFLR) relativo alla legislazione sugli
alimenti di carattere generale che specifica le responsabilità del
produttore e impone un obbligo di notifica in caso di problemi di
sicurezza con il prodotto. I singoli produttori sono legalmente
responsabili degli adempimenti previsti dal GFLR e dai molti altri
regolamenti in materia di igiene, qualità, requisiti di fabbricazione e
lavorazione, ecc.
Dispositivo
Medico
Le normative richiedono al produttore una serie di informazioni circa la
qualità della produzione o della manifattura ma non una garanzia di
efficacia e nel caso della classe I è sufficiente un’autocertificazione,mentre
per le altre classi è previsto un controllo sulla fabbricazione e sulla
sicurezza ma non sull’efficacia da parte di un ente preposto.
General Guidelines for Methodologies on
Research and Evaluation of Traditional
Medicines
L’OMS, nel “General Guidelines for Methodologies on Research
and Evaluation of Traditional Medicines” per definire la qualità di
una
pianta
o
di
un
prodotto
a
base
di
piante,
(WHO/EDM/TRM/2000.1), ove altre tecniche da sole non sono
sufficienti, prende in considerazione la possibilità di identificare
una sostanza caratteristica o una miscela di sostanze tramite il
“fingerprint”, definito come impronta digitale specifica della
pianta.
Fingerprint
L’analisi
tramite
“fingerprint”
è
un
valido
metodo
d’identificazione per le piante soprattutto quando non sia
possibile effettuare l’isolamento e il riconoscimento dei vari
principi attivi.
Il gran numero di molecole diverse presenti negli estratti
vegetali rende la separazione cromatografica complessa sia
come tempi di analisi che come rese dei vari costituenti.
Piante utilizzate nei Cosmetici
La Lawsonia inermis L. (Lythraceae), comunemente conosciuta
come Hennè, è una pianta originaria delle regioni dell’Africa
centro-orientale, coltivata in diversi paesi.
Da millenni viene usata per tingere capelli, unghie e per fare
tatuaggi in varie parti del corpo, contiene resine, tannini, glucosidi
quali hennoside A, B e C il cui prodotto di idrolisi e di
autossidazione è il lawsone.
Azione colorante delle foglie di Lawsonia inermis L.
L’azione colorante è dovuta al lawsone (2-idrossi-1,4naftochinone), uno dei
costituenti della Lawsonia
inermis L., potenzialmente tossico (anemia emolitica,
antifertilità,
dermatiti
allergiche,
genotossicità
dimostrata in vitro).
Alcuni
preparati,
O
erroneamente
etichettati
Hennè,
OH
vengono utilizzati per tingere i capelli. Tali prodotti
contengono piante diverse dalla Lawsonia inermis
come Cassia obovata Collad., Indigofera tinctoria L.,
Isatis tinctoria L.
O
lawsone
Lawsone nei cosmetici
La Commissione Scientifica Europea sui Prodotti Cosmetici ed
i Prodotti non alimentari destinati ai consumatori, con il
documento
SCCNFP/0798/04
fornisce
una
valutazione
e
caratterizzazione tossicologica del lawsone definendolo, come
sostanza che può costituire un pericolo per la salute da non
utilizzare nei cosmetici come sostanza chimica aggiunta
proponendo di inserirlo nella classe 2A.
Lawsonia inermis nei cosmetici
La Lawsonia inermis L., come pianta contenente lawsone, è
presente nelle tinture per capelli. La Commissione Scientifica
Europea con il documento SCCP/0943/05 mette in evidenza
che non è presente nell’allegato IV (coloranti ammessi) e che
dovrà essere sottoposta ad ulteriori indagini volte ad ottenere
un giudizio finale sulla sua presunta tossicità.
Analisi tramite Fingerprint
di tinture per capelli
Grazie alla tecnica del “fingerprint” è stato possibile delineare il
profilo chimico caratteristico della Lawsonia inermis L. e
distinguerlo da quello della Cassia obovata Collad. e della
Indigofera tinctoria L., spesso chiamate Hennè, alle quali per
conferire il potere colorante rosso caratteristico, possono essere
aggiunti coloranti di sintesi o lo stesso Lawsone.
Fingerprint in HPTLC
Materie prime “herbal drugs” di Lawsonia inermis L.
A
1
2
3
4 5
6
7
8 9
HPTLC “Fingerprint” di 9
campioni di Lawsonia inermis L.
provenienti da differenti Paesi del
Medio Oriente
Rivelati con il reattivo per le
sostanze naturali.
B
HPTLC “Fingerprint”
tridimensionale dei 9
campioni di Lawsonia
inermis L.
C
Densitogramma di un singolo
campione di Lawsonia inermis
L.  = 337 nm
Phytochemical analysis 2008 19: 550-559
(Gallo FR, Multari G, Giambenedetti M, Federici E)
Fingerprint in HPTLC
Materie prime “herbal drugs” di Cassia obovata Collad e
Indigofera tinctoria L.
Tacce 1-6 Cassia obovata Collad.
A
Traccia 7 Lawsonia inermis L.
Tracce 8-12 Indigofera tinctoria
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
B) Densitogramma della
Cassia obovata Collad.
C) Densitogramma della
Indigofera tinctoria L.
B
C
Lawsonia inermis L.
Cassia obovata Collad.
Indigofera tinctoria L.
Analisi di prodotti commerciali
Tramite HPTLC fingerprint
A
A) HPTLC
•Tr. 1-3 prodotti commerciali dichiarati L. inermis
•(Ref1) Lawsonia inermis L. di riferimento
•Tr. 5 prodotto commerciale dichiarato C. obovata
•(Ref2) Cassia obovata Collad. di riferimento
Lawsonia inermis
•Tr. 7 prodotto commerciale dichiarato I. tinctoria
Cassia obovata
Indigofera tinctoria
•(Ref 3) Indigofera tinctoria L. di riferimento
B) Analisi tridimensionale di prodotti commerciali
B
etichettati come “Hennè” a) neutro, b) rosso,
c) nero. In realtà contengono Cassia obovata,
c
b
a
Lawsonia inermis, Indigofera tinctoria.
Metodo per il fingerprint
Materie prime a confronto con prodotti commerciali
Fase mobile: Etile acetato, acido formico, acqua (82:9:9)
Lastre HPTLC di gel di silice 60 senza fluorescenza
Foto al visualizer a 366 nm
Prodotti
Lawsone
1
2
3
4
5
Vecchi campioni
6
Rif
8
9
10 11
Nuovi campioni
12
Tr. 1 Lawsone
Rif Lawsonia inermis
Campioni vecchi
Tr. 2-3 L. inermis
Tr. 4 Cassia obovata
Tr. 5 Indigofera tinctoria
Campioni nuovi
Tr. 6, 8 L. inermis
Tr. 9, 10 Isatis tinctoria
Tr. 11 Mix L. inermis 91%
Tr. 12 Mix L. inermis 38%
METODO PER IL LAWSONE
Applicato a prodotti commerciali
Fase mobile: Etile acetato,
metanolo, ammoniaca 5 N
(60:15:5)
Foto della lastra visualizzata all’UV 366 nm
Lawsone
Colorante
colorante
Lawsone
Tr. 2
Tr. 3
Lawsone
1
2
3
4 5
6 Rif
Spettro UV effettuato in situ
sulle bande del lawsone e dei
coloranti
Piante utilizzate nei Cosmetici
•
•
•
•
•
•
•
•
Arctostaphylos uva-ursi L. foglie
Famiglia: Ericaceae
Habitat: Terreni sabbiosi, sassosi, umidi
Provenienza: Europa e Nord America
Usi: Diuretico ed antisettico delle vie urinarie
Foglie: Ovato-oblunghe o spatolate, lunghe 7–30 mm e larghe 5–13
mm, apice ottuso o arrotondato, margine intero o leggermente
revoluto
L’impiego tradizionale dell’uva ursina è largamente documentato sia
nel Nord America che in Europa. E’ considerato un rimedio per le
patologie del tratto urinario.
La droga è riportata in diverse farmacopee: British Herbal
Pharmacopoeia, The Japanese Pharmacopoeia, European
Pharmacopoeia.
La droga contiene una grande quantità di composti fenolici di
diverso tipo, tra cui spiccano l’acido gallico, i tannini idrolizzabili e
non idrolizzabili, flavonoidi e i chinoni, tra cui l’arbutina (8-16 %),
anche nota come arbutoside, o come vacciniina (C25H34O14) noto
agente sbiancante naturale della pelle che per tale proprietà viene
utilizzata in cosmesi. A differenza dell’arbutina il suo prodotto di
idrolisi l’idrochinone è inserito nell’anneso II delle sostanze non
ammesse nei prodotti cosmetici.
Specie correlate
Vaccinium vitis-idaea foglie = Mirtillo rosso
Famiglia: Ericaceae
Habitat: Foreste circumboreali,
Provenienza: Eurasia settentrionale e Nord
America
Usi: Diuretico ed antisettico delle vie urinarie
Foglie: Ovato-oblunghe, persistenti con margine
intero o appena crenato, con presenza di
ghiandole resinifere nella pagina inferiore,
dall’aspetto molto simile a quelle dell’uva ursina.
da cui si distingue per l’ assenza della
reticolazione delle due facce delle foglie.
Campioni: [6 mg/ml]
Depositati: 6 μl
Eluente: etile acetato,
ac. formico, acqua
Materie prime
Arctostaphylos uva-ursi foglie
Rif Arctostaphylos uva-ursi L.
standard
flavonoidi
arbutina
1 2
?
3
4 5 6 Rif 8
? ? ?
idrochinone
9 10
Campione 5 tipologia 1
(2, 5, 6, 8)
provenienza Messico
flavonoidi
Lastra trattata con NP reagent e letta al
visualizer a 366 nm
arbutina
idrochinone
arbutina
???
Lettura densitometrica a 275 nm
Campione 1 non identificato
idrochinone
Campione Rif tipologia 2
(3, 4, 9, 10)
provenienza Balcani
I Campioni della tipologia 1 sono Mirtillo
rosso?
Uva ursina
(tipologia 1)
?
?
A. uva-ursi
(tipologia 2)
1 Campione sconosciuto
Rif. Mirtillo rosso di riferimento
2 e 5 Campioni etichettati genericamente come
Uva ursina
Arbutina standard [2 mg/ml]
3 e 4 Campioni etichettati come A. uva-ursi
1
Rif. 2
5 Arb 3
Mirtillo rosso di
Rif
4
Campioni: [5 mg/ml]
Depositati: 6 μl
Eluente: etile acetato, ac. formico, acqua
Specie correlate e sofisticazioni
Arctostaphylos pungens (= glauca) Lindley,
foglie
Famiglia: Ericaceae
Habitat: Boschi mediterranei, e sulle creste del
deserto
Provenienza: Parte meridionale del Nord
America, dalla California al Messico, nota
volgarmente come manzanita.
E’ riportato un elevato contenuto di tannini (10%)
e una certa presenza di arbutina (0,3-1,8 %),
negata da altre fonti.
A. pungens
A. uva-ursi
Campioni: 6 e 8 vecchi, 11-16 nuovi
Rif A. uva-ursi L.
Conc:[ 5 mg/ml]
Depositati: 6 μl= 30 µg
Eluente: etile acetato, ac. formico, acqua
?
6
?
11
8 15 Arb Rif 13 14 16 12
?
Analisi di nuovi campioni con
l’indicazione dell’esatta denominazione
di A. pungens foglie (11, 15) e A. uvaursi foglie (6, 8,11-16).
In HPTLC le macchie corrispondenti
all’Rf dell’arbutina (0.37) nei campioni
di A. pungens hanno un UV e intensità
minore rispetto all’A. uva-ursi.
Lastra letta al visualizer a
366 nm
Rf dell’arbutina 0.37
arbutina nei campioni di A.uva
ursi
Spettro relativo alle bande con Rf
0.37 nei campioni di A. pungens
2,5,6,8,11,15: A. pungens di diversi
grossisti e provenienze [10 mg/ml](4- 5 μl =
40-50 μg)
Rif: A. uva ursi [5 mg/ml] (3 μl = 15 μg)
Arbutina: 0.3 mg/ml (6 μl = 1,8 μg)
Rf arbutina 0.37
2
5
6
8
Vecchi campioni
A. pungens
Arb
11
15
Rif
Eluente: etile acetato, ac. formico, acqua,
Nuovi campioni (82:9:9)
A. pungens
Lastra letta al densitometro a 275 nm trattata
con NP reagent e vista al visualizer a 366 nm
arbutina
arbutina
Non in tutti campioni di A.
pungens è stato possibile
identificare inequivocabilmente
il picco dell’ARBUTINA tramite il
suo Rf e di conseguenza il suo
spettro
arbutina
standard
? arbutina
arbutina
arbutina nei campioni 2
A. pungens
arbutina nel campione 7
A. uva-ursi
Visione 3D della lastra
contenente i campioni di A.
pungens
•La banda a Rf 0.37 ben separata nel campione 2 ha permesso di
identificare l’arbutina presente nei campioni di A. pungens e lo spettro
UV effettuato su questa l’ha confermato ulteriormente.
•l’HPLC-MS ha avvalorato la tesi della presenza di arbutina nella A.
pungens ed ha permesso di dare una valutazione quantitativa che unita
ai dati ottenuti dall’ HPTLC, NMR e HPLC ha consentito di affermare che
l’arbutina è presente nell’Uva ursina in percentuali che variano dall’ 8 al
16 % e nella A. pungens dallo 0,3 all’1,8 %. Affinchè non si verifichi una
diminuizione dell’effetto voluto è di fondamentale importanza che non
avvenga la sostituzione di una pianta con l’altra.
Provenienza dei campioni e loro contenuto in arbutina
Arbutin content (%, w/w) in 16 sample analysed
SAMPLE
ORIGIN
LABEL NAME
ARBUTIN (%, w/w)
1
Macedonia
Bearberry
Below LOD
2
Not declared
Bearberry
2.00 ± 0.10
3
Not declared
Bearberry leaf
11.38 ± 0.06
4
Not declared
Bearberry leaf (tea)
8.09 ± 0.33
5
Mexico
Bearberry Uva-ursi
0.80 ± 0.10
6
Latin America
Bearberry leaf (tea)
0.43 ± 0.03
7
Balkans
Bearberry leaf
9.55 ± 0.01
8
Mexico
Bearberry glauca leaf (tea)
0.64 ± 0.03
9
Albania
Bearberry leaf
11.59 ± 0.02
10
Siberia
Bearberry leaf
15.29 ± 0.06
11
Mexico
Bearberry leaf (tea)
0.61 ± 0.01
12
Albania
Bearberry officinal (tea)
12.45 ± 0.04
13
Macedonia
Bearberry officinal (tea)
7.65 ± 0.07
14
Macedonia
Bearberry leaf (tea)
10.48 ± 0.04
15
Mexico
Bearberry leaf (tea)
0.34 ± 0.01
16
Serbia
Bearberry leaf (tea)
16.93 ± 0.07
Natural product research 2013 27(8): 735-742 (Gallo FR, Multari G, Pagliuca G et al)
CONCLUSIONI
Le
tecniche
quali-quantitative
ufficialmente
riconosciute, come quelle di Farmacopea, unite a
tecniche identificative quali il fingerprint in HPTLC e
HPLC, forniscono un valido aiuto per uno screening di
qualità veloce di piante e loro prodotti.
Con la metodica del fingerprint è possibile individuare
eventuali adulterazioni di prodotti a base di piante,
mediante
il semplice confronto del loro tracciato
cromatografico con quello standardizzato della pianta
di riferimento.
Cosmoprof 2011: la crescita della cosmesi naturale.
E’ emerso:
•un incremento della domanda di prodotti naturali e della filiera certificata;
• il 45% della clientela consuma cosmetici naturali
(Secondo una ricerca di Organic monitor, istituto di ricerca londinese specializzato in prodotti
biologici);
• un giro d’affari che in Europa supera i due miliardi di euro;
• ricerca di bellezza coniugata a etica nei comportamenti;
• prodotti naturali, ovvero di origine vegetale
preferibili per la maggiore tollerabilità per la pelle – e biologici
senza pesticidi sintetici o fertilizzanti;
piante coltivate biologicamente,
• prodotti non testati su animali, e eco-friendly
per il processo produttivo che per il confezionamento;
• Il tutto garantito da appositi enti certificatori.
La tendenza consolidata negli ultimi anni dell’uso di prodotti di origine vegetale
anche nella cosmesi fa capire la necessità di un controllo mirato in questo campo
e la tecnica HPTLC unita ad altre tecniche più sofisticate contribuisce alla
realizzazione di questo obiettivo.
Si ringrazia:
• le ditte di materie prime per averci fornito il materiale su cui lavorare,
• il Reparto “Farmacopea, qualità dei farmaci chimici, sicurezza dei
prodotti cosmetici. Unità difetti e corpi estranei” per averci fornito i dati
HPLC-MS,
• il Dipartimento di Biologia Ambientale dell’Università “Sapienza” di
Roma per il valido e scrupoloso supporto scientifico nel riconoscimento e
catalogazione delle piante, per l’esame al microscopio, e per i dati NMR,
• gli organizzatori per averci invitato a partecipare a questa giornata
informativa.