RFLP (Restriction Fragment Length
Polymorphism) frammenti polimorfici
di restrizione
Siti specifici di azione dell’enzima
L’enzima taglia il tratto di DNA in corrispondenza dei siti di
restrizione (freccia) sul cromosoma normale (HbA), crea un
frammento di 1.15 kb, mentre………
Applicazione diagnostica di RFLP
Situazione 1:
•la mutazione patologica abolisce un sito di restrizione
perApplicazione
uno specificodiagnostica
enzima
di frammento di restrizione
Siti specifici di azione dell’enzima
X
….sul cromosoma col gene mutato, poiché la mutazione*
comporta l’abolizione del sito di restrizione, crea un
frammento di 1.35 kb,……..
*converte GAG (per Glu) in GTG per Val
Siti specifici di azione dell’enzima
probe
…….lo stesso enzima quindi crea due frammenti di
lunghezza diversa in un individuo eterozigote HbA/HbS
L’impiego di una sonda specifica per la sequenza consente
di rilevare i frammenti (southern blotting)
probe
Applicazione in caso di diagnosi di Falcemia
Situazione 2:
•Un’enzima crea due (o più) diversi frammenti indipendenti
dalla mutazione patogena (markers allelici, da utilizzare
nell’analisi di segregazione nelle famiglie)
L’enzima BstN1crea, due alleli: A con due tagli; e B con tre tagli
DNA target
amplificato
mediante
PCR
frammento amplificato
RFLP come markers allelici vicini ad una mutazione patogena
(analisi di segregazione in famiglie)
Famiglia con malattia
autosomica recessiva
Analisi dei
patterns
di segregazione
Famiglia con malattia
autosomica recessiva
Analisi dei
patterns
di segregazione
Metodiche basate su PCR
•PCR-SSP (Sequence Specific Primers)
•PCR- multiplex
•PCR-ASO (Allele Specific Oligonucleotides)
•PCR-SSCP (Single Strand Conformational
Polymorphism)
Principio dell’SSP
MW
Principio della PCR- multiplex:
- si basa sulla
simultanea
amplificazione di
molte sequenze di
interesse con una
sola reazione di
PCR usando più
paia di primers
MW
Mutazione nota:
microdelezioni Y
Principio della PCR-ASO:
Una sonda oligonucleotidica allele-specifica si ibridizza solo
con la sequenza complementare
Fibrosi Cistica
Mutazione nota:
sostituzione
puntiforme R1174
Due sonde
oligonucleotidiche:
1 allele normale
1 allele mutato
Mutazione
nota:
A T
Principio della
PCR-SSCP:
diversa
velocità
elettroforetica
dei frammenti
normali e
mutati in gel
di
poliacrilamide
