allegato

Large Animals Review, Anno 4, n. 1, Marzo 1998
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SUL SIGNIFICATO DIAGNOSTICO
DELLE ALTERAZIONI SPONGIFORMI
ENCEFALICHE NEI BOVINI
F. GUARDA, M.T. CAPUCCHIO, M.C. ISAIA
Centro di Patologia Comparata Bruno Maria Zaini del Dipartimento di Patologia Animale, Facoltà di Medicina Veterinaria,
Università degli Studi di Torino, Via Nizza 52, Torino
Riassunto
Gli Autori, esaminando encefali di bovini per lo più clinicamente sani e regolarmente macellati, discutono sul significato diagnostico delle alterazioni spongiformi encefaliche. In base ai riferimenti bibliografici e alle loro esperienze personali essi giungono alla conclusione che il riscontro di vacuoli nei neuroni o nel neuropilo non è elemento sufficiente per porre diagnosi di
BSE o di malattia Scrapie-like, ma è necessaria la presenza di più lesioni istologiche associate ai sintomi clinici neurologici
nell'animale.
Summary
The Authors describe the neuronal vacuolisation observed in the brains of slaughtered cattle. According to litterature and
their personal experience spongiosis of the grey matter is not diagnostic for BSE or Scrapie-like diseases, but it is necessary
to observe both the neurological signs and the pathognomonic lesions in the brain.
Le malattie neurodegenerative costituiscono un complesso capitolo della neuropatologia in continua espansione. Possono essere classificate in 5 gruppi principali
(Guarda e Valenza 1991):
1- metaboliche e circolatorie
2- tossiche
3- nutrizionali
4- ereditarie, familiari e idiopatiche
5- trasmissibili
Tutte queste forme differiscono fra loro per tipo e topografia delle lesioni, ma sono caratterizzate da alcuni elementi comuni quali degenerazione selettiva simmetrica e
progressiva del sistema neuronale e/o della sostanza bianca. Le encefalopatie trasmissibili attualmente costituiscono
il sottogruppo che riveste il maggiore interesse nella patologia comparata. La Scrapie, nota in Europa sin dal 1732
(Mc Gowan 1922), ne è il prototipo. Queste patologie
neurodegenerative hanno risvegliato l'interesse dei ricercatori soprattutto negli ultimi 50 anni, in quanto malattie
Scrapie-like sono state descritte in numerose specie animali e nell'uomo. Infatti la recente evidenziazione della encefalopatia spongiforme bovina (BSE), la segnalazione di
forme clinicamente e patologicamente sovrapponibili in
bovidi selvatici e felidi e ancora più recentemente l'identificazione di una forma di CJD atipica, i cui caratteri lasce-
rebbero supporre una possibile correlazione con la BSE,
hanno contribuito a incrementare notevolmente le ricerche sulle malattie da prioni.
L'encefalopatia spongiforme bovina (BSE) è una malattia infettiva non contagiosa, con un'incubazione variabile
da tre a cinque anni. La sintomatologia neurologica consiste generalmente in alterazioni comportamentali (apprensione, nervosismo, aggressività), anormalità della postura e
del movimento, atassia, perdita di peso, diminuzione della
produzione lattea. Il decorso clinico può variare da poche
settimane a più di un anno conducendo inesorabilmente
l'animale alla morte. La diagnosi si basa sull'osservazione
di preparati istologici del tronco encefalico caudale, in cui
vengono considerati i seguenti elementi: vacuolizzazione
generalmente bilaterale dei neuroni e del neuropilo; astrocitosi e/o astrogliosi; degenerazione neuronale e talora
necrosi dei neuroni; depositi di sostanza amiloide in forma
diffusa o a placche, reperto incostante, (Kimberlin 1992).
Nei casi clinicamente manifesti la presenza delle alterazioni spongiformi nel nucleo dorsale del vago, nel nucleo del
tratto spinale del trigemino, nei nuclei vestibolari, nel tratto solitario e nella formazione reticolare è sufficiente per
diagnosticare la BSE. Bisogna tener presente che le vacuolizzazioni dei pericari neuronali di determinati nuclei
encefalici (nucleo rosso, nucleo oculomotore, nucleo abenulare del talamo, sostanza reticolare) sono spesso rilevabili in bovini clinicamente sani. In particolare più del 50%
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Sul significato diagnostico delle alterazioni spongiformi encefaliche nei bovini
dei soggetti normali presenta vacuoli a livello del nucleo
rosso di cui non si conosce il significato (Fankhauser et al.,
1971, Kimberlin, 1992; Guarda e Fatzer, 1995). Altri autori inoltre (Wells e Wells, 1989) hanno sperimentalmente
riprodotto nel bovino la vacuolizzazione del neuropilo
modificando le procedure nel corso dell'inclusione in
paraffina, dimostrando in tal modo come un artefatto tecnico possa esser confuso con una lesione patologica. La
conferma diagnostica richiede pertanto l'ausilio di particolari tecniche di laboratorio che consentono l'identificazione della PrP patologica (PrPsc) o dei suoi aggregati fibrillari (SAF Scrapie Associated Fibrils). L'evidenziazione
della PrPsc viene eseguita sia con l'immunoistochimica, sia
con il western blot mediante anticorpi policlonali o monoclonali. Quest'ultimo esame deve esser eseguito utilizzando materiale fresco o congelato. L'identificazione delle
SAF al microscopio elettronico a trasmissione (MET)
richiede la loro estrazione e purificazione partendo da una
sospensione di tessuto nervoso.
È noto che la sintomatologia clinica è in relazione con
le alterazioni spongiformi, però non si conosce con esattezza il momento in cui compaiono le prime vacuolizzazioni; bovini clinicamente sani potrebbero pertanto essere dei
soggetti con la BSE in incubazione. Essendo impossibile
diagnosticare questa malattia sull'animale in vita, in assenza di sintomi clinici, è possibile che tali animali vengano
regolarmente macellati, entrino nel circuito alimentare
umano e rappresentino un possibile rischio per la salute
pubblica. Nel Regno Unito, infatti, Anderson e coll.
(1996) hanno dimostrato che dal 1974 al 1995 almeno
903.000 bovini sono stati infettati dalla BSE e circa
729.000 sono entrati nella catena alimentare umana. Al
fine di portare un contributo alla migliore conoscenza di
queste problematiche, cioè sulla presenza e sul significato
diagnostico delle alterazioni spongiformi del SNC di bovini clinicamente sani e regolarmente macellati, desideriamo
rendere noti i risultati raccolti in una nostra recente ricerca.
ra, erano le madri di vitelloni di origine italiana le cui carni
erano lavorate industrialmente per ricavarne prodotti finiti
per l'alimentazione umana. Immediatamente dopo l'abbattimento venivano prelevati gli encefali o per lo meno il tronco encefalico caudale e fissati in formalina al 10% in idonei
contenitori di plastica e spediti al nostro laboratorio. Le
indagini istopatologiche erano eseguite secondo lo schema
consigliato dal laboratorio di Weybridge per la ricerca delle
lesioni da BSE; veniva cioè effettuata la colorazione classica
Ematossilina-eosina cui seguiva l'osservazione del preparato
al microscopio ottico. Il riscontro di lesioni istologiche analoghe a quelle tipiche della BSE rendeva necessaria l'esecuzione della prova immunoistochimica mediante uso di un
anticorpo policlonale.
RISULTATI
I risultati ottenuti sono schematizzati nella seguente
tabella, in cui gli encefali suddivisi per anno sono stati
classificati in base all'età ed alle lesioni spongiformi riscontrate.
1995
LESIONI ISTOLOGICHE
ETÀ
meno di 1 anno
vacuoli neuronali
ponte
bulbo
Durante gli ultimi tre anni sono stati esaminati rispettivamente 42 encefali bovini nel 1995, 543 nel 1996 e 20 nel
1997 (29-7-1997). Gli encefali esaminati possono venire
così suddivisi:
ETÀ
2
spongiosi neuropilo
vacuoli neuroni nucleo rosso
3
1996
LESIONI ISTOLOGICHE
ETÀ
18-22 mesi
più di 22 mesi
vacuoli neuronali
ponte
bulbo
mesencefalo
35
16
1
5
1
spongiosi neuropilo
6
gliosi
2
vacuoli neuroni
nucleo rosso
1
238
ANNI
meno di 1 anno
18-22 mesi
più di 22 mesi
1995
8
3
31
1997
1996
36
422
85
LESIONI ISTOLOGICHE
1997
3
14
3
ETÀ
meno di 1 anno
La maggior parte degli encefali esaminati nel 1996 rientrano nell'ambito di due convenzioni stipulate con industrie
private e precisamente 387 SNC di vitelloni e 4 SNC di vacche, animali tutti regolarmente macellati in due stabilimenti
di macellazione del Nord Italia. I vitelloni erano in parte
importati dalla Francia in tenera età ed allevati in aziende
italiane. Le bovine di circa 5-7 anni, macellate a fine carrie-
più di 22 mesi
1
meno di 1 anno
OSSERVAZIONI PERSONALI
18-22 mesi
18-22 mesi
vacuoli neuronali
bulbo
ponte
spongiosi neuropilo
vacuoli neuroni
nucleo rosso
3
12
più di 22 mesi
Large Animals Review, Anno 4, n. 1, Marzo 1998
Complessivamente il profilo istolesivo si è rivelato
uniforme in tutti i preparati. Non si è apprezzata in quasi
nessun preparato l'associazione di più lesioni istologiche
ovvero di vacuolizzazioni in neuroni con spongiosi del
neuropilo e astrocitosi, elemento che permette pertanto di
escludere la diagnosi di malattia BSE-like. La presenza di
vacuoli neuronali è nettamente superiore rispetto a quella
di vacuoli nel neuropilo ed è limitata ad un solo neurone o
al massimo a due, localizzati comunque sempre in nuclei
del ponte o, meno frequentemente, del midollo allungato.
I vacuoli neuronali possono essere rotondeggianti o ovoidali; piccoli, medi (Figg. 1, 2, 3) o anche molto grandi
tanto da occupare la maggior parte del citoplasma, che
appare ridotto ad una esile linea di demarcazione cellulare
(Figg. 4, 5). In alcuni casi si sono osservati vacuoli multipli
in numero variabile (Figg. 6, 7, 8, 9) tanto da far assumere
al neurone un aspetto "schiumoso" poiché il citoplasma è
ridotto a sottili sepimenti (Figg. 10, 11, 12, 13). In alcuni
bovini la spongiosi nel neuropilo è presente senza altre
lesioni pur essendo molto limitata, simmetrica e localizzata
in ponte e mesencefalo (Fig. 14). In un solo caso la vacuolizzazione in un pericario neuronale è associata alla presenza di vacuoli lungo l'assone di un secondo neurone
(Figg. 18, 19).
In un solo bovino è stato osservato un isolato focolaio di
gliosi (Fig. 17) e in un altro, oltre alla vacuolizzazione in
un neurone, si è potuta evidenziare un'area di infiltrazione
flogistica perivascolare con proliferazione della glia, lesioni
di verosimile eziologia virale (Figg. 15, 16).
Per quanto riguarda le vacuolizzazioni neuronali del
nucleo rosso (Figg. 20, 21) queste sono state riscontrate
molto frequentemente nella nostra indagine, precisamente
nel 54,89% dei soggetti di età compresa tra i 18 e i 22
mesi e nel 12,6% dei bovini di età adulta. Tali vacuolizzazioni sono per lo più simmetriche, colpiscono più neuroni
e morfologicamente non differiscono per nulla da quelle
osservate nel tronco encefalico caudale. La singolare differenza riscontrata in termini percentuali tra i vitelloni e i
bovini adulti, merita di essere sottolineata, anche se al
momento non abbiamo elementi per giustificarla. Analoga
considerazione deve essere fatta per i vacuoli nei neuroni
della formazione reticolare (circa 50%) ritenuti anch'essi
un reperto non patologico, ma di significato ancora sconosciuto.
CONSIDERAZIONI E CONCLUSIONI
Come sopraccitato, nell'ambito della neuropatologia
comparata sono note numerose forme di degenerazione
spongiforme del sistema nervoso centrale sia congenite
sia acquisite a differente eziologia, ereditarie, tossiche,
metaboliche ed infettive. Il significato delle vacuolizzazioni dei neuroni e del neuropilo nelle encefalopatie
spongiformi trasmissibili degli animali con particolare
riferimento alla BSE è comunque quello che ci interessa
più direttamente. Se nella Scrapie naturale la vacuolizzazione neuronale è la lesione principale, nella BSE è la
spongiosi del neuropilo a rappresentare l'elemento di
primaria importanza in un preparato istologico
(Kimberlin, 1992). Wells e coll. (1989), esaminando 684
bovini con BSE clinicamente sospetta, confermarono
11
istopatologicamente la diagnosi in 563 casi. In 20 soggetti la diagnosi risultò inconclusiva. Si trattava infatti di
bovini i cui encefali presentavano lesioni qualitativamente simili alla BSE, ma di estensione molto limitata. I
rimanenti 101 animali, pur presentando sintomatologia
nervosa, non hanno mostrato lesioni istologiche riferibili
a BSE. Di notevole importanza diagnostica per la BSE
sono state le ricerche di Simmons e coll. (1996) i quali,
con indagini neuroistopatologiche eseguite sui casi
sospetti di BSE confrontarono 2600 animali esaminati
negli anni 1992-1994 con un gruppo simile del periodo
1987-1989. Da tali ricerche risultarono non confermati
334 casi cioè circa il 12%, mentre si potè appurare l'esistenza di un profilo istolesivo piuttosto fisso dall'inizio
dell'epidemia, sostenuta verosimilmente da un unico
ceppo di agente non convenzionale. È interessante notare come in 4 bovini, in cui gli stessi AA. avevano osservato lesioni BSE-simili nelle aree rostrali dell'obex, due
ricercatori estranei al gruppo di lavoro di Simmons si
trovarono pienamente in accordo nell'affermare la negatività dell'obex valutando le lesioni secondo i criteri diagnostici attuati dal laboratorio di Weybridge. Quindi,
sempre Simmons e coll., ammettono che gli esami istopatologici non permettono di rilevare nessuna forma atipica
di BSE e che quando la vacuolizzazione dei neuroni è
ristretta a uno o due vacuoli è ragionevole supporre che
si tratti di un reperto non specifico e normale. Analoghe
considerazioni sono state fatte da Guarda e Fatzer (1995)
che esaminando 359 bovini di età compresa tra i 2 e i 10
anni, regolarmente macellati, riscontrarono nell'11,5%
dei casi la presenza di vacuoli nei neuroni del nucleo
rosso e più raramente vacuoli nel midollo allungato e nel
ponte di Varolio, considerandoli aspecifici.
Non va comunque dimenticato che sono stati osservati
in numerose specie animali vacuoli neuronali definiti aspecifici il cui significato è ancora da definire, ad esempio
Pumarola e coll. (1995) hanno segnalato la presenza di
vacuoli nei neuroni del nucleo del trigemino in un cane,
Zlotnik e Rennie (1958) in pecore sane, mentre Wells e
McGill (1992) hanno descritto vacuoli aspecifici nel gatto
e nel suino. Per quanto riguarda l'interpretazione delle
alterazioni spongiformi da noi riscontrate nei bovini regolarmente macellati, secondo i criteri diagnostici attualmente in uso, si devono considerare non patologici o per lo
meno non riferibili a malattia BSE-like. Quanto detto può
essere giustificato come segue:
• clinicamente: in nessun bovino era presente la sintomatologia classica della BSE;
• istopatologicamente: la vacuolizzazione neuronale non
è bilaterale, interessa singoli neuroni; non è accompagnata,
se non raramente, da spongiosi del neuropilo né da astrocitosi; soltanto uno o due neuroni di un unico nucleo nel
ponte o nel bulbo presentano la vacuolizzazione, mentre le
altre aree neuroanatomiche normalmente sede di lesioni
nei casi di BSE, sono negative;
• a conferma di quanto esposto più sopra l'immunoistochimica, eseguita con un anticorpo policlonale specifico
per un peptide sintetico derivato dall PrP bovina (Graber
e coll. 1995), è stata sempre negativa escluso un caso nel
quale la reazione è stata interpretata come dubbia, per la
presenza di rare e fini tracce di PrPsc, da un laboratorio
estero, mentre da altri due laboratori nazionali è stata con-
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Sul significato diagnostico delle alterazioni spongiformi encefaliche nei bovini
FIGURA 1 - Vitellone, ponte: piccolo vacuolo neuronale nel nucleo dorsale del corpo trapezoide (E-E, medio ingrandimento).
FIGURA 2 - Vitellone, ponte: vacuolo neuronale di medie dimensioni
nella formazione reticolare (E-E, medio ingrandimento).
FIGURA 3 - Vitellone, bulbo: vacuolo neuronale di medie dimensioni nel
nucleo parasimpatico del nervo vago (E-E, medio ingrandimento).
FIGURA 4 - Vitellone, ponte: vacuolo di grandi dimensioni in un neurone della formazione reticolare (E-E, medio ingrandimento).
FIGURA 5 - Vitellone, ponte: vacuolo di grandi dimensioni in un neurone della formazione reticolare (E - E, medio ingrandimento).
FIGURA 6 - Vitellone, bulbo: vacuoli in un neurone del nucleo intercalato (E-E, medio ingrandimento).
siderata negativa.
Possiamo comunque affermare che, poiché, non è ancora conosciuto il momento nel quale inizia la formazione
delle vacuolizzazioni durante il periodo di incubazione, la
presenza di uno o più vacuoli neuronali non consente di
emettere un sospetto di BSE. È tuttavia stato rilevato che,
con la trasmissione sperimentale della BSE da bovino a
bovino, non sono evidenti vacuolizzazioni neuronali da 2 a
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FIGURA 7 - Vitellone, ponte: vacuolo duplice in un neurone della formazione reticolare (E - E , medio ingrandimento).
FIGURA 8 - Vitellone, ponte: vacuoli multipli in un neurone della formazione reticolare (E - E, medio ingrandimento).
FIGURA 9 - Vitellone, bulbo: vacuoli multipli in un neurone della formazione reticolare (E - E, medio ingrandimento).
FIGURA 10 - Vitellone, ponte: vacuoli multipli in un neurone del nucleo
vestibolare caudale (E - E, medio ingrandimento).
FIGURA 11 - Vitellone, ponte: vacuoli multipli in un neurone della formazione reticolare (E - E, medio ingrandimento).
FIGURA 12 - Vitellone, ponte: vacuoli multipli in un neurone della formazione reticolare (E - E, medio ingrandimento).
26 mesi dopo l'inoculo; dopo 32 mesi compaiono i primi
vacuoli nei neuroni dei nuclei vestibolari del ponte e soltanto dopo 36 mesi, in concomitanza con l'insorgenza dei
primi segni clinici, le lesioni spongiformi diventano gene-
ralizzate ( Wells e coll. 1996). Bisogna dunque applicare in
ogni caso i criteri adottati nel Regno Unito dal laboratorio
di Weybridge secondo regole ormai ben definite. Nei casi
oggetto del presente lavoro, esaminati utilizzando i criteri
14
Sul significato diagnostico delle alterazioni spongiformi encefaliche nei bovini
FIGURA 13 - Bovina adulta, ponte: vacuoli multipli in un neurone della
formazione reticolare (E - E, medio ingrandimento).
FIGURA 14. - Vitellone, ponte: spongiosi del neuropilo in corrispondenza del tratto spino-cerebellare ventrale (E - E, medio ingrandimento).
FIGURA 15 - Vitellone, ponte: vacuolo in un neurone della formazione
reticolare (E - E, medio ingrandimento).
FIGURA 16 - Vitellone (stesso animale della Figura n° 15), ponte: un
focolaio di perivasculite non purulenta con gliosi in prossimità del
nucleo vestibolare mediano (E - E, medio ingrandimento).
FIGURA 17 - Vitellone, bulbo: un focolaio di astrocitosi nel nucleo intercalato (E - E, medio ingrandimento).
FIGURA 18 - Vitellone, ponte: vacuolo in un neurone della formazione
reticolare (E - E, medio ingrandimento).
diagnostici sopraccitati, non si può pertanto porre alcuna
diagnosi di BSE o di malattia BSE-like. Soltanto in un animale (un vitello, clinicamente sano e regolarmente macellato, di 18-22 mesi di età) la presenza di minime tracce di
PrPsc nelle sezioni istologiche di tronco encefalico caudale
può lasciare alcuni dubbi sulla diagnosi; questo caso perciò può essere definito, come affermano gli inglesi, "unsolved". Al tempo delle ricerche era comunque ragionevol-
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FIGURA 19 - Vitellone (stesso animale della Figura n°18), ponte: vacuoli lungo l'assone di un neurone della formazione reticolare (E - E, medio
ingrandimento).
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FIGURA 20 - Bovino adulto, mesencefalo: vacuoli nei neuroni del nucleo
rosso (E - E, medio ingrandimento).
mente imprevedibile che in soggetti di età compresa fra i
18 e i 22 mesi potesse essere presente l'infezione da BSE e
pertanto, al momento del prelievo dell'encefalo, non era
stata congelata una porzione ai fini di poter eseguire il
western-blot. Forse, qualora si fosse potuta effettuare questa ulteriore prova, essa sarebbe stata di notevole ausilio ai
fini di porre una diagnosi definitiva, comunque dobbiamo
affermare che l'immunoistochimica fornisce elementi diagnostici altrettanto validi.
Ringraziamenti
FIGURA 21 - Vitellone, mesencefalo: vacuolo di grandi dimensioni in un
neurone del nucleo rosso (E - E, medio ingrandimento).
Si ringraziano per l'ausilio tecnico le Sig.ne: Lombardo T.,
Marangon C., Morra P.
Parole chiave
Bovino, vacuoli, SNC, malattie Scrapie-like.
Key words
Cattle, vacuolisations, CNS, Scrapie-like disease.
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