Laboratorio di tecnologie abilitanti Modulo LTA

Laboratorio di tecnologie abilitanti
Modulo LTA Immunologiche
•  Colture di cellule in sospensione e in adesione
•  Produzione di anticorpi monoclonali
•  Reazione linfocitaria mista (MLR)
Matteo Urbano
Anno accademico
2016/2017
Due linee di difesa
I. adattativa
I linfociti sono responsabili delle risposte immunitarie adattative
Lymphocyte Activation
T cells and B cells are morphologically
identical in the unstimulated or resting
state.
Upon stimulation by antigen, they
become “activated” and begin to
differentiate.
Activated B cells become plasma cells.
Activated T cells can become helper T
cells or cytotoxic T cells.
T and B Cell Activation
Immunita’ Specifica
Teoria della selezione clonale
Ogni organismo produce, soprattutto durante i primi
anni di vita, un'enorme varietà di linfociti diversi in
piccole quantità (cloni): solo quelli che vengono in
contatto con antigeni specifici possono proliferare.
Le cellule B:
la produzione di anticorpi monoclonali
B cells Clonal Selection
•  B-lymphocyte binds
antigen
•  Stimulates
reproduction of B-cells
•  B-cell differentiates
into memory cells and
plasma cells
– Plasma cells
produce soluble
antibody
– Memory cells
display antibody on
surface
Immunoglobulin Structure
Disulfide bond
•  Heavy & Light
Chains
•  Disulfide bonds
–  Inter-chain
–  Intra-chain
Carbohydrate
CL
VL
CH2
CH1
VH
Hinge Region
CH3
Immunoglobulin Fragments:
Structure/Function Relationships
Ag Binding
Complement Binding Site
Binding to Fc
Receptors
Classes of Antibodies
 Five classes of antibodies (IgM, IgD,
IgG, IgA, and IgE) can be distinguished
by differences in the heavy chain
 Differences in the heavy chains (the tail
regions) impart distinctive functional
properties to the classes of antibodies
Organizzazione strutturale dei
principali isotipi delle Ig umane
La produzione degli anticorpi può avvenire nei
confronti di:
Ø  antigeni timo dipendenti, Ag TD,
antigeni proteici, componenti
virali, complessi aptene-carrier. In questo caso la produzione degli
anticorpi richiede l’attivazione delle cells B da parte dei LT helper (CD4+,
TH2). L’Ag viene ingerito da un fagocita (DC, MO) presentato alla cellula T
helper che attiva la cell B causandone la trasformazione in plasmacellula.
Ø  antigeni timo indipendenti, Ag TI, antigeni polivalenti con
epitopi ripetuti (proprietà tipiche dei polisaccaridi batterici, polimeri proteici,
lipopolisaccaridi, glicolipidi, acidi nucleici). Vanno direttamente sui recettori
delle cellule B (immunogobulina) oppure sul recettore del sistema
immunitario innato (TLR)
Antigenic Determinants (Epitopes)
  The specific site of an antigen that binds to an
antibody is called an antigenic determinant or
epitope.
  Most antigens have a variety of epitopes that
generate a number of different antibodies that are
called polyclonal.
  A single idiotype of antibody to an antigen is termed
monoclonal.
Immunizzazione
Induzione deliberata di una risposta
immunitaria
IMMUNOGENO: qualsiasi sostanza in grado di
scatenare una risposta immunitaria
ANTIGENE: qualsiasi sostanza che può legare
uno specifico anticorpo (proteine, carboidrati,
acidi nucleici, molecole organiche)
Per ottenere una risposta immunitaria forte nei confronti di
antigeni proteici è fondamentale che l’antigene sia iniettato
insieme ad un adiuvante
1) Gli adiuvanti convertono gli antigeni proteici solubili in
materiale particolato (più immunogenico)
2) Gli adiuvanti consentono un rilascio lento/prolungato
dell’antigene
3) La maggior parte degli adiuvanti contiene componenti
microbici che incrementano l’immunogenicità della
preparazione,
Induzione di una potente risposta
infiammatoria
Adiuvante: qualsiasi sostanza che incrementa l’immunogenicità
delle sostanze ad essa mescolate
Immunizzazioni ripetute:
1)  Prima in CFA;
successsive in IFA
2)  Aumento titolo anticorpi
3)  Aumento affinità
(ipermutazione somatica)
4)  Switch di classe
In 1975, Kohler and Milstein first
fused lymphocytes to produce a cell line
which was both immortal and a producer
of specific antibodies.
The two scientists were awarded the
Nobel Prize for Medicine in 1984 for the
development of this "hybridoma.”
The value of hybridomas to the field was
not truly appreciated until about 1987,
when MAbs were regularly produced in
rodents for diagnostics.
B cells
  Activated B cells contain a mixture of antibodies
directed against different epitopes.
  Activated B cells have a limited lifetime when grown in
culture.
  How can we select a single B cell clone (monoclonal)
and propagate the cell line?
Hybridomas
 B lymphocytes can mutate into tumor cells that
result in a type of cancer termed myeloma.
 Myeloma cells become “immortal” and will grow
indefinitely in culture.
 Fusion of a single activated B cell and a
myeloma cell will create a hybridoma that can
grow indefinitely in culture.
Monoclonal Antibodies The Mouse System
 Antibodies can be raised in mice by injection of
an antigen.
 Repeated injections create a pool of activated B
cells.
 Removal of the spleen and fusion with myeloma
cells creates a pool of hybridomas.
 Dilution and culture creates many monoclonal cell
lines.
Myeloma cells, mutant
Caratteristiche:
•  no Ab production
•  HGPRTIpoxantina Guanina FosfoRibosil Transferasi
•  TK-
Selezione degli ibridomi
E’ necessario creare condizioni di coltura in cui solo gli
ibridomi siano capaci di sintetizzare il DNA
Sistema HAT (ipoxantina-aminopterina-timidina)
La sintesi di DNA è condizionata alla presenza di NTP
sintetizzati a partire dai rispettivi monofosfati
Gli NTP si formano da:
a- sintesi De novo (via normale)
b - via di salvataggio (via alternativa)
HAT
H = ipoxantina
L’ipoxantina è usata come sorgente esogena di purine (Adenina e
Guanina), è fosforilata dall’enzima Ipoxantina Guanina Fosfo Ribosil
Transferasi (HGPRT) a formare IMP che, alternativamente, può essere
convertito a AMP e GMP
A= aminopterina
L’aminopterina blocca tutte le reazione dell’enzima diidrofosfato
reduttasi (DHPR) che è coinvolto nella sintesi de novo di AMP e GMP e
anche nella metilazione di UMP a formare dTMP. Di conseguenza, la
cellula diventa completamente dipendente dalla via di salvataggio per
produrre i trifosfati purinici e pirimidinici per la sintesi del DNA
T = timidina
La timidina usata come sorgente esogena, è fosforilata dalla timidina
chinasi (TK) per formare TMP.
Impiego degli anticorpi monoclonali
Immunofluorescience
Cellule T:
Il rigetto dei trapianti
Tipi di trapianto
Autologo, trapianto da un individuo allo stesso individuo (cambio solo di sede);
Singenico, tra due individui geneticamente identici (gemelli identici – monozigoti);
Allogenico, tra due individui della stessa specie ma geneticamente differenti
MHCa
MHC restriction delle cellule T
(Zinkernagel & Doherty 1974)
 Il ruolo principale delle molecole MHC è di
iniziare una risposta immunitaria presentando
peptidi antigenici sulla superficie delle cellule
che possano essere riconosciuti dal TCR.
 Interazione MHC-TCR all’inizio di una risposta
immunitaria avviene fra APC e T cells.
MOLECULES OF T LYMPHOCYTE RECOGNITION
Glycoproteins expressed on the surface of cells. MHC class I is composed
of one polypeptide, non-covalently associated with β2microglobulin. MHC
class II is composed of two polypeptides, referred to as α and β.
CD8 T-CELL
CD4 T-CELL
CD3
α
β
TCR αβ
CD4
MHC
CLASS II
β2
α
β
CD8
15 aa
peptide
β1
CD3
β
α
TCR αβ
α2
α1
9 aa
peptide
α1
α2
ANTIGEN PRESENTING CELL
MHC
CLASS I
β2m
α3
ANTIGEN PRESENTING CELL
Il TCR riconosce i peptidi antigenici associati alle molecole
MHC
Le cellule T riconoscono una parte dell’antigene legato noncovalentemente all’MHC sulla superficie di un’altra cellula:
-  le cellule T citotossiche (CTL) riconoscono i peptidi legati
alle MHC di Classe I;
- le cellule T helper (Th) riconoscono i peptidi legati alle
MHC di Classe II
MHC
 Class I: HLA-A, -B, -C.
1 catena pesante con 3 domni --> altissimo
polimorfismo (1500 alleli)
β2-microglobulina
 Class II: HLA-DR, -DP, -DQ.
1 catena α e 1 catena β --> alto polimorfismo
Espressione solo su APC
From Janeway – Travers, Immuno Biologia, Piccin
MHC-­‐I MHC-­‐II From Janeway – Travers, Immuno Biologia, Piccin
Se è vero che il recettore dei
linfociti T (TCR) riconosce un
complesso formato da un peptide
antigenico non-self e da una
molecola MHC self...allora come
fanno alcuni linfociti T a rispondere
a MHC non self?
l linfociti T (attraverso il CD4 e CD8) riconoscono
solo alcuni residui peptidici degli MHC, alcuni di
questi residui sono simili in MHC diversi. In
condizioni fisiologiche non è possibile l'incontro di
un MHC non self, il problema si verifica soprattutto
nei trapianti.
L'organo trapiantato può infatti conservare alcune
APC che presentano quindi ai linfociti T
dell'organismo ricevente peptidi estranei su MHC
non self che vengono quindi riconosciuti a causa
della somiglianza di alcuni residui.
ALLOREATTIVITA’
 10% delle T cells di un individuo sono in grado
di riconoscere molecole MHC di un donatore.
 TRAPIANTI SOLIDI: T cell del ricevente
attaccano organo donato con MHC diverso.
 TRAPIANTI DI MIDOLLO: T cell del donatore
riconoscono MHC del ricevente --> “tempesta”
di citochine --> GVHD
L’ALLORICONOSCIMENTO delle T cell avviene
ad alta frequnza: 1/10 vs. 1/106/7 per T antigene
specifiche.
Alloriconoscimento
•  principale causa del rigetto di trapianti solidi;
•  principale causa del GVHD (Graft Versus Host
Desease) in trapianti di midollo.
G i o rno 0
2 o re teo r i a
G i o rno 1
1) Sc omp le mentazi one d el sie ro
2) Pr ep ar azio ne ter reni (c ompl, HA T,… )
3) C onta cells
4) Pi astr are cells da sospe nsio ne: mielo ma (per
fusio ne) e B16 ( per congel ament o Gi or no 4)
G i o rno 2
FUSI O N E
G i o rno 3
MLR p urifica ti o n
G i o rno 4
1) Pr ep ar azio ne soluzi oni ELISA in diret to
2) Pr ep ar azio ne soluzi oni ELISA sa ndw ich
3) Dis tacc o cellule in a desion e e lor o cong ela me n t o
G i o rno 5
1) ELI SA indi retto
2) Sc ong ela me nto cell ule
3) C oati ng ELISA sa ndwi c h
G i o rno 6
ELI SA San dwich
Prop osta q u e siti
G i o rno 7
An a lisi ELISA sa ndw ich
Ris oluz ion e q u e siti