L`enzima BstN1crea, due alleli
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RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) frammenti polimorfici di restrizione Siti specifici di azione dell’enzima L’enzima taglia il tratto di DNA in corrispondenza dei siti di restrizione (freccia) sul cromosoma normale (HbA), crea un frammento di 1.15 kb, mentre……… Applicazione diagnostica di RFLP Situazione 1: •la mutazione patologica abolisce un sito di restrizione perApplicazione uno specificodiagnostica enzima di frammento di restrizione Siti specifici di azione dell’enzima X ….sul cromosoma col gene mutato, poiché la mutazione* comporta l’abolizione del sito di restrizione, crea un frammento di 1.35 kb,…….. *converte GAG (per Glu) in GTG per Val Siti specifici di azione dell’enzima probe …….lo stesso enzima quindi crea due frammenti di lunghezza diversa in un individuo eterozigote HbA/HbS L’impiego di una sonda specifica per la sequenza consente di rilevare i frammenti (southern blotting) probe Applicazione in caso di diagnosi di Falcemia Situazione 2: •Un’enzima crea due (o più) diversi frammenti indipendenti dalla mutazione patogena (markers allelici, da utilizzare nell’analisi di segregazione nelle famiglie) L’enzima BstN1crea, due alleli: A con due tagli; e B con tre tagli DNA target amplificato mediante PCR frammento amplificato RFLP come markers allelici vicini ad una mutazione patogena (analisi di segregazione in famiglie) Famiglia con malattia autosomica recessiva Analisi dei patterns di segregazione Famiglia con malattia autosomica recessiva Analisi dei patterns di segregazione Metodiche basate su PCR •PCR-SSP (Sequence Specific Primers) •PCR- multiplex •PCR-ASO (Allele Specific Oligonucleotides) •PCR-SSCP (Single Strand Conformational Polymorphism) Principio dell’SSP MW Principio della PCR- multiplex: - si basa sulla simultanea amplificazione di molte sequenze di interesse con una sola reazione di PCR usando più paia di primers MW Mutazione nota: microdelezioni Y Principio della PCR-ASO: Una sonda oligonucleotidica allele-specifica si ibridizza solo con la sequenza complementare Fibrosi Cistica Mutazione nota: sostituzione puntiforme R1174 Due sonde oligonucleotidiche: 1 allele normale 1 allele mutato Mutazione nota: A T Principio della PCR-SSCP: diversa velocità elettroforetica dei frammenti normali e mutati in gel di poliacrilamide
