Large Animals Review, Anno 9, n. 3, Giugno 2003
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EMBRYO TRANSFER NEGLI OVINI E NEI CAPRINI
I - Tecniche di prelievo degli embrioni
GIOVANNI MARTEMUCCI(1),
ANGELA GABRIELLA D’ALESSANDRO(1), ANTONIO CROVACE(2), ALDO NARDI(1)
(1)
Dipartimento di Progettazione e Gestione dei Sistemi Agro-Zootecnici e Forestali - Bari
(2)
Dipartimento di Emergenza e Trapianto Organi - Bari
Riassunto
Viene considerata l’evoluzione della tecnica di prelievo degli embrioni negli ovini e nei caprini. Oltre ai metodi chirurgici
vengono considerate le procedure non chirurgiche, laparoscopiche e semi-laparoscopiche per il recupero degli embrioni. I
metodi laparoscopici e semi-laparoscopici per il recupero degli embrioni risultano meno traumatici e appaiono competitivi rispetto alla procedura chirurgica. Nella capra sono stati studiati, con risultati incoraggianti, metodi non chirurgici di raccolta
degli embrioni. Molte esperienze sono ancora richieste prima che le procedure più innovative possano trovare applicazione su
vasta scala negli ovini e nei caprini.
Summary
In small ruminants, besides surgical method for embryo collection, laparoscopic, non surgical and semi-laparoscopic procedures are developing in sheep and goats. Laparoscopic or semi-laparoscopic embryo collection are less traumatic and appears effective when compared with surgical. In goats are developed, with promising results, non surgical procedure for embryo collection. More data are required before these approaches can be recommended for widespread application.
INTRODUZIONE
Le biotecnologie applicate ai processi riproduttivi sono
in grado di migliorare l’efficienza riproduttiva degli animali e la reddittività degli allevamenti. Il controllo programmato della induzione dell’ovulazione multipla, seguita da fecondazione e trasferimento embrionale (MOET=
Multiple Ovulation and Embryo Transfer) costituisce uno
strumento di grande potenzialità per l’accelerazione dei
ritmi riproduttivi e può contribuire efficacemente alla risoluzione delle problematiche della selezione animale.
Un ruolo importante nell’applicazione dell’Embryo
Transfer viene assunto dalla crioconservazione degli embrioni che consente una accurata valutazione di risposta
alla selezione, la conservazione delle razze in via di estinzione, la eliminazione dello stress nonché la riduzione dei
costi di trasporto e dei problemi sanitari o di adattamento,
legati allo spostamento di animali vivi.
Nei programmi di miglioramento genetico dei bovini,
sia da latte che da carne, il MOET viene considerato nei
* Lavoro svolto nell’ambito del P.F. R.A.I.Z. Pubblicazione N. RZ 295.
sistemi di intensificazione dei ritmi riproduttivi 33. Anche
nei piccoli ruminanti è stato rilevato che l’applicazione del
MOET può contribuire notevolmente ad accelerare il progresso genetico 43, 56 e trovare giustificazione applicativa in
realtà produttive, come quella italiana, in cui problemi di
natura logistica ed economica riducono le potenzialità di
applicazione della inseminazione artificiale nel miglioramento genetico attitudinale52.
Nei grossi animali, come i bovini e gli equini, la manipolazione del tratto riproduttivo attraverso il retto facilita la
raccolta delle uova e il transfer degli embrioni, mentre nei
piccoli ruminanti ciò risulta impossibile. Negli ovini e nei
caprini sussiste infatti la difficoltà di superare la cervice29,
per cui il recupero degli embrioni impone un approccio
transperitoneale. La raccolta e il trapianto degli embrioni
per via chirurgica riduce le possibilità di applicazione su
vasta scala del MOET negli allevamenti dei piccoli ruminanti27. Negli ovini e nei caprini, che peraltro hanno scarso
valore economico, assume quindi particolare rilievo lo sviluppo di metodologie di elevata efficienza, ma vieppiù di
basso costo e di semplice esecuzione.
La metodologia di prelievo degli embrioni costituisce una
fase critica nell’ambito della biotecnologia di embryo-transfer.
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Embryo Transfer negli ovini e nei caprini - I
Recupero degli embrioni: tempi di raccolta
e caratteristiche degli embrioni
Gli embrioni sono recuperati generalmente agli stadi di
morula compatta o di blastocisti (80-300 cellule), corrispondenti al 6°-7° giorno dalla fecondazione nella pecora
e al 6,5°-7,5° giorno dalla fecondazione nella capra, per diverse motivazioni. L’embrione di ovino si sviluppa più rapidamente rispetto a quello di capra (+12-24 ore45; 95% vs
63% di blastocisti-blastocisti schiuse per pecore e capre,
rispettivamente, al 7° giorno dall’estro42). È stato rilevato
che un anticipo della raccolta consente di recuperare una
maggiore quantità di embrioni; nella pecora il recupero risulterebbe particolarmente elevato con il prelievo a 3,5
giorni dall’estro22. Per motivi sanitari gli embrioni possono
essere trasferiti nella ricevente solo con la zona pellucida
intatta (che garantisce la protezione dell’embrione), quindi, prima della estrusione dalla zona pellucida. È stato altresì osservato che agli stadi di morula compatta, e soprattutto di blastocisti, gli embrioni sono più idonei per il con gelamento11, 39. Nei caprini, si consiglia la raccolta al settimo giorno successivo alla comparsa dell’estro, se l’embrione deve essere congelato, poiché al 6° giorno dall’estro sono meno presenti le morule compatte. Va comunque sottolineato che nella capra, è frequente la luteolisi
prematura36, 60, che riduce drasticamente la raccolta degli
embrioni effettuata dopo il quinto giorno dall’estro; pertanto, per aumentare la produzione di embrioni si consiglia la raccolta, fra il secondo e il quarto giorno dall’estro,
con il flushing degli ovidotti.
Gli embrioni arrivano in utero dal 4° giorno successivo
alla comparsa dell’estro.
Nella pecora, l’estrusione dalla zona pellucida dell’embrione può iniziare dal settimo giorno successivo all’estro,
per cui si consiglia la raccolta al 6°-6,5° giorno successivo
alla comparsa dell’estro64.
In generale la procedura di raccolta degli embrioni viene eseguita mediante il lavaggio successivo dei due corni
uterini con un medium (PBS modificata67).
Metodologie di raccolta degli embrioni
Lo studio del recupero degli embrioni dal tratto genitale di pecore e capre è iniziato negli anni ’30 seguendo l’approccio di tipo chirurgico66. Successivamente, nonostante
le modifiche apportate ai criteri di base tracciati dalle prime esperienze, per rendere meno invasive le metodologie
adottate, la via chirurgica è rimasta la tecnica più diffusa,
anche nell’ultimo decennio1, 4, 6, 30, 37, 47, 50.
Procedura chirurgica
Il prelievo chirurgico degli embrioni dalla femmina donatrice prevede l’anestesia generale, che è oggetto di numerosi studi. Sebbene il digiuno prima dell’anestesia non
sia ancora una pratica diffusa, è consigliabile mantenere
l’animale a digiuno dal cibo per 24 ore e dall’acqua per 812 ore prima dell’anestesia, per diminuire la pressione del
rumine sul diaframma e facilitare la ventilazione, per ridurre il gonfiore e impedire o limitare il rigurgito.
Anestesia
La somministrazione di atropina in premedicazione non
risulta vantaggiosa come in altre specie, infatti ai dosaggi
necessari a prevenire la salivazione (0,2-0,8 mg/kg) si instaura una pericolosa tachicardia e dosaggi più bassi possono solo rendere la saliva più viscosa e quindi rendere più
difficoltosa la sua eliminazione dalla oro-faringe.
La bradicardia insorge raramente durante l’anestesia e
può essere controllata con atropina alla dose di 0,02
mg/kg i.v. oppure glicopirrolato alla dose di 0,005 mg/kg.
La premedicazione non è indispensabile nei piccoli ruminanti prima di una anestesia generale, tuttavia gli anestetici utilizzabili per la premedicazione sono: l’acepromazina; gli alfa2 agonisti; il diazepam e il midazolam e gli
analgesici oppioidi.
L’acepromazina alla dose di 0,05-0,1 mg/kg induce nelle
pecore sedazione.
Gli alfa2 agonisti quali xilazina, detomidina, medetomidina e romifidina possono indurre sedazione da leggera a
profonda in relazione alla dose che viene somministrata.
La xilazina viene somministrata a dosi che variano da 0,020,2 mg/kg. Uno studio comparativo tra le somministrazioni i.v. di xilazina alla dose di 0,15 mg/kg, detomidina alla
dose di 0,03 mg/kg, medetomidina alla dose di 0,01 mg/kg
e romifidina alla dose di 0,05 mg/kg, ha evidenziato come
tutte inducano ipossiemia per 45 min. ed aumento della
frequenza respiratoria 16. La xilazina causa una diminuzione della frequenza cardiaca di breve durata e una leggera
diminuzione della pressione arteriosa media (MAP). La
detomidina, medetomidina e romifidina inducono bradicardia significativa, mentre detomidina e romifidina aumentano la MAP 16. La gravità di queste modificazioni cardiovascolari dipenderà dalla dose utilizzata, dalla somministrazione contemporanea di altri anestesici e dalle condizioni fisiche dell’animale.
La somministrazione i.v. di diazepam o midazolam da
soli produce sedazione lieve per 15-30 min. Il midazolam
alla dose di 0,2 mg/kg i.v. induce notevole diminuzione
della risposta allo stimolo algico nella pecora per circa 20
min28; il diazepam viene utilizzato alla dose di 0,2 mg/kg
i.v. per produrre una leggera sedazione.
Gli oppioidi vengono usati come analgesici.
Il butorfanolo alla dose di 0,05-0,20 mg/kg i.m. o i.v.
aumenta la sedazione indotta da acepromazina, xilazina o
diazepam. La durata dell’effetto analgesico è di 1-2 ore.
La buprenorfina alla dose di 0,006-0,01 mg/kg i.m.
somministrata 30 min. prima dell’induzione sembra diminuire la concentrazione degli anestetici gassosi necessaria
all’anestesia. La somministrazione può essere ripetuta dopo 4 ore per il trattamento del dolore post-operatorio.
Per l’induzione dell’anestesia possono essere utilizzati
agenti anestetici iniettabili endovenosi e la somministrazione può avvenire nella vena cefalica, nella vena safena, nella
vena giugulare e, in alcuni casi, anche nelle vene auricolari.
Tra gli anestetici barbiturici, i più comunemente utilizzati sono il tiopentale e il pentobarbitale.
Il tiopentale è molto utilizzato nella pecora per l’induzione in virtù della rapidità dell’effetto e per la facilità di
impiego. Il range tra dosaggio minimo e massimo nell’animale non premedicato è molto ampio, da 7 a 20 mg/kg.
Per evitare sovradosaggi è utile somministrare una dose
Large Animals Review, Anno 9, n. 3, Giugno 2003
iniziale di 5-7 mg/kg di tiopentale al 2,5% e dopo 30 secondi procedere con piccoli boli ogni 20 secondi sino a
quando è possibile, fino a poter intubare l’animale. La durata dell’effetto anestetico è breve e dipende dalla dose
somministrata. Il risveglio è tranquillo. La premedicazione
consente di diminuire il dosaggio del tiopentale in proporzione al livello di sedazione raggiunto.
Il pentobarbitale è utilizzabile nella pecora adulta alla
dose di 30 mg/kg e la somministrazione deve avvenire lentamente, ad effetto. Si osserva comunque grande variabilità nella risposta ottenuta nei diversi soggetti e la durata
dell’effetto è di circa 15 min. in quanto la metabolizzazione del farmaco è rapida.
Tra gli anestetici dissociativi, la ketamina può essere utilizzata da sola o in associazione con diazepam o xilazina; la
tiletamina viene utilizzata in associazione con il zolazepam.
La ketamina da sola o in associazione con il diazepam
induce una sedazione con profonda analgesia e solo parziale depressione dei riflessi di deglutizione e della tosse.
Le dosi raccomandate sono 0,25 mg/kg i.v. di diazepam e
5 mg/kg i.v. di ketamina somministrati nella stessa siringa.
In molti soggetti la metà di questa dose è sufficiente per
procedere all’intubazione orotracheale.
Un migliore miorilassamento si ottiene somministrando
anche butorfanolo alla dose di 0,05-0,10 mg/kg i.v. prima
della somministrazione di diazepam-ketamina. Altri oppioidi oppure xilazina alla dose di 0,02-0,05 mg/kg possono essere utilizzati in alternativa al butorfanolo.
L’acepromazina alla dose di 0,05 mg/kg i.v. o i.m. può
sostituire il diazepam ma bisogna attendere un tempo sufficiente per la successiva somministrazione di ketamina alla dose di 6 mg/kg.
La combinazione di xilazina e ketamina è facile da utilizzare e induce una anestesia di lunga durata. Se i tentativi
di intubazione inducono movimenti di masticazione una
ulteriore dose di 0,1 mg/kg di xilazina porterà al completo
rilassamento. La durata di questo tipo di anestesia è di 3040 min. circa.
In alternativa, la xilazina può essere somministrata i.m.
5 min. prima dell’induzione con 2-4 mg/kg di ketamina i.v.
Gli svantaggi nell’utilizzo di questa associazione sono la
diminuzione della pressione arteriosa media (MAP) e del
rendimento cardiaco, soprattutto se somministrata prima
dell’alotano o isofluorano.
Una associazione di 0,02 mg/kg di medetomidina con 2
mg/kg di ketamina è stata utilizzata per l’anestesia della pecora e gli effetti sono stati antagonizzati con atipamezolo
alla dose di 0,125 mg/kg31, 62. In uno studio, il mantenimento dell’anestesia è stato ottenuto con 0,01 mg/kg di medetomidina e 1 mg/kg di ketamina, somministrati 25 min. dopo la prima iniezione62. La somministrazione di atipamezolo 45 min. dopo l’induzione ha consentito la ripresa della
stazione quadrupedale a distanza di altri 15 min.
Con questo protocollo è possibile l’insorgenza di ipossiemia e moderata ipoventilazione, inoltre, è stato riportato un caso di arresto cardiaco all’induzione. È auspicabile,
pertanto, l’intubazione orotracheale e la somministrazione
di ossigeno per tutta la durata dell’anestesia.
L’associazione tiletamina-zolazepam produce una anestesia di durata maggiore rispetto alla somministrazione di
ketamina-diazepam e non fornisce adeguata analgesia per
gli interventi di laparotomia. È necessario somministrare
35
altri farmaci analgesici come il butorfanolo. In uno studio
è stato osservato come 0,5 mg/kg di butorfanolo i.v. associato a 12 mg/kg di tiletamina-zolazepam i.v. inducano, in
media, una anestesia di 35 min24. Durante questo tipo di
anestesia la pressione arteriosa media e la frequenza cardiaca si mantengono entro limiti accettabili, l’apnea compare nei primi 72 sec. dall’intubazione e l’ipossiemia si osserva nei primi 10 min. di anestesia.
Il propofol è un anestetico registrato per il cane e il gatto. Offre il vantaggio di una rapida metabolizzazione e un
altrettanto rapido risveglio. In soggetti non premedicati il
propofol alla dose di 5-7 mg/kg i.v. induce nella pecora
una anestesia sufficiente all’intubazione 49. Frequentemente, la somministrazione di propofol causa apnea transitoria, ma non rigurgito se si rispetta il digiuno in preparazione all’intervento. La premedicazione con acepromazina alla dose di 0,05 mg/kg o con detomidina alla dose di 0,01
mg/kg e butorfanolo alla dose di 0,1 mg/kg somministrati
i.m.15 consentono di diminuire la dose di propofol necessaria all’intubazione a 4 mg/kg. Il mantenimento dell’anestesia può essere affidato ad anestetici gassosi oppure ad
infusione continua di propofol.
La dose di propofol per il mantenimento varia da 0,3 a
0,6 mg/kg/min e dipende dalla premedicazione effettuata
o meno prima dell’induzione e dall’intensità dello stimolo
chirurgico.
L’ipoventilazione più o meno marcata che si instaura
durante il mantenimento con il propofol può portare a
ipercapnia, per questo è consigliabile somministrare ossigeno attraverso l’intubazione orotracheale o tramite maschera facciale15, 32.
Una combinazione di propofol e ketamina costituisce
una valida alternativa che è stata sperimentata nella
pecora18. L’induzione viene ottenuta con propofol alla dose di 3 mg/kg e ketamina alla dose di 1 mg/kg. Il mantenimento si ottiene per i primi 20 min. con una associazione
di propofol alla dose di 0,3 mg/kg/min. e ketamina alla
dose di 0,2 mg/kg/min.; questi dosaggi vengono successivamente diminuiti a 0,02 mg/kg/min. di propofol e 0,1
mg/kg/min. di ketamina. Il risveglio risulta rapido e senza
fenomeni eccitativi.
Nella pecora è possibile utilizzare anche la guaiafenesina, anche se i costi elevati ne limitano l’uso. L’anestesia si
ottiene somministrando una associazione costituita da 50
mg/ml di guaiafenesina, 1 mg/ml di ketamina e 0,1 mg/ml
di xilazina in una soluzione di destrosio al 5%. Per l’induzione si infondono rapidamente 1,2 ml/kg del cocktail,
mentre per il mantenimento si somministrano 2,6
ml/kg/h32. Durante il mantenimento la pecora viene intubata e collegata ad un circuito respiratorio. Può insorgere
ipossiemia, mentre la frequenza cardiaca e la pressione arteriosa media (MAP) si mantengono entro limiti accettabili. Il risveglio è tranquillo con la ripresa della stazione quadrupedale da parte dell’animale dopo circa 96±50 min. dal
termine dell’infusione.
L’anestesia gassosa viene comunemente utilizzata e risulta ragionevolmente sicura per la chirurgia e le procedure
diagnostiche. Nei piccoli ruminanti sono in uso miscele di
alotano o isofluorano e ossigeno. Offre dei vantaggi quali
il controllo della profondità del piano anestesiologico, la
somministrazione di ossigeno che previene il rischio di
ipossiemia, il rapido risveglio.
36
Embryo Transfer negli ovini e nei caprini - I
Gli svantaggi sono rappresentati dalla difficoltà di applicazione in campo e da possibili problemi legati alla depressione respiratoria e cardiovascolare, che conseguono
all’uso dell’anestetico gassoso.
L’intubazione orotracheale viene effettuata dopo aver
indotto in anestesia l’animale con anestetici iniettabili. La
concentrazione di anestetico somministrato dipende dalle
caratteristiche dell’anestetico utilizzato per l’induzione e
dal tipo di circuito respiratorio, e deve essere somministrato sempre in miscela con una adeguata quantità di ossigeno, facendo uso degli stessi circuiti respiratori utilizzati
per animali da compagnia.
Ad esempio, dopo l’induzione e l’intubazione in animali
anestetizzati con acepromazina e tiopentale, o butorfanolo, diazepam e ketamina, e connessi al circuito respiratorio
circolare, può essere somministrato l’alotano a 1,5% o l’isofluorano a 2,0 o 2,5%, con un flusso di ossigeno pari a 1
o 2 l/min.
Invece, dopo una induzione ottenuta con xilazina e ketamina o con tiletamina-zolazepam, gli anestetici gassosi
devono essere somministrati in dosi inferiori, quali 0,50 o
0,75% per l’alotano oppure 1% per l’isofluorano. Dopo
circa 20 min. dall’inizio della somministrazione, quando la
concentrazione ematica dell’anestetico è stabile, il flusso di
ossigeno può essere ridotto a 1,0 o 0,5 l/min.
Recentemente è stato utilizzato per l’anestesia gassosa
dei piccoli ruminanti il sevofluorano con buoni risultati17.
Vari sono i protocolli di anestesia generale7, 12, 13, 25, 27, 48,
50
. Si riportano di seguito alcuni protocolli utilizzati per gli
interventi chirurgici di prelievo degli embrioni.
Baril et al. 7 inducono l’anestesia generale mediante iniezione intravenosa di tiopentale sodico (8-10 mg/kg), mantenuta, previa intubazione endotracheale, con una miscela
gassosa di alotano e ossigeno.
Martinez e Matkovic38 nella pecora utilizzano una somministrazione intramuscolo di 0,3 ml di atropina all’1% e
0,7 ml di xilazina al 2%; dopo 5 minuti viene somministrata per via endovenosa 1,5 ml di ketamina cloridrato (50
mg/ml).
Nella capra, l’anestesia generale gassosa è indotta mediante iniezione intravenosa di tiopentale sodico (8 mg/kg)
o di pentobarbitale (13 mg/kg) e, con un catetere endotracheale, viene mantenuta con una miscela gassosa di alotano
e ossigeno per l’intera durata dell’intervento5. In caso di
mancata possibilità di utilizzare l’anestesia gassosa, l’anestesia può essere indotta mediante iniezione intramuscolare di
xilazina (0,11 mg/kg), seguita dopo 10 minuti da una iniezione intramuscolare di ketamina cloridrato (5,5 mg/kg),
che consente il mantenimento dell’anestesia50. Amoah e Gelaye2 nella capra utilizzano l’anestesia epidurale con 5-12 ml
di lidocaina al 2% (in rapporto alle dimensioni dell’animale) dopo aver sedato l’animale con una inezione intramuscolo di acepromazina (0,25-0,10 mg/kg).
Procedura di intervento
Per l’intervento chirurgico di prelievo degli embrioni,
l’animale viene posto in decubito dorsale su un tavolo
operatorio con una inclinazione antero-posteriore di 3045°. Il campo operatorio viene preparato effettuando uno
scrub chirurgico. Viene praticata una incisione di 8-10 cm
FIGURA 1 - Prelievo degli embrioni mediante flushing anterogrado dell’utero (da Caira et al. 1992).
lungo la linea mediana, a partire da 2 cm dall’attacco della
mammella, per la esteriorizzazione delle ovaie e dei corni
uterini. Sulle ovaie vengono esaminati i corpi lutei per la
determinazione preventiva della raccolta delle uova.
Il recupero degli embrioni avviene mediante il lavaggio dei
due corni uterini con PBS modificato67 mantenuto a 37 C°. Il
flusso del medium, iniettato all’apice del corno uterino, trasporta gli embrioni che vengono recuperati con il medium attraverso un catetere inserito alla base del corno uterino.
È questa la fase del prelievo che offre un più ampio ventaglio di soluzioni tecniche in merito alla efficacia e praticità del prelievo. Nei particolari, il protocollo può differire
per quanto attiene:
- al flusso del medium di lavaggio: anterogrado (Fig. 1)
o retrogrado, continuo o alternato, seguito o meno
dalla insufflazione di aria;
- alla quantità di medium insufflata (40, 50, 60 ml,
ecc.);
- al tipo di catetere utilizzato (a due o più vie, con o
senza palloncino);
- alla via di accesso in utero del medium di lavaggio (via
infundibulo, con un sottile catetere, o via parete, in
prossimità della giunzione utero-tubarica, con un ago
da perfusione di piccolo calibro);
- all’impiego di soluzioni aspersorie sul tratto riproduttivo e iniettate nella cavità peritoneale, per limitare
l’insorgenza di aderenze (soluzione fisiologica, eparinizzata, soluzione al 6% di destrano-70, ecc.).
Se la raccolta delle uova viene effettuata dopo 2-4 giorni dall’estro, la maggior parte degli embrioni si trova negli ovidotti.
In tal caso la raccolta degli embrioni può essere praticata:
a) dalla fimbria, con il medium di lavaggio iniettato dalla giunzione utero-tubarica o dalla base dei corni
uterini;
b) iniettando il medium (4 ml PBS) nell’ovidutto con
un catetere (1 mm di diametro) inserito per 2 cm
nell’ovidutto attraverso la fimbria, per il trasporto
delle uova nei corni dell’utero che successivamente
sono sottoposti a lavaggio.
Large Animals Review, Anno 9, n. 3, Giugno 2003
Per il flushing oviduttale, nelle capre Nuti et al.48 indicano che gli ovidotti sono cannulati attraverso la parte terminale delle fimbrie con un catetere di plastica e il medium
di flushing viene iniettato con una siringa collegata a un
ago (25 G) inserito in prossimità della giunzione utero-tubarica.
Quando la raccolta delle uova avviene al 6°-7° giorno
successivo all’estro, il recupero degli embrioni viene effettuato da ciascun corno uterino. Alla base del corno uterino, in prossimità della biforcazione, viene inserito un catetere di Foley (N. 8 o 10) per il recupero del medium di lavaggio. Questo viene iniettato per via retrograda oppure
anterograda (Fig. 1) attraverso un ago (19 G), inserito nel
lume uterino in prossimità della giunzione utero-tubarica,
collegato ad una siringa contenente il medium. Dopo il medium di lavaggio, nel corno uterino si può insufflare aria
con la stessa siringa, per il recupero totale del medium.
Per ridurre le aderenze post operatorie, prima della suturazione si può iniettare nella cavità peritoneale soluzione
fisiologica o soluzione eparinizzata; Ishwar e Memon25 riportano la iniezione di 50-100 ml di soluzione al 6% di
destrano-70.
L’utero viene suturato con catgut cromico nel punto di
inserzione del catetere di Foley. La breccia laparotomica
viene ricostruita a strati.
La durata dell’intervento è di 20-30 minuti.
Si esegue una terapia con antibiotici per i tre giorni successivi all’intervento.
Efficienza del metodo
Il tasso di raccolta delle uova con la metodologia chirurgica è mediamente del 70-90%, ma diminuisce considerevolmente allorché il prelievo viene ripetuto più volte sulla
stessa donatrice 7, 11, 13. L’approccio chirurgico infatti porta
alla formazione di aderenze a livello dell’utero, delle ovaie
e degli ovidotti, causa stress per effetto dell’anestesia, condizionando così l’efficacia degli interventi successivi.
Nella pecora, Torres e Sevellec 61, dopo aver ottenuto un
tasso di recupero dell’88% al primo intervento, riportano
una riduzione del 35% al secondo intervento di recupero
e del 64% al terzo, mentre Caira et al.13 riportano un calo
di recupero di uova del 26% dal primo al terzo intervento.
È stato ipotizzato che lo sviluppo di aderenze sia probabilmente all’origine anche dell’aumento del numero degli
ovociti non fertilizzati, perché la presenza di sinechie nel
tratto riproduttivo ostacolerebbe il trasporto dei nemaspermi61.
Nella capra, Senlis et al.55 riportano una riduzione del
6% e del 29% per il secondo e terzo intervento di prelievo
chirurgico degli embrioni.
Caira et al.13 hanno confrontato due procedure di prelievo chirurgico degli embrioni nella pecora: per via uterina e per via cervicale. Quest’ultima procedura prevede,
dopo ripetuti lavaggi del canale cervicale con soluzione fisiologica, l’introduzione in vagina di un catetere di vetro il
cui apice, foggiato ad imbuto, è posizionato sull’ostio cervicale, sì da contenerlo. Dopo laparotomia ed esteriorizzazione del tratto genitale, l’ostio utero-tubarico viene occluso con una clips emostatica; due cateteri endovenosi (19
G) vengono introdotti all’apice dei corni uterini, e il me-
37
FIGURA 2 - Prelievo chirurgico degli embrioni con recupero dalla vagina (da Caira et al. 1988).
dium di lavaggio viene insufflato contemporaneamente e
recuperato, via cervice, dal catetere di vetro posto in vagina (Fig. 2). Nell’esperimento, le due metodiche sono state
ripetute per tre volte ad intervalli di due mesi. Complessivamente, il tasso di recupero medio è stato del 45,7% con
il prelievo uterino e del 47,5% con quello vaginale. In entrambe le procedure, la presenza di aderenze ha influenzato il recupero degli embrioni indicando una scarsa ripetibilità delle metodologie.
La fertilità delle donatrici sottoposte a prelievo chirurgico degli embrioni risulta significativamente ridotta durante la stagione di monta successiva al prelievo58. In uno stu dio condotto sulle razze Gentile di Puglia e Altamurana è
stata valutata la ripresa dell’attività riproduttiva dopo intervento di prelievo chirurgico degli embrioni35. Dopo un
trattamento luteolitico al 14° giorno del ciclo successivo a
quello di superovulazione, il 90% dei soggetti ha manifestato l’estro, mentre si sono registrati bassi valori di fertilità (31,6%).
Il prelievo per via chirurgica riduce il numero di volte in
cui si può utilizzare uno stesso animale ai fini della produzione in vivo degli embrioni, condiziona la successiva capacità riproduttiva dell’animale e limita, dunque, la diffusione della tecnologia dell’embryo transfer nei piccoli ruminanti e negli animali di elevato valore genetico, per l’elevato rapporto costo / beneficio29.
Gli approcci alternativi al recupero chirurgico degli embrioni riguardano la raccolta per via trans-cervicale e la
procedura per via laparoscopica.
Recupero trans-cervicale
Gli animali, in anestesia generale o previa sedazione, sono posti su un tavolo operatorio in decubito dorsale. Mediante uno speculum e una pinza atraumatica, l’ingresso
del canale cervicale viene posizionato nella parte anteriore
della vagina. Il passaggio del catetere di raccolta nell’orificio cervicale viene guidato mediante un dito introdotto nel
38
Embryo Transfer negli ovini e nei caprini - I
retto dell’animale19. Quando l’estremità del catetere di raccolta raggiunge il corpo dell’utero, mediante una siringa
collegata al catetere viene gonfiato il palloncino, che
ostruisce il corpo dell’utero, evitando il passaggio del medium di lavaggio verso la vagina. Il medium di lavaggio
(10-20 ml di PBS) viene quindi immesso in utero e la perfusione dei due corni uterini avviene contemporaneamente. Vengono eseguiti più lavaggi, utilizzando complessivamente 100-200 ml di medium per donatrice.
Il tasso di recupero degli embrioni con questa tecnica è
molto basso, sia negli ovini che nei caprini (36-37%; 21, 57).
Inoltre, il passaggio del catetere attraverso la cervice non
sempre è realizzabile (40% delle donatrici44).
Al fine di recuperare gli embrioni per via trans-cervicale, sono stati sperimentati diversi tipi di catetere privi di
dispositivi ermetici (palloncino) per l’occlusione dell’ostio
cervicale, sia nella pecora19 che nella capra9.
BonDurant et al.10 hanno valutato una procedura di
prelievo trans-cervicale nella capra mediante dilatazione
meccanica della cervice. Con l’ausilio di un particolare
dispositivo, in uso nella pratica ostetrico-ginecologica
umana (Laminaria Japonica dilateria), si dilata il canale
cervicale per consentire successivamente il passaggio del
catetere del flushing, attraverso il quale avviene l’insufflazione e il recupero del medium di lavaggio con gli embrioni. Nelle condizioni sperimentali adottate, pochi embrioni sono stati recuperati e solo nel 20% dei soggetti.
In alcuni casi il catetere ha perforato la parete uterina e,
nella maggior parte dei casi, è stato recuperato poco medium di lavaggio.
È stato proposto l’impiego di farmaci per favorire la dilatazione della cervice.
Nella pecora, Barry et al.8 hanno verificato la possibilità di agevolare il passaggio attraverso la cervice del catetere per il flushing dopo aver sensibilizzato il tratto riproduttivo con un trattamento combinato di prostaglandina E2 (2x 0,5 mg di Prostin E2, Upjon, USA, in 3 ml di
soluzione salina isotonica), applicata direttamente all’ingresso della cervice, ed estradiolo (1 mg i.m. di estradiolo
cypionato, Upjon, USA). Il trattamento con prostaglandina E2 viene ripetuto 12 ore prima della raccolta degli
embrioni. In tutti gli animali trattati è stato possibile attraversare la cervice con un catetere a tre vie per piccoli
ruminanti (IMV, Francia).
È stato realizzato un recupero del 65% degli embrioni
prodotti.
Per agevolare il recupero degli embrioni attraverso la
cervice negli ovini, McKelvey et al.41 hanno proposto l’uso
combinato di estradiolo benzoato (EB, Intervet, 1 mg i.m.)
e una applicazione topica all’ingresso della cervice di prostaglandina E2 (1 mg, PGE2, Upjon) per 4 giorni (ore 9,00)
più una applicazione aggiuntiva di prostaglandina E2 al 4
giorno (ore 16,00). Rispetto ai soggetti controllo, il trattamento ha di fatto favorito la cateterizzazione della cervice.
Il tasso di recupero embrionale tuttavia è risultato basso
(14%) rispetto a quello dei soggetti sottoposti a recupero
mediante intervento chirurgico (46%).
Il recupero trans-cervicale degli embrioni viene generalmente effettuato sotto anestesia generale, sia nella pecora8,
41
che nella capra10, 21.
Nella capra, di recente è stata studiata la possibilità di
recupero trans-cervicale degli embrioni senza anestetizzare
l’animale e con l’impiego di PGF2α, associata o meno alla
ossitocina, per migliorare la contrattilità uterina 51. Prima
del prelievo (-16 o -8 ore), le donatrici sono sottoposte ad
un trattamento con PGF2α (5 mg Dinolytic, Farmacia e
Upjohn, Germania), associato o meno alla somministrazione di ossitocina (1 UI i.v. Oxytocin S, Intervet), prima del
flushing. La procedura prevede il passaggio attraverso la
cervice di un sottile catetere rigido, per procedere con
maggior sicurezza attraverso le pliche cervicali, ma flessibile, per evitare danni alla cervice e alla parete uterina. Attraverso il catetere viene fatto defluire per gravità il medium di lavaggio posto in una boccetta di vetro a circa 150
cm di altezza dalla donatrice. Con piccole insufflazioni di
medium (circa 20 ml/insufflazione) il flushing viene ripetuto più volte (24 volte). Fra il primo ciclo di insufflazioni
e il secondo (12 insufflazioni per ciclo, ciascuno con una
durata di 45 minuti) viene stabilita una pausa di circa 2
ore; la durata complessiva del flushing è di circa 4 ore. Il
tasso di recupero con il trattamento PGF2α 16 ore prima
del flushing è risultato pari all’85% negli animali trattati
con sola PGF2α, e al 91% in quelli trattati con PGF 2α + ossitocina. L’impiego di ossitocina non apporta quindi vantaggi apprezzabili. I tempi richiesti per completare il flushing sono considerevoli.
Suyadi et al.59 hanno modificato la procedura adottata
da Pereira et al.51 per la raccolta trans-cervicale degli
embrioni nelle capre, rendendola più semplice e rapida.
Essa prevede: l’impiego di una struttura di contenimento per l’animale, l’uso di un catetere per il flushing di
maggiore diametro, un anticipo della somministrazione
della PGF2α a 24 ore prima del flushing, la modifica del
flushing (30 lavaggi). Con i primi 10 flushing è stato ottenuto più dell’80% del recupero di uova, il 12% con i
secondi 10 lavaggi e circa il 5% con gli ultimi 10 flushing. Il flushing richiede meno di 45 minuti per capo e
l’impiego di 2 persone.
La raccolta non chirurgica degli embrioni attraverso la
cervice, come alternativa al prelievo chirurgico, ha avuto
un limitato successo. In alternativa c’è stato lo sviluppo
delle tecniche laparoscopiche di recupero delle uova.
Procedura laparoscopica
La metodologia è stata sviluppata sia negli ovini40 che
nei caprini63.
La strumentazione per il recupero degli embrioni in generale è quella classica utilizzata per il controllo endoscopico delle ovaie34, costituita da una ottica laparoscopica a
visione diretta, collegata a un generatore di luce fredda,
due cannule con i trocar, una pinza atraumatica.
La donatrice, sotto anestesia generale e in decubito dorsale, è posta sul tavolo operatorio inclinato a 30-45°.
Per i caprini, secondo Baril et al. 5 dopo aver inserito
una cannula da 6 mm nella parete addominale, 4-5 cm
avanti alla mammella, l’endoscopio viene introdotto nella cavità peritoneale. Mediante insufflazione di aria filtrata si forma uno pneumoperitoneo che serve a separare la parete addominale dai visceri e consente la chiara
visualizzazione della cavità, necessaria per la osservazione e la manipolazione del tratto riproduttivo. Una seconda cannula (5 mm) viene inserita, dalla parte opposta
Large Animals Review, Anno 9, n. 3, Giugno 2003
Figura 3A - Punti di inserimento della strumentazione per il recupero
degli embrioni per via laparoscopica (da McKelvey et al., 1986).
39
Figura 3C - Inserimento del catetere intravenoso in prossimità della
giunzione utero-tubarica.
Catetere di Foley
Capsula
di raccolta
Figura 3B - Inserimento del catetere di Foley nel lume uterino.
Figura 3D - Posizionamento della strumentazione per il flushing dell’utero.
FIGURA 3 - Recupero degli embrioni per via laparoscopica.
alla prima, nella cavità per il passaggio di una pinza
atraumatica. Con l’endoscopio vengono quindi osservati
i corpi lutei e la presenza di eventuali anomalie del tratto riproduttivo. Con l’ausilio della pinza il corno uterino
viene mantenuto vicino alla biforcazione e punto con un
ago di Mintz (2,5 mm di diametro). Una terza cannula di
5 mm viene inserita nella cavità a livello della linea alba,
a 15 cm dalla mammella, per il passaggio di un catetere a
tre vie, la cui estremità è introdotta nel lume uterino attraverso il punto di punzione. Il palloncino fissato sulla
sonda viene gonfiato con una siringa e chiude il lume
uterino alla base del corno. Un piccolo catetere viene inserito attraverso il catetere maggiore e la punta viene inserita nel lume uterino a livello del terzo superiore del
corno. La pinza viene allora utilizzata per bloccare la
giunzione utero-tubarica e impedire il reflusso del medium di lavaggio nell’ovidutto. Il medium di lavaggio
viene quindi iniettato attraverso il corpo della sonda; la
pressione realizzata all’interno del corno, unitamente alla gravità, consentono il recupero del 95% del medium
di lavaggio attraverso il catetere.
Negli ovini, la tecnica utilizzata da McKelvey et al. 40
prevede l’esecuzione di due incisioni, in posizione simmetrica (2 cm) rispetto alla linea alba, a circa 10 cm dal-
l’attacco della ghiandola mammaria, una per il passaggio
della cannula dell’endoscopio e l’altra per il passaggio di
una pinza atraumatica di Semm (Fig. 3 A). Prima dell’inserimento del laparoscopio, nell’addome viene insufflata
CO 2 (circa 4 l14) per consentire la visualizzazione e la
manipolazione degli organi genitali. Una terza incisione
sulla linea alba, a circa 5 cm avanti alle prime due (Fig.
3A), permette il passaggio attraverso una piccola cannula (7 mm di diametro, 7 cm di lunghezza), previamente
rimossa del trocar, di un ago paravertebrale bovino (18
G) per effettuare una incisione di 0,25 cm sulla parete
del corno, diretta nel lume uterino, in prossimità della
biforcazione dell’utero. Rimosso l’ago, viene inserito un
catetere di Foley pediatrico a 2 vie (FG10, per 25 cm di
lunghezza e bulbo terminale di 1,5 cm; palloncino 3 ml)
nel lume uterino (con il bulbo del catetere a 1 cm dall’ingresso) e il palloncino viene disteso con circa 5-7 ml
di aria (Fig. 3B). L’utero viene quindi rilasciato dalla
pinza di Semm, che viene utilizzata per bloccare il corno
uterino alla giunzione utero-tubale. Un catetere intravenoso (16G x 13,5 cm) viene introdotto attraverso la parete addominale sulla linea alba, a 6 cm dalla ghiandola
mammaria (Fig. 3A) e la punta inserita nel lume uterino
in prossimità della giunzione utero-tubarica (Fig. 3C)
40
Embryo Transfer negli ovini e nei caprini - I
per l’insufflazione, con una siringa, del medium di lavaggio (60 ml/corno), recuperato attraverso il catetere di
Foley in una capsula di raccolta (Fig. 3D). In circa 40 secondi vengono iniettati 40 ml di medium mentre 20 ml
vengono iniettati più rapidamente. Con la siringa si
iniettano successivamente nel corno 30 ml di aria per recuperare il medium residuo (circa 10 ml).
Con questa procedura gli Autori 40 riportano un tasso
medio di recupero del 50% per tre sessioni di raccolta
nell’arco di due mesi (range: 35-76%). Non sono state
riscontrate aderenze successive agli interventi; tuttavia,
due pecore hanno evidenziato una crescita endometriale
esterna, che frequentemente può essere accompagnata
da fistole.
Nellenschulte e Niemann46, in uno studio condotto negli ovini, hanno individuato alcuni punti critici nella tecnica laparoscopica di recupero degli embrioni:
a) la giusta pressione del palloncino di cui è dotato il
catetere di Foley può essere controllata solo visivamente. Questa, infatti, è una fase molto delicata dell’intervento poiché, se la pressione è molto forte, si
può verificare la rottura della parete uterina, se la
pressione è troppo debole si determina fuoriuscita
del medium di lavaggio;
b) il clampaggio dell’apice del corno uterino, a livello
della giunzione utero-tubale, diventa una manovra
obbligatoria (tasso di recupero del 6% senza clampaggio) per evitare la fuoriuscita di medium, attraverso l’ovidutto, in cavità peritoneale;
c) se l’insufflazione del medium di lavaggio è troppo
energica si può provocare l’espulsione del palloncino.
Gli Autori riportano un tasso di recupero del 75-80%
in tre sedute successive di recupero ad intervallo di un
mese, e un calo significativo al quarto recupero (47,4%).
In molti casi è stata riscontrata la protrusione dell’endometrio sulla parete dell’utero nel punto di inserimento
del catetere. Con elevati tassi di ovulazione (> 10) il recupero embrionale si riduce considerevolmente (48%).
Il riscontro di una elevata percentuale di uova con pellucida danneggiata è stato attribuito allo stress meccanico
dovuto al lungo percorso delle uova attraverso il catetere utilizzato.
De Cosmo e Degl’Innocenti20 hanno valutato la tecnica
di prelievo laparoscopico nella pecora ottenendo un tasso
di recupero embrionale pari al 40%. Essi hanno concluso
che la procedura risulta troppo laboriosa e non esente da
inconvenienti (prolasso della mucosa uterina, perforazione
della parete uterina da parte del catetere).
Anche nella capra il tasso di recupero degli embrioni
per via laparoscopica (62%) risulta inferiore del 10-15%
rispetto alla metodologia chirurgica53, 63.
Anche se il prelievo laparoscopico degli embrioni, sia
nella pecora che nella capra, consente un tasso di recupero
inferiore rispetto a quello chirurgico, esso può essere ripetuto più volte, senza influenzare la fertilità successiva delle
donatrici7,11,26,54.
La procedura richiede personale specializzato e necessita di ulteriori miglioramenti per consentire una applicazione più diffusa.
Il prelievo degli embrioni per via endoscopica, così come per via chirurgica, può essere effettuato in circa 30 minuti da tre persone (10-12 soggetti al giorno)7.
Recupero semi-laparoscopico
Negli ovini sono state proposte tecniche semi-laparoscopiche di recupero degli embrioni.
Secondo la procedura di Capehart et al. 14, gli animali, in anestesia generale gassosa, vengono preparati per
l’intervento di laparoscopia ponendoli in decubito dorsale su un tavolo operatorio inclinato a 45°. Dopo aver
effettuato il pneumoperitoneo (con circa 4 l di gas
CO2), nella cavità viene inserito il laparoscopio per la
valutazione della risposta ovarica alla superovulazione.
Mediante la visualizzazione laparoscopica, gli apici di
entrambi i corni vengono esteriorizzati con una pinza
di Allis, attraverso una incisione di circa 2,5 cm sulla linea alba. Entrambi i corni vengono incannulati con un
catetere intravenoso (18 G), in prossimità della giunzione utero-tubarica e circa 60 ml di PBS modificata
vengono iniettati simultaneamente in ciascun corno
uterino. Il medium di lavaggio, spinto attraverso il lume uterino e il canale cervicale, viene recuperato in un
dispositivo di raccolta di vetro posizionato contro il
fornice vaginale.
Il tasso medio di recupero embrionale è risultato pari al
49%.
Bari et al.3 hanno utilizzato una tecnica semi-laparoscopica su pecore in anestesia generale, che ricalca in gran
parte la procedura laparoscopica di McKelvey et al.40, con
l’introduzione in utero del catetere di Foley per via endoscopica, con le seguenti modifiche:
1. anestesia locale per i punti di incisione della parete
addominale;
2. esteriorizzazione con una pinza atraumatica dell’apice del corno uterino, attraverso una breccia laparotomica di circa 1 cm sulla linea medio-ventrale, per facilitare il flushing del corno uterino, effettuato con
50 ml di medium;
3. la parete esterna dell’utero viene aspersa con una soluzione eparinizzata (25 ml) per ridurre le aderenze
post-operatorie.
L’intervento di recupero semilaparoscopico risulta
più semplice rispetto alla tecnica laparoscopica integrale e meno stressante per gli animali rispetto alla procedura chirurgica. La tecnica fornisce un recupero embrionale inferiore del 10-20% rispetto alla procedura
c h i r u r g i c a 61,65 .
Di recente, la stessa procedura semi-laparoscopica,
che essenzialmente prevede l’introduzione per via laparoscopica del catetere di Foley nell’utero e poi la esteriorizzazione dell’apice del corno uterino attraverso una incisione di 1 cm sulla linea alba per consentire l’immissione del medium di flushing, è stata così modificata da
Bari et al.4:
1) prima del flushing, vengono immessi attraverso il
catetere di Foley 10 ml di medium per assicurarsi
che la sua estremità sia libera ed inserita nel lume
uterino;
2) per il flushing di ciascun corno vengono utilizzati 30
ml di medium, seguiti da 30 ml di aria e poi ancora
da 30 ml di medium.
Il tasso medio di recupero embrionale è risultato pari
all’83%, comparabile al recupero chirurgico e superiore a
quello conseguibile con il metodo laparoscopico.
Large Animals Review, Anno 9, n. 3, Giugno 2003
Valutazione degli embrioni recuperati
Subito dopo la raccolta, gli embrioni sono mantenuti a
25-27°C, identificati al microscopio (10-70 x) e classificati in: uova non fecondate, embrioni normali (morula
compatta, blastocisti, blastocisti espansa, blastocisti
estrusa), degenerati, con ritardo di sviluppo. Il grado di
sviluppo embrionale viene valutato in rapporto all’intervallo tra il giorno di prelievo e la comparsa dell’estro.
Prima di essere trasferiti o sottoposti al congelamento,
per motivi sanitari gli embrioni sono sottoposti a dieci
successivi lavaggi in PBS.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
CONCLUSIONI
Questa breve rassegna sulle tecniche di prelievo degli
embrioni nei piccoli ruminanti domestici sembra indicare
una soluzione non chirurgica. Con il prelievo chirurgico il
tasso di recupero è ≥ 80%, al primo intervento, ma le aderenze post operatorie compromettono la possibilità di interventi successivi. La procedura laparoscopica consente
di superare questo problema, ma determina un calo del
tasso di recupero embrionale, risulta tecnicamente più difficoltosa e richiede personale specializzato.
Il prelievo non chirurgico degli embrioni, con metodi
alternativi meno invasivi, prevedono il passaggio trans-cervicale di un catetere mediante la dilatazione meccanica
della cervice o l’impiego di prostaglandina E2 ed estradiolo
o PGF2α, per condizionare la cervice. Il recupero degli embrioni attraverso la cervice non ha avuto particolare successo negli ovini. Risultati soddisfacenti di recupero transcervicale degli embrioni, comparabili con la procedura
chirurgica, sono stati ottenuti nella capra.
Recentemente negli ovini è stata adottata una tecnica
definita semi-laparoscopica, che consente di ottenere un
tasso di recupero similare a quella chirurgica e superiore a
quella della procedura laparoscopica. Questa procedura
sembra più accessibile in termini applicativi e meritevole
di una più ampia verifica sperimentale, al fine di renderla
standardizzata ed applicabile su vasta scala.
Parole chiave
Prelievo embrioni, pecora, capra.
Key words
Embryo collection, sheep, goat.
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