Enzimi REDOX
Gli enzimi coinvolti in processi redox possono essere classificati in tre
categorie: deidrogenasi,
deidrogenasi, ossigenasi e ossidasi
Deidrogenasi
Riciclo del cofattore
Nei processi redox enzimatici deve essere utilizzato un cofattore,
cofattore,
solitamente la nicotammide adenin dinucleotide [NAD(H)] (80%) e il
corrispettivo fosfato [NADP(H)] (10%). Altri cofattori quali le
flavine (FMN e FAD) e il pirrolo chinolin chinone (PQQ) si incontrano
più raramente.
Ossidazione di alcoli ad opera di NAD+ (alcol deidrogenasi)
deidrogenasi)
Tutti i cofattori sono molecole instabili e troppo costose per essere
utilizzate in quantità stechiometrica. Non possono essere sostituite
sostituite da
analoghi artificiali.
Possono però essere rigenerato utilizzando una seconda reazione redox.
redox.
L’efficienza di un processo di riciclo viene espressa dal TTN (numero
(numero
totale di cicli catalitici, total turnover number)
)
che
indica
il
numero
di
number
volte che il cofattore può essere rigenerato prima di decomporsi.
Per processi di laboratorio TTN = 103-104
processo produttivo sono necessari TTN >
sono accettabili, per un
105.
Se si utilizzano cellule intere il problema del riciclo del cofattore non
sussiste.
Riciclo del NAD+ (forma ridotta)
Storicamente NAD+ è stato riciclato utilizzando sodio ditionito
(Na2S2O4) come agente riducente (TTN ≤ 100). Altri metodi
elettrochimici o fotochimici forniscono TTN maggiori (≤
(≤ 1000) ma
basse regioselettività
regioselettività.
Risultati nettamente migliori sono stati ottenuti con metodi enzimatici
enzimatici
sia con il NAD+ e il NADP+.
I metodi di riciclo enzimatico possono essere suddivisi in due classi:
classi:
Metodi con substrati accoppiati (coupled
-substrate process)
(coupledprocess)
Il cofattore è costantemente rigenerato per aggiunta di un secondo
substrato ausiliario trasformato dallo stesso enzima, ma nel senso
senso
inverso
Metodi con enzimi accoppiati (coupled
-enzyme process)
(coupledprocess)
In questo caso i due processi, conversione del substrato principale
principale e
riciclo del cofattore,
cofattore, sono catalizzati da due diversi enzimi
Metodi con substrati accoppiati (coupled
-substrate process)
(coupledprocess)
Il cofattore è costantemente rigenerato per aggiunta di un secondo
substrato ausiliario trasformato dallo stesso enzima, ma nel senso
senso
inverso.
Per spostare il secondo equilibrio a destra si utilizza il substrato
substrato ausiliario
in largo eccesso ottenendo TTN = 103
Metodi con substrati accoppiati (coupled
-substrate process)
(coupledprocess)
Il riciclo del cofattore con lo stesso enzima è elegante ma ha alcuni
inconvenienti piuttosto severi:
1. L’efficienza globale del sistema è limitata poiché
poiché l’enzima lavora in
entrambi i processi
2. Il prodotto deve essere separato dal substrato ausiliario in eccesso
eccesso
3. Può esserci disattivazione dell’
dell’enzima se si utilizzano composti
carbonilici molto reattivi quali acetaldeide o cicloesanone come
donatori redox
4. Può anche esserci inibizione dell’
dell’enzima a causa dell’
dell’elevato eccesso
di substrato ausiliario.
Metodi con enzimi accoppiati (coupled
-enzyme process)
(coupledprocess)
I due processi, conversione del substrato principale e riciclo del
del cofattore,
cofattore,
sono catalizzati da due diversi enzimi.
Per ottenere i risultati migliori i due diversi enzimi devono avere
avere specificità
specificità
sufficientemente diverse per i rispettivi substrati in modo tale che le due
reazioni possano procedere indipendentemente e che quindi i due substrati
non debbano competere con il sito attivo di un singolo enzima.
Sono stati sviluppati diversi esempi eccellenti di rigenerazione del NADH
anche a livello industriale mentre per il NADPH sono disponibili metodi a
livello laboratorio ma non su larga scala.
Il metodo migliore e più
più largamente utilizzato per riciclare il NADH usa la
formiato deidrogenasi (FDH) per catalizzare l’l’ossidazione del formiato a
CO2
Il vantaggio principale è che sia il substrato ausiliario che il prodotto non
sono innocui per l’
l’enzima e facili da rimuovere dall’
dall’ambiente di reazione.
FHD è commerciale, facilmente immobilizzabile e stabile, se protetta
dall’
dall’autoossidazione.
autoossidazione. E’ costosa e ha una bassa attività
attività specifica (3U/mg).
Può però essere immobilizzata o trattenuta in membrana. TTM 103-105.
Un altro metodo utilizza l’
l’ossidazione del glucosio, catalizzata dalla glucosio
deidrogenasi (GDH)
In questo caso l’
l’equilibrio è spostato a destra perché
perché il gluconolattone si
idrolizza spontaneamente ad acido gluconico.
gluconico.
Il metodo è efficace sia per il NADH che il NADPH. La GHD è
piuttosto costosa e la separazione dal gluconato non è particolarmente
agevole
Etanol e Alcol Deidrogenasi (ADH) sono anche utilizzate per
rigenerare il NADH e NADPH.
Il basso costo dell’
dell’ADH e la volatilità
volatilità dell’
dell’etanolo e dell’
dell’acetaldeide
rendono questo metodo attraente per utilizzi su larga scala. A causa
del basso potenziale redox possono essere ridotti solo derivati
carbonilici reattivi quali aldeidi o chetoni ciclici. Con altri substrati di
deve forzare a destra l’l’equilibrio utilizzando etanolo in eccesso o
rimuovendo l’aldeide.
Quest’
Quest’ultimo risultato può essere ottenuto ossidando l’
l’aldeide ad acetato
con un aldeide deidrogenasi,
deidrogenasi, con conseguente rigenerazione di un
secondo equivalente di cofattore ridotto.
Tutti questi sistemi forniscono bassi TTN e richiedono sistemi multi
multienzimatici complessi.
Riciclo del NADH (forma ossidata)
Il miglior metodo per riciclare i cofattori NAD(P) nella loro forma
ossidata utilizza la glutammato deidrogenasi (GluDH)
GluDH) che catalizza la
amminazione riduttiva dell’
’
α
cheto
glutarrato
a Ldell
L-glutammato.
Può anche essere utilizzato il piruvato insieme alla lattato deidrogenasi
(LDH). La LDH è economica e ha una più
più elevata attività
attività specifica. Ha
però un potenziale redox inferiore ed accetta solo il NADH.
Riduzione di aldeidi e chetoni ad alcoli
Lo ione idruro (H(H-) è un nucleofilo ed è in grado di portare un attacco
al carbonio elettrofilo del carbonile riducendolo ad alcol
I due reagenti più
più comunemente utilizzati per tale reazione sono il
NaBH4 (sodio boroidruro)
boroidruro) e il LiAlH4 (litio alluminio idruro).
Il NaBH4 è un riducente più
più blando e viene solitamente utilizzato in
solventi alcolici acquosi.
Il LiAlH4 è un riducente più
più energico, si usa in etere o THF e reagisce
violentemente con l’
l’acqua
Riduzione di aldeidi e chetoni ad alcoli
Riduzione di aldeidi e chetoni ad alcoli con NaBH4
L’ idrolisi avviene nel mezzo di reazione che contiene acqua
Riduzione di aldeidi e chetoni ad alcoli con LiAlH4
Tutti i quattro idruri sono in grado di reagire
Riduzione di aldeidi con NaBH4
Riduzione di chetoni
Si forma un nuovo stereocentro:
stereocentro: processo stereoselettivo
Idruri chirali enantiopuri: complessi del borano con ossoazaborolidine
Complessi del borano con ossoazaborolidine:
ossoazaborolidine:
configurazione assoluta del prodotto
R>>R’
R>>R’
( R)
Complessi del borano con ossoazaborolidine:
ossoazaborolidine:
Modelli di stato di transizione
Complessi del borano con ossoazaborolidine:
ossoazaborolidine:
Processo catalitico
Il BH3 non deve essere in grado di reagire da solo (fornirebbe un
processo non stereoselettivo)
stereoselettivo)
Ruolo del boro dell’
dell’ossoazaborolidina come acido di Lewis nell’
nell’ attivare il
composto carbonilico
Determinazione della configurazione relativa di un alcol: Regola di Prelog
O
O
H3C
O
L
SM
PhMgBr
Ph OH
H3C
O
O
L
SM
Idrolisi
Ph OH
H3C
OH
O
(-)-(R)-acido atrolattico
Il fenil magnesio bromuro attacca preferenzialmente la faccia del carbonile
(Re o Si) dalla parte del gruppo Small portando, dopo idrolisi, all’
all’acido
atrolattico (R) o (S) rispettivamente.
Riduzione di aldeidi e chetoni con enzimi isolati
Il decorso stereochimico dipende fortemente dal substrato:
Regola di Prelog:
Prelog: si
basa sulla
sterochimica della
riduzione che si
ottiene con cellule di
Curvularia falcata,
nella quale si ottiene
prevalente riduzione
alla faccia Re
Strutture preferenziali per le deidrogenasi
YADH: yeast alcohol dehydrogenase
HLADH: horse liver alcohol dehydrogenase
TBADH: Thermoanaerobium brockii alcohol dehydrogenase
HSDH: Hydroxysteroid dehydrogenase
Regola dell’interazione a tre punti (Ogston 1948)
Poiché l’interazione del substrato con il sito attivo è
tridimensionale, il sito attivo deve avere almeno tre
punti di contatto per poter raggiungere un elevato
livello di stereoselezione
R
Interazione di A,B,C ottimale
Orientazione ottimale di D
Elevata stereoselezione
D= gruppo reattivo
S
Interazione di A,B,C non ottimale
Orientazione non ottimale di D
Bassa stereoselezione
Regola dell’interazione a tre punti (Ogston 1948)
Riduzione del piruvato con liver dehydrogenase per ottener l’(S)l’(S)-acido lattico
Nella reazione inversa l’(S)l’(S)-acido lattico viene ossidato selettivamente
Risoluzione di chetoni policiclici con HLADH
uso combinato di bio e chemo catalizzatori
Alcol Deidrogenasi di fegato di cavallo (HLADH)
Deidrogenasi commerciale, la più utilizzata in biotrasformazioni.
biotrasformazioni.
La struttura ai raggi X è stata risolta ed è un dimero con due subsub-unità quasi
identiche contenenti due atomi di zinco. La struttura tridimensionale
tridimensionale è simile a
quella della alcol deidrogenasi di leivito (YADH) anche se la sequenza primaria è
alquanto diversa.
E’ efficace nel catalizzare la riduzione di chetoni ciclici con un anello di dimensioni
non troppo elevate
Alcol Deidrogenasi di fegato di cavallo (HLADH)
Riduzione stereoselettiva di 22-alchiltiopiranialchiltiopirani-4-oni
Risoluzione dei due chetoni
Alcol Deidrogenasi di fegato di cavallo (HLADH)
Asimmetrizzazione di dichetoni achirali
Riduzioni di aldeidi e chetoni con lievito di birra
(saccharomyces cerevisiae)
Il lievito di birra è il microorganismo più utilizzato per la riduzione di
stereoselettiva di composti carbonilici. E’ ideale per i nonnon-microbiologi
perché è facilmente disponibile e non richiede fermentatori sterili.
sterili.
Riduzioni di chetoesteri con lievito di birra
Riduzioni di chetoesteri con lievito di birra
Inibizione dell’ LL-enzima
Riduzioni di chetoesteri con lievito di birra
Inibizione del DD-enzima
