"Molecular Farming:
produzione di cibi funzionali,
di nutraceutici e
biofarmaceutici"
ENEA - Casaccia
4 Dicembre 2003
“I virus vegetali nella
formulazione di un
vaccino
contro il virus HIV-1”
Carla Marusic
UTS BIOTEC-GEN
ENEA - Trisaia
Piante come “biofabbriche” per la
produzione di vaccini
Vs
Molecole a scopo vaccinale espresse
in piante transgeniche
Vaccini in trial clinico
Nature Reviews Genetics (2003)
Vol.4; 794-805
Trasformazione della cellula vegetale
1) Trasformazione
stabile mediata da
Agrobacterium
Cellula vegetale
Nucleo
Nucleo
DNA della pianta
Gene inserito
Proteina estranea
2) Trasformazione
transiente mediata da
Virus Vegetali (PVX)
Cellula vegetale
Nucleo
Vettore virale
DNA della pianta
Nucleo
Replicazione
del virus
Proteina estranea
Confronto tra due sistemi di espressione in pianta
Vaccine 19 (2001) 2735–2741
Strategie di clonaggio per l’espressione di
molecole vaccinali mediata da virus vegetali
Replicasi Movimento Proteina di
rivestimento
Genoma virale WT
Genoma virale modificato
A)
Gene estraneo
+
B)
Particelle Virali Chimeriche
Molecole a scopo vaccinale espresse mediante
virus vegetali
Patogeno
Virus di Norwalk
Influenza
Pianta
Proteina
Sistema di
Espressione
Tabacco/
Patata
Proteina di
rivestimento del
virus di Norwalk
Virus vegetale
AMT
Tabacco
Emoagglutinina
Tabacco/ Fagiolo HIV epitopo (gp120)
Streptococcus
Tabacco
mutans
(agente della carie)
Trends
Biotechnol. 15,
441-444 (1997)
Engineering plants for
commercial products and
applications (eds. Collins
G.B. and Sheperd, R.J.) 1996
Virus vegetale
AMT/CPMV
Curr. Opin. Biotechnol.
11, 199-204 (2000)
HIV epitopo (gp41)
Virus vegetale
PVX
J.Virol. Vol 75, 84348439
(2001)
proteina di
superficie SpaA
Virus vegetale
AMT
Microbes Infect. 1,
777-783 (1999).
HIV
N. benthamiana
Virus vegetale
TMV
Bibliografia
Produzione di vaccini mediante esposizione su
virus vegetali, principali vantaggi :
•La produzione e validazione di un nuovo vaccino può essere ottenuta
in tempi molto brevi
•Facilità di manipolazione del genoma virale
•Elevati livelli di produzione di virus ricombinante per peso fresco
di tessuto infetto
•Purificazione del virus rapida ed efficiente
•Molti virus vegetali sono stabili a temperatura ambiente
•Ciascuna particella virale può esporre molte copie del frammento
proteico scelto (da 60 fino a 2,000 copie per virione)
Programma Nazionale di Ricerca sull’AIDS
Progetto: Piante ingegnerizzate come
biofabbriche per la formulazione di vaccini.
Sviluppo di un vaccino anti HIV-1
Vaccino contro HIV-1: una sfida
• Il virus HIV-1 muta molto velocemente
• Il virus deve essere bloccato in una fase precoce
dell’infezione
• Scelta dell’antigene, punti cruciali:
Variazioni nella conformazione delle proteine virali (isolati
primari e ceppi di laboratorio).
•
Attivazione
del sistema immunitario per indurre la produzione
di anticorpi neutralizzanti capaci di bloccare il virus nelle
primissime fasi dell’infezione.
•Induzione
di una risposta immunitaria di tipo cellulare con
produzione di cellule del sistema immunitario specializzate in
grado di eliminare il virus ed eventuali cellule infettate.
Proteine coinvolte nel processo di penetrazione
del virus HIV-1 all’interno della cellula bersaglio
Modello della struttura della
glicoproteina gp41
‘Broadly Neutralizing Antibodies Targeted to the Membrane-Proximal External Region of
Human Immunodeficiency Virus Type 1 Glycoprotein gp41’
MICHAEL B. ZWICK et al. JOURNAL OF VIROLOGY, 2001, p. 10892–10905
Particelle di virus X della patata (PVX) che
espongono sulla loro superficie una
porzione della proteina gp41 di HIV-1
Clonaggio della sequenza HIV-1 nel genoma del PVX
gp 41 (2F5)
HIV-1
PVX-2F5
•Ogni Particella Virale
Chimerica di PVX è
costituita da circa 1300
molecole di CP.
Pianta infettata con il PVX-2F5
OD 405
CsCl gradient
Purificazione del virus
1400
1200
1000
800
600
400
200
0
Gli estratti di pianta reagiscono
con anticorpi umani anti HIV-1
C-
WT-PVX
PVX-2F5E
Immunizzazione di topi con il virus PVX-2F5
Per via intraperitoneale
Per via intranasale
Prelievi
Immunizzazioni
Giorni
0
14 28
42
56 70
0
7 14 21 28 35 42 49 56 63 70
Risposta immunitaria indotta dal virus PVX-2F5
PVX-2F5E
3500
3000
2500
2000
1500
1000
500
0
IgG (Somministrazione IN)
3500
3000
2500
2000
1500
1000
500
0
3500
3000
2500
2000
1500
1000
500
0
IgG (Somministrazione IP)
OD 405
3500
3000
2500
2000
1500
1000
500
0
WT-PVX
1500
IgA (Somministrazione IN)
1500
1000
1000
500
500
0
14
28
42
Giorni
56
70
0
14
28
42
56
70
Il PVX-2F5 induce la produzione di anticorpi umani
in un modello murino “umanizzato” SCID (Severe
Combined Immuno-Deficient Mice)
Topo SCID ricostituito con cellule
umane del donatore sano
Immunizzazione
con le cellule
dendritiche trattate
Prelievi ed
analisi dei
sieri
Prelievo da un
donatore sano
Gradiente di densità
Identificazione di
Anticorpi umani anti-HIV
Topi trattati
1.4
Topi controllo
Topi controllo
1.2
Cellule Dendritiche
umane trattate con il
virus PVX-2F5
O.D.405 nm
Purificazione di cellule
mononucleate del sangue
periferico
1.6
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
0
Giorni
10
17
25
Saggio di Neutralizzazione del virus HIV-1
in vitro
M1
M4
H4
M7
H6
% Di Neutralizzazione
HIV-1IIIB
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
20
Siero topi
SCID
Siero topi
C57BL/10
40
80
160
Diluizione del siero
320
Inibizione della formazione di
sincizi indotta dal virus HIV-1
Cellule in coltura
Produzione di un vaccino mediante virus vegetali
1) Identificazione della sequenza di interesse
Gp41 epitopo 2F5
CsCl gradient
2) Clonaggio nel vettore virale
3) Infezione della pianta e purificazione del virus
4) Esperimenti di immunizzazione in modelli animali
Conclusioni
•Le
Particelle Virali Chimeriche PVX-2F5 espongono
un epitopo di HIV-1 altamente conservato.
•Inducono
una potente risposta immunitaria neutralizzante
sia in topi normali che nel modello “umanizzato”
SCID (Hu-PBL-SCID).
•L’immunizzazione per via intranasale induce la produzione
di alti livelli di anticorpi associati alle mucose (IgA).
•La risposta immunitaria è stata ottenuta senza l’aggiunta
di adiuvanti.
Manipolazione del PVX, infezioni di
pianta, purificazione del virus,
analisi dei sieri. Immunizzazioni e
prelievi.
Brevetto Congiunto ENEA – ISS
Inventori: Benvenuto E., Marusic C., Belardelli F.
Rizza P., Capone I.
01.02.2002 EP 1 167 530 A3
Modello SCID e saggi
di neutralizzazione in vitro.
Progetti futuri
•Valutare l’efficacia del sistema PVX nell’induzione di risposte
immunitarie di tipo cellulare
• Capire l’effetto di PVX come adiuvante
•Valutare/verificare la sicurezza del sistema PVX in modelli
animali e nell’uomo
•Costruire nuove Particelle Virali Chimeriche per la formulazione
di un vaccino multicomponente
SIXTH FRAMEWORK PROGRAMME
PRIORITY [LSH-2002-1.2.5-2]
RECOMBINANT PHARMACEUTICALS FROM PLANT
FOR HUMAN HEALTH
(PHARMA-PLANTA)
Collaboratori esterni
Selene Baschieri
Chiara Lico
Floriana Capuano
Camillo Mancini
Eugenio Benvenuto
Responsabile di progetto
Filippo Belardelli
Direttore del Laboratorio di Virologia
Istituto Superiore di Sanita’,
Roma
