Enzimi (“nel lievito”): un po` di storia
annuncio pubblicitario
1 ENZIMI Caratteristiche fondamentali della catalisi enzimatica e del meccanismo di azione degli enzimi Componenti strutturali e funzionali degli enzimi Nomenclatura e classificazione internazionale degli enzimi 2 Energia di attivazione Y si trova ad uno stato energetico inferiore rispetto a X • Conversione XY termodinamicamente favorevole Ma la reazione non avviene se X non acquisisce sufficiente energia per superare la barriera dell’energia di attivazione 3 Numero di molecole Distribuzione delle molecole a vari livelli di energia Energia di attivazione Molecole con energia maggiore dell’energia di attivazione Energia Aumento di temperatura Presenza di un catalizzatore 4 Energia A Energia di attivazione Energia di attivazione senza catalizzatore Stato iniziale P Stato finale Energia di attivazione con catalizzatore Energia liberata dalla reazione 5 Enzimi: catalizzatori biologici Si combinano transientemente col substrato e ne abbassano l’energia di attivazione Non modificano l’equilibrio della reazione, ma solo la velocità con la quale l’equilibrio viene raggiunto Non vengono modificati nella reazione, e al termine della reazione sono subito disponibili per catalizzare una nuova reazione Stabilizzano lo stato di transizione e riducono la barriera dell’energia di attivazione inserendo stati di transizione di livello energetico più basso 6 DNA RNA ribosomi Struttura generale degli enzimi Zimogeno (precursore) Substrato Apoenzima Prodotto Sito attivo ENZIMA ATTIVO Ubiquitina Lisosomi degradazione Parte non-proteica ione metallico o coenzima Sito allosterico Effettore allosterico 7 Nomenclatura degli enzimi Denominazione classica costituita da 3 parti: • • • Nome del substrato Nome del coenzima Nome della reazione catalizzata + “asi” Esempio: Lattico-NAD-deidrogenasi International Enzyme Commission, fondata nel 1956 da Prof. M. Florkin, International Union of Biochemistry: • Classificazione degli enzimi secondo il sistema delle classi EC Esempi: Creatin kinasi: EC 2.7.3.2, adenosintrifosfato : creatin N-fosfo trasferasi Lattato deidrogenasi: EC 1.1.1.27, lattato : NAD+ ossidoreduttasi • Ha funzionato bene fino agli anni ‘90 (circa 3200 enzimi) • Esistono circa 20,000 geni, di cui almeno 1/4-1/3 sono enzimi Progetto genoma umano (HUGO): 8 Classificazione internazionale degli enzimi 1 - ossidoreduttasi: reazioni di ossido-riduzione • • • • • • • • • 1.1 agisce sul gruppo CHOH del donatore 1.2 agisce sul gruppo aldeidico o chetonico del donatore 1.3 agisce sul gruppo CH-CH del donatore 1.4 agisce sul gruppo CH-NH2 del donatore 1.5 agisce sul gruppo C-NH del donatore 1.6 agisce su NADH2 o NADPH2 1.7 agisce su altri composti azotati 1.8 agisce su gruppi solforati 1.9 agisce sui gruppi eme 9 Classificazione internazionale degli enzimi 1 - ossidoreduttasi: reazioni di ossido-riduzione 2 - transferasi: trasferimento di gruppi chimici da una molecola ad un'altra • • • • • • • • 2.1 gruppi ad una unità di carbonio 2.2 gruppi chetonici o aldeidici 2.3 gruppi acilici 2.4 gruppi glicosidici 2.5 gruppi alchilici 2.6 gruppi azotati 2.7 gruppi fosforici 2.8 gruppi contenenti zolfo 10 Classificazione internazionale degli enzimi 1 - ossidoreduttasi: reazioni di ossido-riduzione 2 - transferasi: trasferimento di gruppi chimici da una molecola ad un'altra 3 - idrolasi: reazioni di idrolisi • • • • • • • 3.1 legami esterei 3.2 legami glicosidici 3.3 altri legami 3.4 legami peptidici 3.5 legami C-N non peptidici 3.6 legami anidridici 3.7 legami C-C 11 Classificazione internazionale degli enzimi 1 - ossidoreduttasi: reazioni di ossido-riduzione 2 - transferasi: trasferimento di gruppi chimici da una molecola ad un'altra 3 - idrolasi: reazioni di idrolisi 4 - liasi: reazioni di addizione a doppi legami • • • • 4.1 legami C = C 4.2 legami C = O 4.3 legami C = N 4.4 legami C = S 12 Classificazione internazionale degli enzimi 1 - ossidoreduttasi: reazioni di ossido-riduzione 2 - transferasi: trasferimento di gruppi chimici da una molecola ad un'altra 3 - idrolasi: reazioni di idrolisi 4 - liasi: reazioni di addizione a doppi legami 5 - isomerasi: reazioni di trasformazione di una molecola nel suo isomero • • 5.1 racemasi 5.2 cis-trans isomerasi 13 Classificazione internazionale degli enzimi 1 - ossidoreduttasi: reazioni di ossido-riduzione 2 - transferasi: trasferimento di gruppi chimici da una molecola ad un'altra 3 - idrolasi: reazioni di idrolisi 4 - liasi: reazioni di addizione a doppi legami 5 - isomerasi: reazioni di trasformazione di una molecola nel suo isomero 6 - ligasi: reazioni di formazione di nuovi legami con rottura di ATP in AMP e pirofosfato o ADP e Pi • • • • 6.1 legami C-O 6.2 legami C-S 6.3 legami C-N 6.4 legami C-C 14 Classificazione internazionale degli enzimi 1 - ossidoreduttasi: reazioni di ossido-riduzione 2 - transferasi: trasferimento di gruppi chimici da una molecola ad un'altra 3 - idrolasi: reazioni di idrolisi 4 - liasi: reazioni di addizione a doppi legami 5 - isomerasi: reazioni di trasformazione di una molecola nel suo isomero 6 - ligasi: reazioni di formazione di nuovi legami con rottura di ATP in AMP e pirofosfato o ADP e Pi 15 Struttura primaria e mutazioni genetiche Tutte le funzioni delle proteine necessitano del riconoscimento fra zone della proteina e altre molecole o parti di molecola: • Enzima-substrato, molecole di adesione-membrane, anticorpoantigene etc Il riconoscimento è basato sulla distribuzione dei gruppi R e quindi sulla sequenza degli aminoacidi • La zona di riconoscimento e la molecola da riconoscere devono essere complementari in termini di struttura e di carica Ogni alterazione della struttura primaria può impedire il riconoscimento o renderlo difficile, causando disfunzioni più o meno gravi • • Se ne deriva uno stato patologico, quella mutazione interessa la zona di riconoscimento Se la mutazione è silente (non genera malattie o disfunzioni), è possibile che l'aminoacido mutato non è nella zona di riconoscimento 16 Modello Lock and Key: l’enzima si combina chimicamente col substrato Il sito attivo è costituito dal “negativo” del substrato • Si formano legami ionici e elettrostatici esatti fra enzima e substrato Riconoscimento spesso tridimensionale • • Esempio: glicerol kinasi (lega solo glicerolo in forma alfa) Gli enzimi possono distinguere gli stereoisomeri D-e L- degli aminoacidi Il legame enzima-substrato avviene tramite l’interazione delle cariche del substrato con alcuni aminoacidi del sito attivo Esempio: proteasi a serina Modifiche della struttura primaria di un enzima possono mutarne l’attività causando malattie genetiche 17 18 Il legame enzima-substrato induce un cambiamento conformazionale nell’enzima Esempio: esochinasi senza e con glucosio 19 Coenzimi Piccole molecole organiche, spesso derivate da vitamine Si legano con forte affinità a enzima e substrato Spesso fungono da secondo substrato Determinano la specificità della reazione catalizzata 20 Adenosin trifosfato (ATP) Coenzima delle chinasi, trasferisce un gruppo Pi al substrato Esempio: Glucosio + ATP Glucosio-6-fosfato + ADP In molte chinasi, il substrato vero è Mg-ATP 21 Nicotinamide Adenina Dinucleotide (NAD+) Coenzima di deidrogenasi Derivato da niacina Trasferisce un protone da/a substrati: lattato + NAD+ piruvato + NADH + H+ Esiste una forma fosforilata NADP+ 22 Flavina adenina dinucleotide (FAD) Coenzima di deidrogenasi Derivato da riboflavina (vit. B6) Trasferisce due protoni da/a substrati Esempio: Succinato + FAD Fumarato + FADH2 23 Coenzima A Trasportatore e attivatore di gruppi acilici (acidi grassi) e di acetato 24 Metalli di transizione (Fe, Zn, Cu, Mn…) Cofattori più che coenzimi Presenti in 2/3 degli enzimi Agiscono come stabilizzatori della proteina e come donatori/accettori di elettroni (acidi di Lewis), per esempio i citocromi 25 Di tutte le reazioni possibili per un substrato, l’enzima ne favorisce una sola Gli enzimi forzano le vie metaboliche attraverso reazioni selezionate (ad es: A > B > H > K > N > T > Z) favorendo il flusso unidirezionale di materiale 26 CINETICHE CHIMICHE E ENZIMATICHE Studio della velocità di trasformazione dei reagenti in prodotti Effetto della concentrazione di reagente Ordine di una reazione 27 Cinetiche chimiche (AP) Concentrazione di prodotto Vt Equilibrio V iniziale d[A] d[P] n k[A] velocità v dt dt k=costante di velocità n=numero intero 1-3 Tempo 28 Cinetiche chimiche (A P) Conc. di prodotto Conc. di substrato Velocità V iniziale V finale Tempo Tempo Tempo 29 Effetto della concentrazione di A (A P) A4 > A3 > A2 > A1 [prodotto] Velocità iniziale A4 A3 A2 A1 Tempo A1 A2 A3 A4 [A] 30 Cinetiche chimiche vs cinetiche enzimatiche Velocità iniziale Cinetica enzimatica Cinetica chimica [A] 31 Ordine di reazione Primo ordine AP v=k[A]1, n=1 Secondo ordine Pseudo primo ordine Ordine zero A+BP v=k[A]1[B]1, n=2 A+BP v=k[A]1[B]1, n=2 ma se [B]»[A], v=k[A]1, n=1 v=k, n=0 v dipende solo dalla concentrazione del catalizzatore 32 Ipotesi per l’azione degli enzimi N.B.: [S] >> [E] E + S ES EP E + P L’enzima si lega col substrato per formare ES: reazione reversibile e relativamente lenta Il complesso ES subisce il cambiamento conformazionale che induce la formazione di P L’enzima rilascia P e torna nello stato iniziale La velocità globale è regolata dalla formazione di ES 33 Interazione enzima-substrato v0 Se [S] è molto alto, v0 non cambia all’aumentare di [S] Vmax Ordine 0 Ordine misto 1° ordine Se [S] è alto, v0 è controllata da [E] Se [S] è intermedio, v0 è controllata sia da [S], sia da [E] Se [S] è basso, v0 è controllata da [S] [substrato] 34 Raccomandazioni della Commission on Enzyme Nomenclature of the International Union of Biochemistry Attività enzimatica: quantità di substrato convertito per minuto in condizioni standard di temperatura, pH e forza ionica (moli/tempo) • • 1 katal = 1 mol/s 1 IU = 1 micromole/min Costante catalitica o numero di turnover: attività enzimatica per mole di enzima (moli/tempo/mole enzima) Attività specifica di un enzima: attività enzimatica per mg di proteina (moli/tempo/mg proteina) • Espressione di purezza in una preparazione 35 Equazione di Michaelis-Menten (1913) Vmax [S] v0 K M [S] Leonor Michaelis & Maud Menten 36 Assunzioni di Michaelis-Menten E + S ES E + P 1 solo substrato Fattore limitante: formazione di ES Tutto E ES • • Non esiste E libero E saturo di S ES stazionario 37 Ipotesi v0=Vmax/2 KM = [S] quando v0=Vmax/2 E’ una concentrazione (dimensioni moli/litro) E’ indipendente da [E] Vmax [S] v0 K M [S ] Vmax Vmax [S ] K M [S] 2 [S] 1 2 K M [S] K M [S] 2 [S] K M [S] 38 Rappresentazione grafica delle reazioni enzimatiche v0 Vmax Vmax/2 KM [S] 39 Trasformazione di Lineweaver-Burk Vmax [S] v0 K M [S] Y 1 K M [S] v0 Vmax [S] 1 KM [S] v0 Vmax [S] Vmax [S] 1 KM 1 1 v0 Vmax [S] Vmax X 40 Rappresentazione grafica delle reazioni enzimatiche 1 KM 1 1 v0 Vmax [S] Vmax 1/v0 1/Vmax 1/KM 1/[S] 41 Rappresentazione grafica delle reazioni enzimatiche Grafico di Lineweaver-Burk V0 1/V0 Vmax Vmax/2 1/Vmax KM [S] 1/KM 1/[S] 42 REGOLAZIONE DELL’ATTIVITÀ ENZIMATICA Necessità fisiologica della regolazione dell’attività enzimatica Controllo del livello di enzima Modulazione dell’attività dell’enzima 43 Il buon funzionamento della cellula richiede che le varie attività enzimatiche siano regolate In condizioni di stato stazionario, i processi cellulari non funzionano mai al massimo delle loro capacità, ma possono anche venire completamente disattivati in alcune condizioni Ciò consente di: • • • non produrre prodotti inutili economizzare l’energia cellulare aumentare rapidamente l’attività quando necessario 44 Reversibilità delle reazioni enzimatiche L’enzima favorisce il raggiungimento dell’equilibrio, quindi in teoria catalizza anche la reazione inversa A B Ma, se B è substrato di una reazione successiva, la prima reazione diventa praticamente irreversibile ABC Ciò vale per catene anche molto lunghe di reazioni (catene enzimatiche) ABCDE Anche se le singole reazioni enzimatiche sono reversibili (specie quelle con G≈0), in pratica il flusso è unidirezionale perché il prodotto di una reazione funge da substrato per la reazione successiva Spesso il prodotto terminale di una sequenza di reazioni (E) inibisce il deflusso della stessa catena a livello della prima reazione A B • • L’accumulo di E “chiude il rubinetto” La mancanza di E “riapre il rubinetto” ABCDE 45 Caratteristiche generali delle reazioni regolatorie G<<0 (maggior efficacia) Precoci nella catena enzimatica Inibizione o regolazione da parte del prodotto finale Gli enzimi coinvolti sono spesso multimerici • Capacità catalitica = (concentrazione di enzima) x (efficienza catalitica) 46 Controllo della concentrazione di enzima (regolazione lenta) Regola generale: Tutte le strutture cellulari ed extracellulari (ad eccezione dell’eritrocita umano) sono sottoposte a ricambio ed equilibrio dinamico Quindi, ad ogni istante, il livello di un enzima dipende da: Velocità di sintesi della proteina Velocità di trasformazione da zimogeno (o pro-enzima) in enzima attivo Velocità di degradazione 47 Velocità di sintesi Può aumentare in seguito all’accumulo intracellulare del substrato (es: operon del lattosio) Può aumentare in presenza di induttori gratuiti senza relazione col substrato Può essere repressa dai prodotti terminali della catena enzimatica (es: alcuni aminoacidi (His, Leu), effetto glucosio in E.coli) 48 Chimotripsinogeno chimotripsina 49 Attivazione degli zimogeni pancreatici mediante taglio proteolitico 50 Funzioni biologiche della proteolisi ubiquitinadipendente Regolazione del ciclo cellulare • • Essenziale per uscire dalla fase mitotica e separare i cromosomi durante mitosi e meiosi Malfunzionamenti causano formazione di cellule con numero anomalo di cromosomi (Down e tumori solidi) Riparazione del DNA, cancro e apoptosi • Essenziale per mantenere il livello di p53 (il guardiano del genoma) Risposte immunologiche e infiammatorie • • Regolazione di NF-kB (fattori di trascrizione) per attivare l’espressione genica Generazione di peptidi MHC (difesa contro le infezioni virali) Fibrosi cistica • Coinvolta nella mutazione di CFTR (transmembrane conductance regulator) 51 Compartimentalizzazione Si può ottenere un forte aumento di concentrazione di molecole compartimentalizzandole in una zona delimitata da una membrana 52 Modulazione dell’attività dell’enzima (regolazione veloce) pH Temperatura Inibizione reversibile ed irreversibile: • • • Competitiva Non-competitiva Uncompetitiva Modificazioni allosteriche Modificazioni covalenti 53 pH e attività enzimatica Ogni enzima ha il suo pH ottimale Il pH ottimale può non corrispondere col pH in cui si trova l’enzima Attività pH 54 Temperatura e attività enzimatica Attività Aumento dovuto alla temperatura (1.7-2.5 ogni 10°C) Diminuzione dovuta alla denaturazione della proteina Risultato 0 10 20 30 40 50 Temperatura Per ogni enzima, esiste una temperatura ottimale La temperatura ottimale può non corrispondere con la temperatura in cui si trova l’enzima (37°C) 55 Inibizione competitiva e non-competitiva Non-competitiva: Competitiva: S e I si legano al sito attivo, Quando E lega I, cambia la conformazione e diventa EI è inattivo inattivo 56 Inibizione competitiva I simile a S, compete con S per il sito attivo di E Inibizione reversibile all’aumentare di [S] Vmax non cambia, KM aumenta 1/v0 v0 Vmax inibitore inibitore Vmax/2 1/Vmax KM [S] 1/KM 1/[S] 57 Esempi di inibizione enzimatica competitiva CH3-CH2OH CH3OH Metanolo Etanolo 58 Esempi di inibizione enzimatica competitiva Metotrexato o antifolato, antileucemico che rallenta la biosintesi di purine e pirimidine 59 Esempi di inibizione enzimatica competitiva Fluorouracile, analogo della mercaptopurina 60 Esempi di inibizione enzimatica competitiva Substrati suicidi o antimetaboliti, prevengono la reazione col substrato e/o disattivano l’enzima Penicillina inibisce transpeptidasi che stabilizza le membrane batteriche 61 Inibizione non competitiva I reagisce su un sito diverso dal sito attivo Tende a disattivare E Inibizione non reversibile all’aumentare di [S] KM non cambia, Vmax diminuisce v0 1/v0 inibitore inibitore Vmax 1/Vmax Vmax/2 KM [S] 1/KM 1/[S] 62 Esempi di inibizione non-competitiva Degradazione proteica (temperatura, estremi di pH) Molti veleni e composti mercuriali (reagiscono con -SH dei residui di Cys) Cianuro, reagisce con gli ioni metallici degli enzimi della catena respiratoria Diisopropil fluorofosfato (Sarin), gas nervino, inibisce gli enzimi contenenti Ser (acetilcolinesterasi) 63 Inibizione uncompetitiva I si lega al complesso ES 64 Inibizione uncompetitiva L’inibitore reagisce con il complesso ES Cambiamenti simultanei di KM e Vmax 1/V0 V0 + inibitore Vmax + inibitore 1/Vmax KM [S] 1/KM 1/[S] 65 Modificazioni covalenti degli enzimi La fosforilazione AUMENTA l’attività di alcuni enzimi • Glicogeno fosforilasi, citrato liasi, fosforilasi b chinasi, HMGCoA reduttasi chinasi e altri... La fosforilazione DIMINUISCE l’attività di altri enzimi • Acetil-CoA carbossilasi, glicogeno sintasi, piruvato deidrogenasi, HMG-CoA reduttasi e altri...
