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Il test per la diagnosi molecolare della Sindrome dell'X Fragile: novità e prospettive future Marina Grasso Laboratorio Genetica Umana E.O. Ospedali Galliera 1993-2013 INSIEME, MENO “FRAGILI” DI PRIMA PROGETTIAMO IL FUTURO Roma 20 aprile 2013 Normali . . . Sindrome di Martin-Bell Affetti Penetranza 20% 80% Cromosoma X Fragile Portatori Normali Affetti FraXq27.3 Portatori Patologie associate a Premutazione: DNA > Gene FMR1e FXTAS FXPOI Aumento della richiesta test genetico - Donne in gravidanza - Centri Fecondazione assistita Neurologia Metodi -PCR innovativi nella diagnosi molecolare Meccanismo patogenetico «Guadagno di Funzione» 1992 FXTAS FXPOI 2003-2007 2012 Ruolo interruzioni AGG Ridefinizione Rischio Procreativo 1943 1969-1977 1991 1998-2001 2003-2007 M. Grasso, E.O. Ospedali Galliera, Genova 2008-2012 Diagnosi molecolare gene FMR1 PCR Vantaggi Reazione Polimerasica a Catena 30 CGG • Accuratezza nella definizione numero CGG • Richiede 50 volte meno DNA rispetto a SB • Tempi di esecuzione 8-12 ore 30 CGG Svantaggi 37 CGG • Non amplifica grandi espansioni CGG • Non identifica mosaici • Non definisce lo stato di metiilazione 80 CGG CGG max 100-120 = 15 gg Southern blot Vantaggi 8.0 kb • Identifica grandi espansioni CGG • Identifica mosaici • Definisce lo stato di metilazione 5.2 kb Svantaggi 2.8 kb Normali Portatori • Molto laborioso e non automatizzabile • Poco accurato nella definizione numero di CGG • Richiede grandi quantità di DNA (8-10 µg) • Tempi di esecuzione da 8-15 giorni Affetti M. Grasso, E.O. Ospedali Galliera, Genova Tecniche innovative in diagnostica molecolare di FMR1 2008 RP- PCR Forward Primer CGG CGG CGG CGG CGG CGG CGG CGG Reverse Primer 30 CGG 30 CGG >200 CGG mutazione CGG max 100-120 M. Grasso, E.O. Ospedali Galliera, Genova Tecniche innovative in diagnostica molecolare di FMR1 RP- PCR Forward Primer CGG CGG CGG CGG CGG CGG CGG CGG Reverse Primer Femmina Omozigote Normale Femmina Eterozigote Mutazione 30, 30 CGG 30 CGG >200 CGG mutazione M. Grasso, E.O. Ospedali Galliera, Genova Tecniche innovative in diagnostica molecolare di FMR1 Test Metilazione 2011 No HpaII M. Grasso, E.O. Ospedali Galliera, Genova + HpaII Tecniche innovative in diagnostica molecolare di FMR1 RP-PCR mPCR Repeat-Primed PCR methylation sensitive PCR Amplifica tutte le espansioni CGG : 6 >200 CGG Amplifica tutte le espansioni CGG : 6 >200 CGG Identifica mosaici con Premutazione fino all’1% Consente di valutare lo stato di metilazione del promotore Identifica mosaici con Mutazione fino al 5% Consente di valutare n. e posizione delle interruzioni AGG Richiede 40-50 volte meno DNA Tempi di esecuzione : 2-3 giorni M. Grasso, E.O. Ospedali Galliera, Genova Diagnosi molecolare gene FMR1 Laboratorio Genetica Umana Ospedale Galliera Gen 2011- Ott 2012 RP-PCR n. 762 campioni 1 Allele Normale NO espansioni CGG Mutazione Completa Test Metilazione Mosaici 742 14 6 97% 2% 0,8 % RP-PCR n. 557 campioni 2 Alleli Normali (Eterozigote) 1 Allele Normale NO espansioni CGG (Omozigote) 434 78 % 90 16 % Test Metilazione 1 Allele Normale 1 Allele Espanso 33 6% Risparmio risorse e tempo M. Grasso, E.O. Ospedali Galliera, Genova 2,8 % 22 % Test genetico Consulenza Genetica ha lo scopo di: correlare il risultato ottenuto con il test sul DNA (genotipo) con i sintomi clinici (fenotipo) della persona interessata; illustrare le implicazioni dell’eventuale mutazione sulla vita dell’affetto e del portatore; informare sui rischi procreativi e sull’opportunità di estendere le indagini ad altri familiari; offrire tutte le informazioni e i sostegni necessari per aiutare l’interessato e la sua famiglia. ? ?? ….Screening di popolazione…. M. Grasso, E.O. Ospedali Galliera, Genova 2011 2003 Rischio di Espansione (Rischio procreativo) 13 laboratori 678 trasmissioni 120 100 80 2011 60 Serie1 2003 40 20 0 1 55-59 2 60-69 3 70-79 4 80-89 5 90-99 2011 0% 20 % 54 % 88 % 91 % 100 % 2003 4% 5% 31 % 58 % 80 % 100 % M. Grasso, E.O. Ospedali Galliera, Genova 6 >100 Ruolo delle interruzioni AGG Forward Primer CGG CGG CGG CGG CGG CGG CGG CGG Reverse Primer Forward Primer CGG CGG CGG CGG CGG CGG CGG CGG CGG AGG CGG CGG CGG CGG CGG CGG CGG CGG CGG AGG CGG CGG CGG CGG CGG CGG CGG CGG CGG AGG CGG CGG CGG ………… Triplette AGG interrompono la sequenza ripetuta CGG rendendola piu’ stabile durante la replicazione DNA nella trasmissione alla prole Reverse Primer Eichler et al., 1994 avevano già intuito che lunghi tratti CGG puri senza AGG avevano maggiore tendenza ad espandersi Fino al 2011 è stato molto difficile definire il numero di AGG (solo mediante sequenziamento diretto) M. Grasso, E.O. Ospedali Galliera, Genova Tecniche innovative in diagnostica molecolare di FMR1 Dimensionamento sequenza CGG Interruzioni AGG M. Grasso, E.O. Ospedali Galliera, Genova Come possiamo usare questa informazione ? M. Grasso, E.O. Ospedali Galliera, Genova 2012 Vol.14; 8: 729-736 267 trasmissioni da madre a figli ~80% Consulenza Genetica Portatrice Premutazione Rischio diminuisce 75 CGG 75 CGG 2 AGG 0 1 2 30 AGG AGG aumentano ~10% Rischio 10 % Rischio 80 % A parità di n. CGG all’aumentare del numero di AGG il rischio di espansione diminuisce M. Grasso, E.O. Ospedali Galliera, Genova 538 trasmissioni Alleli Intermedi e Piccole Premutazioni n. AGG n. CGG 2 1 0 % rischio espansione Interm-Premutazione 45-49 4 20 80 50-54 9 26 100 % rischio espansione Mutazione 55-59 5 51 95 60-64 55 84 97 65-69 60 80 100 M. Grasso, E.O. Ospedali Galliera, Genova Conclusioni Alleli 45-49 CGG NO rischio espansione a Premutazione (anche in assenza di AGG) Alleli 50-54 CGG rischio espansione a Premutazione Alleli > 54 CGG rischio di espansione a Mutazione completa Dati ancora non sufficienti per definire Linee Guida La decisione circa la Diagnosi Prenatale va valutata caso per caso (Ansietà, Infertilità, età materna avanzata……) M. Grasso, E.O. Ospedali Galliera, Genova Conclusioni Test genetico gene FMR1 • Analisi completa ed esaustiva del gene FMR1 per FXS – POI - FXTAS capacità di identificare qualsiasi espansione CGG, e definire lo stato di metilazione • Possibilità di analisi tessuti diversi da sangue (richiede 40-50 volte meno DNA ) - Diagnosi prenatale >> amniociti e CVS - Mucosa buccale e saliva, follicoli piliferi >> correlazione genotipo - fenotipo • Genotipizzazione AGG consentirà una definizione più accurata del rischio procreativo >> Consulenza Genetica • Selezione pazienti per terapia farmacologica M. Grasso, E.O. Ospedali Galliera, Genova Ringraziamenti Laboratorio Genetica Umana Ambulatorio Genetica Medica Maurizio Barbaresi Francesca Forzano Elena Gennaro Francesca Faravelli Domenico Coviello Ospedale Galliera - Genova
