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Chimica Biologica
A.A. 2010-2011
Glicolisi
Marco Nardini
Dipartimento di Scienze Biomolecolari e Biotecnologie
Università di Milano
Glicolisi
Macromolecole Biologiche
Glicolisi
- via di degradazione del glucosio (1940)
- glucosio = maggior sorgente di energia
metabolica nelle cellule
- 10 reazioni enzimatiche
- gli enzimi della glicolisi sono localizzati nel citosol
- ruolo chiave nel metabolismo energetico: fornisce una porzione
significativa dell’energia libera utilizzata dagli organismi
- prepara il glucosio e altri composti per ulteriori degradazioni ossidative
- 1 molecola di glucosio (aldoesoso) è convertita in 2 molecole di
piruvato (unità C3). L’energia libera rilasciata viene utilizzata per
la sintesi di 2 molecole di ATP a partire da ADP e Pi, con
concomitante riduzione di 2 molecole di NAD+ a NADH
Glicolisi
Macromolecole Biologiche
Glicolisi
- la glicolisi è una via ubiquitaria
- la glicolisi è un processo anaerobico (non richiede ossigeno)
⇒ precoce via metabolica per estrarre energia dalle molecole nutritive
- negli aerobi la glicolisi è solo la parte iniziale
di un processo degradativo più ampio per la
produzione di energia e che porta alla completa
ossidazione del substrato con l’impiego di O2
come ossidante
- negli anaerobi la glicolisi avviene senza ossidazione
netta del substrato
⇒ fermentazione
(molti anaerobi dipendono completamente dalla
glicolisi per la produzione di energia)
Macromolecole Biologiche
Glicolisi
Destino metabolico del piruvato
condizioni aerobiche
- negli organismi aerobici il piruvato subisce
una decarbossilazione ossidativa per dare
vita ad una unità bicarboniosa
(gruppo acetilico dell’acetil-CoA)
- il gruppo acetilico viene completamente
ossidato a 2 molecole di CO2 nel ciclo
dell’acido citrico con riduzione di NAD+ e FAD
- gli elettroni rimossi vengono trasferiti al
sistema di trasporto degli elettroni mitocondriali
(riossidazione di NADH e FADH2) ed utilizzati
per generare molecole di ATP
(fosforilazione ossidativa)
Macromolecole Biologiche
Glicolisi
Destino metabolico del piruvato
condizioni anaerobiche
- il piruvato è convertito in un prodotto
ridotto con riossidazione del NADH
prodotto dalla reazione della GAPDH
(gliceraldeide-3-fosfato deidrogenasi)
2 modi:
- lievito (fermentazione alcolica)
il piruvato viene decarbossilato a CO2 ed acetaldeide che
viene poi ridotta dal NADH ottenendo NAD+ ed etanolo
- muscolo (fermentazione omolattica)
il piruvato viene ridotto a lattato per rigenerare il NAD+
Macromolecole Biologiche
Glicolisi
Destino metabolico del piruvato
Glicolisi
Macromolecole Biologiche
Glicolisi
- gli organismi utilizzano la glicolisi per fornire i precursori delle vie
metaboliche aerobiche (ciclo dell’acido citrico) o come sorgenti di energia
a breve termine quando l’ossigeno è presente in quantità limitanti
- negli animali un costante rifornimento di glucosio è fondamentale per
tessuti come cervello e globuli rossi che usano il glucosio quasi come
unica fonte di energia metabolica
- microorganismi, piante ed animali compiono le 10 reazioni della glicolisi
in modo simile (velocità singole reazioni e modalità di regolazione variano
da specie a specie
Glicolisi
Macromolecole Biologiche
Glicolisi
- 2 fasi
reazioni 1-5: investimento energetico
si consumano 2 molecole di ATP ed il glucosio è
scisso in 2 molecole di gliceraldeide-3-fosfato
(G3P)
reazioni 6-10: recupero energetico
le 2 molecole di G3P sono convertite in
2 molecole di piruvato con formazione di
4 molecole di ATP
⇒ resa netta di 2 molecole di ATP
reazione complessiva:
glucosio + 2 NAD+ + 2 ADP + 2 Pi → 2 piruvato + 2 NADH + 2 ATP + 2 H2O + 2 H+
Macromolecole Biologiche
Glicolisi
reazioni 1-5: investimento energetico
gli intermedi glicolitici
sono fosforilati
- i gruppi fosforici che vengono trasferiti dall’ATP all’esoso nelle prime
reazioni, non danno luogo a composti ad alta energia
Macromolecole Biologiche
Glicolisi
reazioni 6-10: recupero energetico
gli intermedi glicolitici
sono fosforilati
- le reazioni enzimatiche convertono i prodotti a bassa energia generati nella
prima fase in composti con alti potenziali di trasferimento del gruppo
fosforico che sono in grado di fosforilare ADP a formare ATP
Macromolecole Biologiche
Glicolisi
Perchè è necessaria una fase preparatoria in cui si consuma ATP?
- le due fosforilazioni ATP-dipendenti sono due reazioni fortemente
esoergoniche che creano due passaggi irreversibili, che avvengono in
condizioni lontane dall’equilibrio (tappe di comando) all’inizio della
via metabolica
- le due fosforilazioni della prima fase fanno sì che tutti gli intermedi
glicolitici siano fosforilati
⇒ composti fosforilati sono dotati di carica netta negativa e non possono
diffondere all’esterno della cellula
- la presenza di gruppi fosforici nei substrati rende le reazioni enzimatiche
più specifiche
⇒ gli enzimi della glicolisi legano gli intermedi glicolitici interagendo in
larga misura con i loro gruppi fosfato
Glicolisi: I fase
Macromolecole Biologiche
1) Esochinasi (chinasi di esosi)
reazione: trasferimento gruppo fosforico dall’ATP al glucosio con
formazione di glucosio-6-fosfato (G6P)
esochinasi: enzima ubiquitario poco specifico che catalizza la
fosforilazione di vari esosi (D-glucosio, D-mannosio, D-fruttosio)
+ H+
Macromolecole Biologiche
Glicolisi: I fase
1) Esochinasi
- complesso Mg2+-ATP è il secondo substrato per l’esochinasi
- Mg2+ essenziale per l’attività della chinasi
gli ioni Mg2+ schermano le cariche negative degli atomi di ossigeno sui
gruppi fosforici α e β oppure β e γ rendendo l’atomo di fosforo γ più
suscettibile all’attacco nucleofilico del gruppo C6-OH del glucosio
Macromolecole Biologiche
Glicolisi: I fase
1) Esochinasi
glucosio
- il legame del glucosio avvicina i 2 lobi della proteina (8Å)
- il movimento porta l’ATP vicino al gruppo ─C6H2OH del glucosio
escludendo molecole d’acqua dal sito attivo (catalisi da effetti di
prossimità)
⇒ polarità sito attivo ridotta ⇒ favorito l’attacco nucleofilo
⇒ evitata la reazione di idrolisi dell’ATP (trasferimento
termodinamicamente favorito del gruppo fosforico a H2O)
Macromolecole Biologiche
Glicolisi: I fase
2) Fosfoglucosio isomerasi
reazione: conversione di G6P in fruttosio-6-fosfato (F6P)
Fosfoglucosio isomerasi (PGI): isomerizzazione di un aldosio in un
chetosio (apertura anello, isomerizzazione,
chiusura anello)
- la reazione avviene in condizioni vicine all’equilibrio
Macromolecole Biologiche
Glicolisi: I fase
3) Fosfofruttochinasi
reazione: fosforilazione del F6P a formare fruttosio-1,6-bisfosfato (FBP, o F1,6P)
- reazione simile a quella catalizzata dall’esochinasi: attacco nucleofilico del
gruppo C1-OH dell’F6P sull’atomo di fosforo γ elettrofilico del complesso
Mg2+-ATP
- fosfofruttochinasi (PFK): opera in condizioni lontane dall’equilibrio
⇒ punto di controllo maggiore della glicolisi
- la PFK è un enzima allosterico, che risponde a vari effettori eterotropici
Glicolisi: I fase
Macromolecole Biologiche
3) Fosfofruttochinasi
- enzima tetramerico in 2 stati
conformazionali R e T in equilibrio
- ATP è sia substrato sia inibitore
allosterico di PFK (2 siti di legame
distinti)
Mg2+-ATP
Mg2+-ADP
F6P
- ADP, AMP e F2,6P rimuovono
gli effetti inibitori dell’ATP
⇒ attivatori allosterici
F6P
Mg2+-ATP
Mg2+-ADP
2 subunità dell’enzima tetramerico
(ulteriore asse binario verticale)
Macromolecole Biologiche
Glicolisi: I fase
3) Fosfofruttochinasi
- legame ATP (substrato):
uguale efficienza di legame sia per stato T che R
- legame ATP (inibitore)
legame di ATP quasi solo in conformazione T
- legame F6P
legame di preferenza in stato R
ad alta conc. l’ATP agisce come inibitore
allosterico di PFK legandosi allo stato T e
spostando l’equilibrio T
R verso T
(curva iperbolica ⇒ curva sigmoidale)
- gli attivatori AMP e ADP bilanciano l’inibizione da ATP legandosi
allo stato R (stabilizzandolo) e spostando l’equilibrio T
R verso R
Macromolecole Biologiche
Glicolisi: I fase
4) Aldolasi
reazione: scissione del FBP a formare 2 triosi: la gliceraldeide-3-fosfato
(GAP) e il diidrossiacetone fosfato (DHAP)
- reazione di scissione aldolica (inverso di una condensazione aldolica)
- la scissione avviene sulla forma aperta del substrato mediante catalisi
covalente (basi di Schiff) e catalisi acido-base
Glicolisi: I fase
Macromolecole Biologiche
4) Aldolasi
- cambio numerazione atomi C
- isomerizzazione G6P a F6P permette la
formazione di 2 composti C3 convertibili
l’uno nell’altro
- la scissione aldolica di G6P
porterebbe a prodotti di
diverso numero di atomi di C
1
3
1
2
2
3
Macromolecole Biologiche
4) Aldolasi
1) legame substrato
2) reazione gruppo carbonilico
di FBP con gruppo ε-amminico
Lys del sito attivo ⇒ formazione
base di Schiff protonata
3) rottura legame C3-C4 con rilascio
di GAP e formazione di enammina
4) protonazione dell’enammina a
catione imminico
5) idrolisi catione imminico, rilascio
DHAP e rigenerazione dell’enzima
Glicolisi: I fase
Glicolisi: I fase
Macromolecole Biologiche
Base di Schiff
R’
:
:
R”
ammina
aldeide o chetone
R── N ── C ── OH
H
R”
intermedio
carbinolammina
H+
R’
+
R── N ═ C
──
C═O
──
+
──
R── NH2
──
R’
H
+ H2O
R”
immina
(base di Schiff)
Macromolecole Biologiche
Glicolisi: I fase
5) Trioso fosfato isomerasi (TIM)
GAP e DHAP (isomeri chetosio-aldosio) prodotti della scissione aldolica.
Solo GAP prosegue lungo la via glicolitica
reazione: isomerizzazione con un intermedio enediolo (o enediolato)
che permette l’interconversione della gliceraldeide-3-fosfato
(GAP) e del diidrossiacetone fosfato (DHAP)
Macromolecole Biologiche
5) Trioso fosfato isomerasi (TIM)
TIM permette ad ambedue i prodotti
della reazione aldolasica di procedere
nella via glicolitica
Glicolisi: I fase
Glicolisi: I fase
Macromolecole Biologiche
5) Trioso fosfato isomerasi (TIM)
conversione di GAP
nell’intermedio
enediolo
Glu165 base generale
che sottrae un protone
dal C2 di GAP
His95 acido generale che
protona l’O carbonilico di GAP
His95 base generale
che sottrae un protone
dal gruppo ─OH
Glu165 acido generale
che protona il C1
conversione dell’intermedio
enediolo in DHAP
Macromolecole Biologiche
Glicolisi: I fase
5) Trioso fosfato isomerasi (TIM)
- quando il substrato si lega a TIM una
ansa di 10 residui (lid) si richiude sul
substrato
- la chiusura del lid:
(1) stabilizza di preferenza lo stato
di transizione della reazione
(2) impedisce la degradazione
dell’intermedio enediolo
- in soluzione l’intermedio enediolo si decompone rapidamente in
metilgliossale (tossico) e Pi
H─C
- altri TIM barrel: aldolasi, enolasi, piruvato chinasi
O
═
C═O
H3C
Macromolecole Biologiche
Glicolisi: I fase
5) Trioso fosfato isomerasi (TIM)
- TIM ha raggiunto la perfezione catalitica
⇒ la velocità della reazione bimolecolare tra enzima e substrato è
controllata dalla diffusione (la formazione del prodotto avviene con la
stessa velocità con cui enzima e substrato possono collidere in soluzione)
- GAP e DHAP sono interconvertiti in modo così efficiente che [GAP] e
[DHAP] sono mantenute a valori tipici della situazione all’equilibrio
k = [GAP] / [DHAP] = 4.73 10-2
(quindi all’equilibrio [DHAP] >> [GAP])
ma nello stato stazionario della cellula GAP viene
consumata nella glicolisi
⇒ maggior DHAP viene convertito in GAP per
mantenere il rapporto della situazione di equilibrio
Macromolecole Biologiche
Prima fase glicolisi
un esoso viene:
- fosforilato
- isomerizzato
- scisso in 2 triosi fosfati
interconvertibili
vengono consumati 2 ATP
Glicolisi: I fase
Macromolecole Biologiche
Seconda fase glicolisi
- i due gruppi fosforici provenienti dall’ATP
introdotti nell’esoso nella prima fase vengono
entrambi recuperati nella seconda, sotto forma
di ATP
- nella seconda fase, un gruppo fosforico viene
introdotto in un intermedio a 3 atomi di carbonio
(bisfosfoglicerato) a partire da fosfato inorganico
(ortofosfato)
⇒ questi gruppi fosforici (2 mol per mol di glucosio)
vengono trasferiti all’ADP a dare ATP
Glicolisi: II fase
Macromolecole Biologiche
Glicolisi: II fase
6) Gliceraldeide-3-fosfato deidrogenasi (GAPDH)
reazione: ossidazione e fosforilazione di GAP ad opera di NAD+ e Pi con
sintesi di 1,3-bisfosfoglicerato (1,3-BPG)
- l’ossidazione dell’aldeide (reazione esoergonica) promuove la sintesi
dell’acil fosfato 1,3-BPG che è un composto ad “alta energia”
(gli acil fosfati hanno un alto potenziale di trasferimento del gruppo fosforico)
Macromolecole Biologiche
Glicolisi: II fase
6) Gliceraldeide-3-fosfato deidrogenasi (GAPDH)
reazione: ossidazione e fosforilazione di GAP ad opera di NAD+ e Pi con
sintesi di 1,3-bisfosfoglicerato (1,3-BPG)
- l’ossidazione dell’aldeide (reazione esoergonica) promuove la sintesi
dell’acil fosfato 1,3-BPG che è un composto ad “alta energia”
(gli acil fosfati hanno un alto potenziale di trasferimento del gruppo fosforico)
- 1,3-BPG contiene infatti un gruppo anidridico misto con energia libera
di idrolisi molto negativa
Macromolecole Biologiche
Glicolisi: II fase
6) Gliceraldeide-3-fosfato deidrogenasi (GAPDH)
attacco nucleofilico del gruppo sulfidrilico
all’aldeide ⇒ formazione del tioemiacetale
legame di GAP all’enzima
si rigenera l’enzima e si forma
l’anidride mista ad alta energia 1,3-BPG
ossidazione del tioemiacetale da
parte del NAD+ ad acil tioestere
un’altra molecola di NAD+
sostituisce in NADH
l’intermedio tioestere subisce
l’attacco nucleofilico del Pi
Macromolecole Biologiche
Glicolisi: II fase
6) Gliceraldeide-3-fosfato deidrogenasi (GAPDH)
- catalisi covalente ed acido-basica
- l’energia ottenuta dall’ossidazione della aldeide non viene dissipata ma
conservata grazie alla sintesi del tioestere e della riduzione del NAD+ a NADH
infatti:
- il gruppo aldeidico è ossidato non direttamente a gruppo carbossilico
ma inizialmente a gruppo tioestere
- i tioesteri hanno un elevato potenziale di trasferimento del gruppo acile
Macromolecole Biologiche
Glicolisi: II fase
7) Fosfoglicerato chinasi (PGK)
reazione: “chinasi” perchè la reazione inversa è il trasferimento di un
gruppo fosforico a 3PG
⇒ formazione di ATP e di 3-fosfoglicerato (3PG)
Macromolecole Biologiche
Glicolisi: II fase
7) Fosfoglicerato chinasi (PGK)
- struttura bilobata
- sito di legame Mg2+-ADP su un dominio
- sito di legame 1,3-BPG sull’altro dominio (distanza ~10Å)
- avvicinamento dei 2 domini
reazione in ambiente privo di acqua
⇒ meccanismo catalitico simile ad
esochinasi con il coinvolgimento di
un fenomeno di adattamento indotto
(ma strutture scorrelate)
Macromolecole Biologiche
Glicolisi: II fase
6-7) Accoppiamento reazioni GAPDH e PGK
GAP + Pi + NAD+ → 1,3-BPG + NADH
1,3-BPG + ADP → 3PG + ATP
ΔG°’ = + 6.7 kJ/mole
ΔG°’ = - 18.8 kJ/mole
GAP + Pi + NAD+ + ADP → 3PG + NADH + ATP ΔG°’ = - 12.1 kJ/mole
- anche se la reazione della GAPDH è endoergonica, il trasferimento del
gruppo fosforico dall’1,3-BPG all’ADP è fortemente esoergonico e
rende possibile la reazione complessiva
- il consumo dell’intermedio comune 1,3-BPG nella reazione della PGK
spinge a compimento la reazione della GAPDH
⇒ fosforilazione a livello del substrato: produzione di ATP che non implica
l’utilizzo di O2
successivamente vedremo la fosforilazione ossidativa:
produzione di ATP mediante ossidazione di NADH da parte di O2
Macromolecole Biologiche
Glicolisi: II fase
8) Fosfoglicerato mutasi (PGM)
reazione: la mutasi è una “transferasi” ch catalizza il trasferimento di un
gruppo funzionale all’interno della stessa molecola
⇒ conversione (isomerizzazione) di 3-fosfoglicerato (3PG) in
2-fosfoglicerato (2PG)
reazione energeticamente quasi neutrale, ma importante per generare il
precursore del composto ad “alta energia” successivo
Macromolecole Biologiche
Glicolisi: II fase
8) Fosfoglicerato mutasi (PGM)
non è un semplice trasferimento intramolecolare di un gruppo fosforico
3PG si lega al fosfoenzima
(His 8 è fosforilata)
il complesso si decompone
con formazione di 2PG e
rigenerazione del fosfoenzima
attivo
il gruppo fosforico dell’enzima
viene trasferito a 3PG
(intermedio bisfosforilato)
Macromolecole Biologiche
Glicolisi: II fase
9) Enolasi
reazione: l’enolasi è una liasi che catalizza la deidratazione di 2PG con
formazione di fosfoenolpiruvato
⇒ conversione di 2-fosfoglicerato (2PG) in fosfoenolpiruvato (PEP)
(PEP: secondo intermedio ad “alta energia” )
l’energia libera standard di idrolisi del 2PG è solo -16 kJ/mole
⇒ insufficiente per la sintesi di ATP partendo da ADP (ΔG°’= -30 kJ/mole)
- l’enzima forma un complesso con Mg2+ prima che si leghi il substrato
Glicolisi: II fase
Macromolecole Biologiche
10) Piruvato chinasi (PK)
reazione: scissione di PEP catalizzata dalla piruvato chinasi (transferasi)
e sintesi di ATP
- reazione fortemente esoergonica
(fornisce energia libera sufficiente per la sintesi di ATP)
- esempio di fosforilazione a livello del substrato: produzione di ATP
che non implica l’utilizzo di O2
+
+ H+
- necessaria la presenza di cationi K+ e Mg2+
Macromolecole Biologiche
Glicolisi: II fase
10) Piruvato chinasi (PK)
(1) un atomo di ossigeno del gruppo fosforico β dell’ADP attacca in modo
nucleofilico l’atomo di fosforo del PEP
⇒ formazione di enolpiruvato ed ATP
(2) l’enolpiruvato tautomerizza a piruvato
Macromolecole Biologiche
10) Piruvato chinasi (PK)
- l’alto potenziale di trasferimento
del gruppo fosforico del PEP
riflette il grande rilascio di energia
libera dovuto alla conversione di
enolpiruvato nel suo tautomero in
forma chetonica, che avviene dopo
il rilascio del gruppo fosfato
Glicolisi: II fase
Macromolecole Biologiche
Seconda fase glicolisi
- sintesi di 4 ATP (2 per GAP)
- la parziale ossidazione del glucosio porta alla
formazione di 2 molecole di piruvato che sono
ancora relativamente in una forma ridotta
condizioni aerobiche: la completa ossidazione
degli atomi di carbonio del piruvato a CO2 è
mediata dal ciclo dell’acido citrico
⇒ l’energia rilasciata da questo processo promuove
la sintesi di molto più ATP di quello generato
dalla glicolisi
condizioni anaerobiche: il piruvato viene
metabolizzato solo in parte per rigenerare il NAD+
Glicolisi: II fase
Macromolecole Biologiche
Sommario delle 10
reazioni della glicolisi
Glicolisi
Macromolecole Biologiche
Glicolisi
Bilancio della glicolisi
la stechiometria complessiva della glicolisi è:
Glucosio + 2NAD+ + 2ADP + 2Pi → 2Piruvato + 2NADH + 2H+ + 2 ATP + 2H2O
ATP:
investimento di 2 ATP nella prima fase e sintesi di 4 ATP (2 per GAP)
nella seconda fase
⇒ resa netta di 2 ATP x glucosio
NADH:
durante la glicolisi il glucosio viene parzialmente ossidato consentendo di
ridurre 2 molecole di NAD+ a NADH
NADH rappresenta una fonte di energia libera recuperabile mediante
successiva ossidazione
condizioni di aerobiosi ⇒ “trasporto di elettroni”
organismi anaerobici ⇒ fermentazione
Glicolisi
Macromolecole Biologiche
Controllo della glicolisi
- in condizioni fisiologiche solo 3 reazioni (HK, PFK, PK) avvengono con
grande diminuzione di energia libera (condizioni lontane dall’equilibrio)
- HK non è necessaria visto che nel muscolo scheletrico la fonte di G6P non è
il glucosio ma il glicogeno
- PK catalizza l’ultima reazione e quindi è improbabile che sia il principale
punto di regolazione
⇒ PFK maggior punto di controllo della glicolisi