Enzimi (“nel lievito”): un po` di storia

1
ENZIMI
Caratteristiche fondamentali della catalisi
enzimatica e del meccanismo di azione degli
enzimi
Componenti strutturali e funzionali degli enzimi
Nomenclatura e classificazione internazionale degli
enzimi
2
Energia di attivazione
Y si trova ad uno stato energetico inferiore rispetto a X
•
Conversione XY termodinamicamente favorevole
Ma la reazione non avviene se X non acquisisce sufficiente
energia per superare la barriera dell’energia di attivazione
3
Numero di molecole
Distribuzione delle molecole a vari livelli di energia
Energia di attivazione
Molecole con energia
maggiore dell’energia di
attivazione
Energia
Aumento di temperatura
Presenza di un catalizzatore
4
Energia
A
Energia di attivazione
Energia di
attivazione
senza
catalizzatore
Stato
iniziale
P
Stato finale
Energia di
attivazione
con
catalizzatore
Energia
liberata dalla
reazione
5
Enzimi: catalizzatori biologici
Si combinano transientemente col substrato e ne abbassano
l’energia di attivazione
Non modificano l’equilibrio della reazione, ma solo la
velocità con la quale l’equilibrio viene raggiunto
Non vengono modificati nella reazione, e al termine della
reazione sono subito disponibili per catalizzare una nuova
reazione
Stabilizzano lo stato di transizione e riducono la barriera
dell’energia di attivazione inserendo stati di transizione di
livello energetico più basso
6
DNA
RNA
ribosomi
Struttura generale degli enzimi
Zimogeno
(precursore)
Substrato
Apoenzima
Prodotto
Sito attivo
ENZIMA
ATTIVO
Ubiquitina
Lisosomi
degradazione
Parte non-proteica
ione metallico o
coenzima
Sito allosterico
Effettore
allosterico
7
Nomenclatura degli enzimi
Denominazione classica costituita da 3 parti:
•
•
•
Nome del substrato
Nome del coenzima
Nome della reazione catalizzata + “asi”
Esempio: Lattico-NAD-deidrogenasi
International Enzyme Commission, fondata nel 1956 da Prof.
M. Florkin, International Union of Biochemistry:
•
Classificazione degli enzimi secondo il sistema delle classi EC
Esempi:
Creatin kinasi: EC 2.7.3.2, adenosintrifosfato : creatin N-fosfo
trasferasi
Lattato deidrogenasi: EC 1.1.1.27, lattato : NAD+ ossidoreduttasi
•
Ha funzionato bene fino agli anni ‘90 (circa 3200 enzimi)
•
Esistono circa 20,000 geni, di cui almeno 1/4-1/3 sono enzimi
Progetto genoma umano (HUGO):
8
Classificazione internazionale degli enzimi
1 - ossidoreduttasi: reazioni di ossido-riduzione
•
•
•
•
•
•
•
•
•
1.1 agisce sul gruppo CHOH del donatore
1.2 agisce sul gruppo aldeidico o chetonico del donatore
1.3 agisce sul gruppo CH-CH del donatore
1.4 agisce sul gruppo CH-NH2 del donatore
1.5 agisce sul gruppo C-NH del donatore
1.6 agisce su NADH2 o NADPH2
1.7 agisce su altri composti azotati
1.8 agisce su gruppi solforati
1.9 agisce sui gruppi eme
9
Classificazione internazionale degli enzimi
1 - ossidoreduttasi: reazioni di ossido-riduzione
2 - transferasi: trasferimento di gruppi chimici da una
molecola ad un'altra
•
•
•
•
•
•
•
•
2.1 gruppi ad una unità di carbonio
2.2 gruppi chetonici o aldeidici
2.3 gruppi acilici
2.4 gruppi glicosidici
2.5 gruppi alchilici
2.6 gruppi azotati
2.7 gruppi fosforici
2.8 gruppi contenenti zolfo
10
Classificazione internazionale degli enzimi
1 - ossidoreduttasi: reazioni di ossido-riduzione
2 - transferasi: trasferimento di gruppi chimici da una
molecola ad un'altra
3 - idrolasi: reazioni di idrolisi
•
•
•
•
•
•
•
3.1 legami esterei
3.2 legami glicosidici
3.3 altri legami
3.4 legami peptidici
3.5 legami C-N non peptidici
3.6 legami anidridici
3.7 legami C-C
11
Classificazione internazionale degli enzimi
1 - ossidoreduttasi: reazioni di ossido-riduzione
2 - transferasi: trasferimento di gruppi chimici da una
molecola ad un'altra
3 - idrolasi: reazioni di idrolisi
4 - liasi: reazioni di addizione a doppi legami
•
•
•
•
4.1 legami C = C
4.2 legami C = O
4.3 legami C = N
4.4 legami C = S
12
Classificazione internazionale degli enzimi
1 - ossidoreduttasi: reazioni di ossido-riduzione
2 - transferasi: trasferimento di gruppi chimici da una
molecola ad un'altra
3 - idrolasi: reazioni di idrolisi
4 - liasi: reazioni di addizione a doppi legami
5 - isomerasi: reazioni di trasformazione di una molecola nel
suo isomero
•
•
5.1 racemasi
5.2 cis-trans isomerasi
13
Classificazione internazionale degli enzimi
1 - ossidoreduttasi: reazioni di ossido-riduzione
2 - transferasi: trasferimento di gruppi chimici da una
molecola ad un'altra
3 - idrolasi: reazioni di idrolisi
4 - liasi: reazioni di addizione a doppi legami
5 - isomerasi: reazioni di trasformazione di una molecola nel
suo isomero
6 - ligasi: reazioni di formazione di nuovi legami con rottura
di ATP in AMP e pirofosfato o ADP e Pi
•
•
•
•
6.1 legami C-O
6.2 legami C-S
6.3 legami C-N
6.4 legami C-C
14
Classificazione internazionale degli enzimi
1 - ossidoreduttasi: reazioni di ossido-riduzione
2 - transferasi: trasferimento di gruppi chimici da una
molecola ad un'altra
3 - idrolasi: reazioni di idrolisi
4 - liasi: reazioni di addizione a doppi legami
5 - isomerasi: reazioni di trasformazione di una molecola nel
suo isomero
6 - ligasi: reazioni di formazione di nuovi legami con rottura
di ATP in AMP e pirofosfato o ADP e Pi
15
Struttura primaria e mutazioni genetiche
Tutte le funzioni delle proteine necessitano del
riconoscimento fra zone della proteina e altre molecole o
parti di molecola:
•
Enzima-substrato, molecole di adesione-membrane, anticorpoantigene etc
Il riconoscimento è basato sulla distribuzione dei gruppi R e
quindi sulla sequenza degli aminoacidi
•
La zona di riconoscimento e la molecola da riconoscere devono
essere complementari in termini di struttura e di carica
Ogni alterazione della struttura primaria può impedire il
riconoscimento o renderlo difficile, causando disfunzioni più
o meno gravi
•
•
Se ne deriva uno stato patologico, quella mutazione interessa la
zona di riconoscimento
Se la mutazione è silente (non genera malattie o disfunzioni), è
possibile che l'aminoacido mutato non è nella zona di
riconoscimento
16
Modello Lock and Key: l’enzima si combina
chimicamente col substrato
Il sito attivo è costituito dal
“negativo” del substrato
•
Si formano legami ionici e
elettrostatici esatti fra enzima e
substrato
Riconoscimento spesso
tridimensionale
•
•
Esempio: glicerol kinasi (lega
solo glicerolo in forma alfa)
Gli enzimi possono distinguere
gli stereoisomeri D-e L- degli
aminoacidi
Il legame enzima-substrato avviene tramite l’interazione
delle cariche del substrato con alcuni aminoacidi del sito
attivo
Esempio: proteasi a serina
Modifiche della struttura primaria di un enzima possono
mutarne l’attività causando malattie genetiche
17
18
Il legame enzima-substrato induce un cambiamento
conformazionale nell’enzima
Esempio: esochinasi senza e con glucosio
19
Coenzimi
Piccole molecole organiche, spesso derivate da vitamine
Si legano con forte affinità a enzima e substrato
Spesso fungono da secondo substrato
Determinano la specificità della reazione catalizzata
20
Adenosin trifosfato (ATP)
Coenzima delle chinasi, trasferisce un gruppo Pi al substrato
Esempio: Glucosio + ATP  Glucosio-6-fosfato + ADP
In molte chinasi, il substrato vero è Mg-ATP
21
Nicotinamide Adenina Dinucleotide (NAD+)
Coenzima di
deidrogenasi
Derivato da niacina
Trasferisce un
protone da/a
substrati:
lattato + NAD+ 
piruvato + NADH + H+
Esiste una forma
fosforilata NADP+
22
Flavina adenina dinucleotide (FAD)
Coenzima di
deidrogenasi
Derivato da
riboflavina (vit. B6)
Trasferisce due
protoni da/a substrati
Esempio: Succinato +
FAD  Fumarato +
FADH2
23
Coenzima A
Trasportatore e
attivatore di
gruppi acilici
(acidi grassi) e
di acetato
24
Metalli di transizione (Fe, Zn, Cu, Mn…)
Cofattori più che coenzimi
Presenti in 2/3 degli enzimi
Agiscono come stabilizzatori della proteina e come
donatori/accettori di elettroni (acidi di Lewis), per esempio i
citocromi
25
Di tutte le reazioni possibili per un substrato, l’enzima ne
favorisce una sola
Gli enzimi forzano le vie metaboliche attraverso reazioni
selezionate (ad es: A > B > H > K > N > T > Z) favorendo il
flusso unidirezionale di materiale
26
CINETICHE CHIMICHE E ENZIMATICHE
Studio della velocità di trasformazione dei reagenti
in prodotti
Effetto della concentrazione di reagente
Ordine di una reazione
27
Cinetiche chimiche (AP)
Concentrazione di prodotto
Vt
Equilibrio
V iniziale
d[A] d[P]
n

 k[A]
velocità v  
dt
dt
k=costante di velocità
n=numero intero 1-3
Tempo
28
Cinetiche chimiche (A  P)
Conc. di prodotto
Conc. di substrato
Velocità
V iniziale
V finale
Tempo
Tempo
Tempo
29
Effetto della concentrazione di A (A  P)
A4 > A3 > A2 > A1
[prodotto]
Velocità iniziale
A4
A3
A2
A1
Tempo
A1 A2 A3
A4
[A]
30
Cinetiche chimiche vs cinetiche enzimatiche
Velocità iniziale
Cinetica enzimatica
Cinetica chimica
[A]
31
Ordine di reazione
Primo ordine
AP
v=k[A]1, n=1
Secondo ordine
Pseudo primo ordine
Ordine zero
A+BP
v=k[A]1[B]1, n=2
A+BP
v=k[A]1[B]1, n=2
ma se [B]»[A], v=k[A]1, n=1
v=k, n=0
v dipende solo dalla concentrazione del catalizzatore
32
Ipotesi per l’azione degli enzimi
N.B.: [S] >> [E]
E + S  ES  EP  E + P
L’enzima si lega col substrato per formare ES: reazione reversibile
e relativamente lenta
Il complesso ES subisce il cambiamento conformazionale che
induce la formazione di P
L’enzima rilascia P e torna nello stato iniziale
La velocità globale è regolata dalla formazione di ES
33
Interazione enzima-substrato
v0
Se [S] è molto alto, v0 non cambia
all’aumentare di [S]
Vmax
Ordine 0
Ordine misto
1° ordine
Se [S] è alto, v0 è
controllata da [E]
Se [S] è intermedio, v0 è
controllata sia da [S], sia
da [E]
Se [S] è basso, v0 è
controllata da [S]
[substrato]
34
Raccomandazioni della Commission on Enzyme
Nomenclature of the International Union of Biochemistry
Attività enzimatica: quantità di substrato convertito per
minuto in condizioni standard di temperatura, pH e forza
ionica (moli/tempo)
•
•
1 katal = 1 mol/s
1 IU = 1 micromole/min
Costante catalitica o numero di turnover: attività enzimatica
per mole di enzima (moli/tempo/mole enzima)
Attività specifica di un enzima: attività enzimatica per mg di
proteina (moli/tempo/mg proteina)
•
Espressione di purezza in una preparazione
35
Equazione di Michaelis-Menten (1913)
Vmax [S]
v0 
K M  [S]
Leonor Michaelis & Maud Menten
36
Assunzioni di Michaelis-Menten
E + S  ES  E + P
1 solo substrato
Fattore limitante:
formazione di ES
Tutto E  ES
•
•
Non esiste E libero
E saturo di S
ES stazionario
37
Ipotesi v0=Vmax/2
KM = [S] quando v0=Vmax/2
E’ una concentrazione
(dimensioni moli/litro)
E’ indipendente da [E]
Vmax [S]
v0 
K M  [S ]
Vmax Vmax  [S ]

K M  [S]
2
[S]
1

2 K M  [S]
K M  [S]  2 [S]
K M  [S]
38
Rappresentazione grafica delle reazioni enzimatiche
v0
Vmax
Vmax/2
KM
[S]
39
Trasformazione di Lineweaver-Burk
Vmax [S]
v0 
K M  [S]
Y
1 K M  [S]

v0 Vmax [S]
1
KM
[S]


v0 Vmax [S] Vmax [S]
1
KM 1
1



v0 Vmax [S] Vmax
X
40
Rappresentazione grafica delle reazioni enzimatiche
1
KM 1
1



v0 Vmax [S] Vmax
1/v0
1/Vmax
1/KM
1/[S]
41
Rappresentazione grafica delle reazioni enzimatiche
Grafico di Lineweaver-Burk
V0
1/V0
Vmax
Vmax/2
1/Vmax
KM
[S]
1/KM
1/[S]
42
REGOLAZIONE DELL’ATTIVITÀ ENZIMATICA
Necessità fisiologica della regolazione dell’attività
enzimatica
Controllo del livello di enzima
Modulazione dell’attività dell’enzima
43
Il buon funzionamento della cellula richiede che le varie
attività enzimatiche siano regolate
In condizioni di stato stazionario, i processi cellulari non
funzionano mai al massimo delle loro capacità, ma possono
anche venire completamente disattivati in alcune condizioni
Ciò consente di:
•
•
•
non produrre prodotti inutili
economizzare l’energia cellulare
aumentare rapidamente l’attività quando necessario
44
Reversibilità delle reazioni enzimatiche
 L’enzima favorisce il raggiungimento dell’equilibrio, quindi in teoria
catalizza anche la reazione inversa
A  B
 Ma, se B è substrato di una reazione successiva, la prima reazione
diventa praticamente irreversibile
ABC
 Ciò vale per catene anche molto lunghe di reazioni (catene
enzimatiche)
ABCDE
 Anche se le singole reazioni enzimatiche sono reversibili (specie
quelle con G≈0), in pratica il flusso è unidirezionale perché il
prodotto di una reazione funge da substrato per la reazione
successiva
 Spesso il prodotto terminale di una sequenza di reazioni (E) inibisce
il deflusso della stessa catena a livello della prima reazione A  B
•
•
L’accumulo di E “chiude il rubinetto”
La mancanza di E “riapre il rubinetto”
ABCDE
45
Caratteristiche generali delle reazioni regolatorie
G<<0 (maggior efficacia)
Precoci nella catena enzimatica
Inibizione o regolazione da parte del prodotto finale
Gli enzimi coinvolti sono spesso multimerici
•
Capacità catalitica = (concentrazione di enzima) x (efficienza
catalitica)
46
Controllo della concentrazione di enzima
(regolazione lenta)
Regola generale: Tutte le strutture cellulari ed extracellulari (ad
eccezione dell’eritrocita umano) sono sottoposte a ricambio
ed equilibrio dinamico
Quindi, ad ogni istante, il livello di un enzima dipende da:
Velocità di sintesi della proteina
Velocità di trasformazione da zimogeno (o pro-enzima) in
enzima attivo
Velocità di degradazione
47
Velocità di sintesi
Può aumentare in seguito all’accumulo intracellulare del
substrato (es: operon del lattosio)
Può aumentare in presenza di induttori gratuiti senza
relazione col substrato
Può essere repressa dai prodotti terminali della catena
enzimatica (es: alcuni aminoacidi (His, Leu), effetto glucosio
in E.coli)
48
Chimotripsinogeno  chimotripsina
49
Attivazione degli zimogeni pancreatici mediante taglio
proteolitico
50
Funzioni biologiche della proteolisi ubiquitinadipendente
Regolazione del ciclo cellulare
•
•
Essenziale per uscire dalla fase mitotica e separare i cromosomi
durante mitosi e meiosi
Malfunzionamenti causano formazione di cellule con numero
anomalo di cromosomi (Down e tumori solidi)
Riparazione del DNA, cancro e apoptosi
•
Essenziale per mantenere il livello di p53 (il guardiano del
genoma)
Risposte immunologiche e infiammatorie
•
•
Regolazione di NF-kB (fattori di trascrizione) per attivare
l’espressione genica
Generazione di peptidi MHC (difesa contro le infezioni virali)
Fibrosi cistica
•
Coinvolta nella mutazione di CFTR (transmembrane
conductance regulator)
51
Compartimentalizzazione
Si può ottenere un forte aumento di concentrazione di molecole
compartimentalizzandole in una zona delimitata da una
membrana
52
Modulazione dell’attività dell’enzima
(regolazione veloce)
pH
Temperatura
Inibizione reversibile ed irreversibile:
•
•
•
Competitiva
Non-competitiva
Uncompetitiva
Modificazioni allosteriche
Modificazioni covalenti
53
pH e attività enzimatica
Ogni enzima ha il suo pH
ottimale
Il pH ottimale può non
corrispondere col pH in cui
si trova l’enzima
Attività
pH
54
Temperatura e attività enzimatica
Attività
Aumento dovuto alla
temperatura
(1.7-2.5 ogni 10°C)
Diminuzione
dovuta alla
denaturazione
della proteina
Risultato
0
10
20
30
40
50
Temperatura
Per ogni enzima, esiste una temperatura ottimale
La temperatura ottimale può non corrispondere con la temperatura in
cui si trova l’enzima (37°C)
55
Inibizione competitiva e non-competitiva
Non-competitiva:
Competitiva:
S e I si legano al sito attivo, Quando E lega I, cambia la
conformazione e diventa
EI è inattivo
inattivo
56
Inibizione competitiva
I simile a S, compete con S per il sito attivo di E
Inibizione reversibile all’aumentare di [S]
Vmax non cambia, KM aumenta
1/v0
v0
Vmax
 inibitore
 inibitore
Vmax/2
1/Vmax
 KM
[S]
 1/KM
1/[S]
57
Esempi di inibizione enzimatica competitiva
CH3-CH2OH
CH3OH
Metanolo
Etanolo
58
Esempi di inibizione enzimatica competitiva
Metotrexato o antifolato, antileucemico che rallenta la
biosintesi di purine e pirimidine
59
Esempi di inibizione enzimatica competitiva
Fluorouracile, analogo della mercaptopurina
60
Esempi di inibizione enzimatica competitiva
Substrati suicidi o antimetaboliti, prevengono la reazione col
substrato e/o disattivano l’enzima
Penicillina inibisce transpeptidasi che stabilizza le membrane
batteriche
61
Inibizione non competitiva
I reagisce su un sito diverso dal sito attivo
Tende a disattivare E
Inibizione non reversibile all’aumentare di [S]
KM non cambia, Vmax diminuisce
v0
1/v0
 inibitore
 inibitore
Vmax
 1/Vmax
Vmax/2
KM
[S]
1/KM
1/[S]
62
Esempi di inibizione non-competitiva
Degradazione proteica (temperatura, estremi di pH)
Molti veleni e composti mercuriali (reagiscono con -SH dei
residui di Cys)
Cianuro, reagisce con gli ioni metallici degli enzimi della
catena respiratoria
Diisopropil fluorofosfato (Sarin), gas nervino, inibisce gli
enzimi contenenti Ser (acetilcolinesterasi)
63
Inibizione uncompetitiva
I si lega al complesso ES
64
Inibizione uncompetitiva
L’inibitore reagisce con il complesso ES
Cambiamenti simultanei di KM e Vmax
1/V0
V0
+ inibitore
Vmax
+ inibitore
1/Vmax
KM
[S]
1/KM
1/[S]
65
Modificazioni covalenti degli enzimi
La fosforilazione AUMENTA l’attività di alcuni enzimi
•
Glicogeno fosforilasi, citrato liasi, fosforilasi b chinasi, HMGCoA reduttasi chinasi e altri...
La fosforilazione DIMINUISCE l’attività di altri enzimi
•
Acetil-CoA carbossilasi, glicogeno sintasi, piruvato
deidrogenasi, HMG-CoA reduttasi e altri...