Il test per la diagnosi molecolare della
Sindrome dell'X Fragile: novità
e prospettive future
Marina Grasso
Laboratorio Genetica Umana
E.O. Ospedali Galliera
1993-2013
INSIEME,
MENO “FRAGILI” DI PRIMA
PROGETTIAMO IL FUTURO
Roma
20 aprile 2013
Normali
.
.
.
Sindrome di
Martin-Bell
Affetti
Penetranza
20%
80%
Cromosoma
X Fragile
Portatori
Normali
Affetti
FraXq27.3
Portatori
Patologie associate a
Premutazione:
DNA > Gene
FMR1e FXTAS
FXPOI
Aumento della richiesta test genetico
- Donne in gravidanza
- Centri Fecondazione assistita
Neurologia
Metodi -PCR
innovativi nella
diagnosi molecolare
Meccanismo patogenetico
«Guadagno di Funzione»
1992
FXTAS
FXPOI
2003-2007
2012
Ruolo interruzioni AGG
Ridefinizione Rischio
Procreativo
1943
1969-1977
1991
1998-2001
2003-2007
M. Grasso, E.O. Ospedali Galliera, Genova
2008-2012
Diagnosi molecolare gene FMR1
PCR
Vantaggi
Reazione Polimerasica a Catena
30 CGG
• Accuratezza nella definizione numero CGG
• Richiede 50 volte meno DNA rispetto a SB
• Tempi di esecuzione 8-12 ore
30 CGG
Svantaggi
37 CGG
• Non amplifica grandi espansioni CGG
• Non identifica mosaici
• Non definisce lo stato di metiilazione
80 CGG
CGG
max 100-120
= 15 gg
Southern blot
Vantaggi
8.0 kb
• Identifica grandi espansioni CGG
• Identifica mosaici
• Definisce lo stato di metilazione
5.2 kb
Svantaggi
2.8 kb
Normali
Portatori
• Molto laborioso e non automatizzabile
• Poco accurato nella definizione numero di CGG
• Richiede grandi quantità di DNA (8-10 µg)
• Tempi di esecuzione da 8-15 giorni
Affetti
M. Grasso, E.O. Ospedali Galliera, Genova
Tecniche innovative in diagnostica
molecolare di FMR1
2008
RP- PCR
Forward
Primer
CGG CGG CGG CGG CGG CGG CGG CGG
Reverse
Primer
30 CGG
30 CGG
>200 CGG
mutazione
CGG
max 100-120
M. Grasso, E.O. Ospedali Galliera, Genova
Tecniche innovative in diagnostica
molecolare di FMR1
RP- PCR
Forward
Primer
CGG CGG CGG CGG CGG CGG CGG CGG
Reverse
Primer
Femmina Omozigote Normale
Femmina Eterozigote Mutazione
30, 30 CGG
30 CGG
>200 CGG
mutazione
M. Grasso, E.O. Ospedali Galliera, Genova
Tecniche innovative in diagnostica molecolare di FMR1
Test Metilazione
2011
No HpaII
M. Grasso, E.O. Ospedali Galliera, Genova
+ HpaII
Tecniche innovative in diagnostica
molecolare di FMR1
RP-PCR
mPCR
Repeat-Primed PCR
methylation sensitive PCR
Amplifica tutte le espansioni CGG : 6 >200 CGG
Amplifica tutte le espansioni CGG : 6 >200 CGG
Identifica mosaici con Premutazione fino all’1%
Consente di valutare lo stato di metilazione del promotore
Identifica mosaici con Mutazione fino al 5%
Consente di valutare n. e posizione delle interruzioni AGG
Richiede 40-50 volte meno DNA
Tempi di esecuzione : 2-3 giorni
M. Grasso, E.O. Ospedali Galliera, Genova
Diagnosi molecolare gene FMR1
Laboratorio Genetica Umana
Ospedale Galliera
Gen 2011- Ott 2012
RP-PCR
n. 762 campioni
1 Allele Normale
NO espansioni CGG
Mutazione
Completa
Test
Metilazione
Mosaici
742
14
6
97%
2%
0,8 %
RP-PCR
n. 557 campioni
2 Alleli Normali
(Eterozigote)
1 Allele Normale
NO espansioni CGG
(Omozigote)
434
78 %
90
16 %
Test
Metilazione
1 Allele Normale
1 Allele Espanso
33
6%
Risparmio risorse e tempo
M. Grasso, E.O. Ospedali Galliera, Genova
2,8 %
22 %
Test genetico
Consulenza Genetica
ha lo scopo di:
correlare il risultato ottenuto con il test sul DNA (genotipo) con i sintomi
clinici (fenotipo) della persona interessata;
illustrare le implicazioni dell’eventuale mutazione sulla vita dell’affetto e
del portatore;
informare sui rischi procreativi e sull’opportunità di estendere le
indagini ad altri familiari;
offrire tutte le informazioni e i sostegni necessari per aiutare
l’interessato e la sua famiglia.
? ??
….Screening di popolazione….
M. Grasso, E.O. Ospedali Galliera, Genova
2011
2003
Rischio di Espansione
(Rischio procreativo)
13 laboratori
678 trasmissioni
120
100
80
2011
60
Serie1
2003
40
20
0
1
55-59
2
60-69
3
70-79
4
80-89
5
90-99
2011
0%
20 %
54 %
88 %
91 %
100 %
2003
4%
5%
31 %
58 %
80 %
100 %
M. Grasso, E.O. Ospedali Galliera, Genova
6
>100
Ruolo delle interruzioni AGG
Forward
Primer
CGG CGG CGG CGG CGG CGG CGG CGG
Reverse
Primer
Forward
Primer
CGG CGG CGG CGG CGG CGG CGG CGG CGG
AGG CGG CGG CGG CGG CGG CGG CGG CGG CGG AGG
CGG CGG CGG CGG CGG CGG CGG CGG CGG
AGG CGG CGG CGG …………
Triplette AGG interrompono la sequenza ripetuta CGG rendendola
piu’ stabile durante la replicazione DNA
nella trasmissione alla prole
Reverse
Primer
Eichler et al., 1994 avevano già intuito che lunghi tratti CGG puri senza AGG avevano maggiore tendenza ad espandersi
Fino al 2011 è stato molto difficile definire il numero di AGG (solo mediante sequenziamento diretto)
M. Grasso, E.O. Ospedali Galliera, Genova
Tecniche innovative in diagnostica molecolare di FMR1
Dimensionamento sequenza CGG
Interruzioni AGG
M. Grasso, E.O. Ospedali Galliera, Genova
Come possiamo usare questa informazione ?
M. Grasso, E.O. Ospedali Galliera, Genova
2012 Vol.14; 8: 729-736
267 trasmissioni da madre a figli
~80%
Consulenza Genetica
Portatrice Premutazione
Rischio diminuisce
75 CGG
75 CGG
2 AGG
0
1
2
30 AGG
AGG aumentano
~10%
Rischio 10 %
Rischio 80 %
A parità di n. CGG all’aumentare del
numero di AGG il rischio di espansione
diminuisce
M. Grasso, E.O. Ospedali Galliera, Genova
538 trasmissioni
Alleli Intermedi e
Piccole Premutazioni
n. AGG
n. CGG
2
1
0
% rischio espansione Interm-Premutazione
45-49
4
20
80
50-54
9
26
100
% rischio espansione Mutazione
55-59
5
51
95
60-64
55
84
97
65-69
60
80
100
M. Grasso, E.O. Ospedali Galliera, Genova
Conclusioni
Alleli 45-49 CGG
NO rischio espansione a Premutazione (anche in assenza di AGG)
Alleli 50-54 CGG
rischio espansione a Premutazione
Alleli > 54 CGG
rischio di espansione a Mutazione completa
Dati ancora non sufficienti per definire Linee Guida
La decisione circa la Diagnosi Prenatale va valutata caso per caso
(Ansietà, Infertilità, età materna avanzata……)
M. Grasso, E.O. Ospedali Galliera, Genova
Conclusioni
Test genetico gene FMR1
• Analisi completa ed esaustiva del gene FMR1 per FXS – POI - FXTAS
capacità di identificare qualsiasi espansione CGG, e definire lo stato di metilazione
• Possibilità di analisi tessuti diversi da sangue (richiede 40-50 volte meno DNA )
- Diagnosi prenatale >> amniociti e CVS
- Mucosa buccale e saliva, follicoli piliferi >> correlazione genotipo - fenotipo
• Genotipizzazione AGG consentirà una definizione più accurata del rischio procreativo
>> Consulenza Genetica
•
Selezione pazienti per terapia farmacologica
M. Grasso, E.O. Ospedali Galliera, Genova
Ringraziamenti
Laboratorio
Genetica Umana
Ambulatorio
Genetica Medica
Maurizio Barbaresi
Francesca Forzano
Elena Gennaro
Francesca Faravelli
Domenico Coviello
Ospedale Galliera - Genova
