Ti tolo:
ALLEGATO
All.2_P18
Rev.1
Del 21/04/12
I NFO R M AT I V A DI AG N O SI SI N DR O M E X FR AG I L E
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FOGLIO INFORMATIVO SULLA DIAGNOSI MOLECOLARE DELLA SINDROME
DELL’X-FRAGILE (MUTAZIONE FRAXA)
Che cosa è la Sindrome dell’X Fragile?
La sindrome del cromosoma X fragile è la forma più frequente di ritardo mentale ereditario, con una
prevalenza stimata di 1:4000 maschi e 1:8000 nelle femmine; è dovuta alla mutazione del gene FMR1
localizzato in Xq27.3. Questa mutazione (FRAXA) consiste in una amplificazione e successiva
metilazione di una sequenza di triplette CGG, localizzata nella porzione trascritta ma non tradotta del
primo esone del gene, ed è responsabile di un blocco della trascrizione.
Il nome "X fragile " deriva dal fatto che queste alterazioni provocano delle modificazioni nella struttura del
cromosoma, che al microscopio presenta una strozzatura nel punto in cui è situato il gene.
Questa sindrome colpisce molto più frequentemente i maschi rispetto alle femmine poichè queste ultime
possiedono 2 copie del cromosoma X. Lo sviluppo mentale delle persone affette da X Fragile è molto
vario. Alcune mostrano capacità cognitive quasi normali, altre un lieve ritardo mentale, altre ancora un
ritardo mentale grave.
Quasi tutti i maschi con la mutazione completa presentano i sintomi della malattia, mentre solo circa la
metà delle femmine presentano ritardo mentale di grado variabile (da lieve a grave) e tratti fisici
caratteristici.
Definizione delle categorie degli alleli:
Alleli Normali sono quelli compresi nell’intervallo tra 5 - 44 CGG.
I più comuni nella popolazione generale sono 29 e 30 CGG. Gli alleli normali sono stabili sia durante la
meiosi che la mitosi.
Alleli Intermedi (Gray Zone) sono quelli compresi tra 45 e 55 CGG. A tutt’oggi non è ancora stata
osservata l’espansione a mutazione completa in una generazione, senza prima il passaggio a
premutazione. Per questo motivo gli alleli intermedi possono essere considerati come normali nel senso
che non sono state segnalate donne, con alleli in questo intervallo, che abbiano figli affetti.
Può accadere comunque che alleli intermedi possano subire piccole espansioni e/o regressioni quando
vengono trasmessi, per cui non si può escludere che nelle generazioni successive possano portare a
premutazioni e mutazioni complete. Gli alleli intermedi possono essere trattati come piccole premutazioni
se l’analisi familiare evidenzia la presenza di un soggetto con diagnosi accertata di mutazione FRAXA.
Premutazione è considerata un’espansione compresa tra 56 e 200-230 CGG circa.
In questo intervallo di espansione non è stata dimostrata instabilità somatica, così come non c’è
ipermetilazione del promotore e la premutazione non è associata di norma a ritardo mentale. Donne
eterozigoti per una premutazione devono essere considerate a rischio di avere figli affetti, fino ad oggi è
riconosciuto che l’allele più piccolo che abbia generato una mutazione completa è di 59 ripetizioni CGG.
L’entità del rischio di espansione da premutazione a mutazione è generalmente proporzionale alle
dimensioni della premutazione.
La variabilità del limite superiore della premutazione (200-230) deriva dalla stima approssimativa, valutata
su Southern blot e calcolata come differenza rispetto ad un allele normale.
Tale differenza corrisponde a circa 170-200 triplette in più rispetto al normale (30 CGG). Lo stato della
metilazione può aiutare a definire la categoria: infatti è generalmente accettato che è premutazione
un’espansione fino a 230 CGG NON metilata, e mutazione completa un’espansione di almeno 200 CGG
metilata. Attualmente sono descritte due condizioni associate allo stato di premutazioni: la
Sindrome da tremore atassia associata all’X-fragile (FXTAS), e la Menopausa Precoce associata
all’X-fragile (POF), che possono manifestarsi in soggetti con alleli premutati nel range tra 59 e 200
repeats.
Mutazione Completa (Full mutation) comprende espansioni metilate superioni a 200-230 ripetizioni CGG,
generalmente tra diverse centinaia e qualche migliaio di triplette CGG.
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Generalmente è presente un’ampia variabilità somatica che si traduce nella tipica diffusione dei frammenti
(“smear”) visibili in Southern blot. L’ipermetilazione del promotore di FMR1 (e anche della stessa
sequenza ripetuta CGG) è l’evento mutazionale epigenetico che, insieme all’espansione della sequenza
ripetuta, caratterizza la maggior parte delle mutazioni complete.
In alcuni tessuti come i villi coriali (CVS) il processo di metilazione del DNA può non essere ancora
completato specialmente nell’epoca gestazionale durante la quale si effettua la villocentesi (11°
settimana); per cui l’ipermetilazione può non essere presente entro la 12° settimana di gestazione. Per
questo motivo nella diagnosi prenatale di sindrome dell’X Fragile è prudente effettuare la villocentesi dopo
la 12° settimana ecografica.
In caso di riscontro di mutazione completa in un feto di sesso femminile, è praticamente impossibile
predire se questa sarà o no affetta da ritardo mentale.
Mosaici: in questa categoria rientrano mosaici di lunghezza della tripletta CGG e di metilazione:
Mosaici di lunghezza della tripletta CGG : con questo termine ci si riferisce a sottopopolazioni cellulari con
mutazione completa o con premutazione (15-20% dei soggetti con mutazione completa).
Occasionalmente sono stati osservati pazienti con sottopopolazioni di mutazione completa e di alleli
normali e/o deleti (1% dei soggetti con mutazione completa).
Mosaici di metilazione : esistono pazienti nei quali sono presenti sottopopolazioni di cellule nelle quali la
mutazione è metilata e altre nelle quali non è metilata (5-8% dei
soggetti con mutazione completa). Raramente sono stati osservati maschi emizigoti per espansioni CGG
ampiamente superiori a 200 CGG, ma che mantengono il promotore del gene FMR1 non metilato, per cui
non presentano il ritardo mentale.
Come si trasmette?
Essendo una malattia legata al cromosoma X, i figli maschi e femmine di madri portatrici di premutazione
o mutazione completa avranno il 50% di probabilita’ di ereditare la premutazione o mutazione completa. I
figli maschi di padri portatori di premutazione non erediteranno il cromosoma X paterno e quindi neppure
la premutazione. Tutte le figlie femmine di padri portatori di premutazione erediteranno il cromosoma X
paterno e quindi la premutazione.
Descrizione tecnica dell’analisi:
L’analisi è condotta mediante amplificazione del DNA (PCR) che consente di amplificare in vitro una
regione specifica del gene FMR-1 contenente il sito fragile FRAXA.
La determinazione del numero di ripetizioni delle triplette nucleotidiche (genotipizzazione) viene effettuata
mediante corsa elettroforetica in analizzatore genetico automatizzato ABI PRISM 3130.
La classificazione genotipica in base al numero delle ripetizione della tripletta nucleotidica viene
effettuata secondo la seguente tabella:
Classe Genotipica
Normale
Gray Zone
Premutazione
Mutazione Completa
Nr. Di ripetizioni della tripletta
nucleotidica
5-44
45-55
56-200/230
>200/230 metilazione
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Limiti della Metodica:
Il test utilizzato consente di misurare accuratamente la dimensione dell’espansione sino a 230 triplette
mediante analisi di frammenti su sequenziatore automatico. NON è in grado di valutare espansioni
maggiori mediante elettroforesi su gel. NON e’ in grado di valutare lo stato di metilazione della regione.
si deve tener presente che:
In caso pazienti di sesso femminile nelle quali viene ipotizzato un genotipo omozigote in base alla
presenza di un solo picco (circa il 20 % dei casi), la PCR potrebbe non aver amplificato un allele con un’
espansione di grosse dimensioni, e quindi trattarsi di un falso genotipo omozigote. In tal caso sarebbe
indicato approfondire la diagnosi mediante Southern Blot.
In caso di pazienti di sesso maschile, la mancanza di un prodotto di PCR evidenziabile e quindi, di
conseguenza, di una genotipizzazione, potrebbe indicare una possibile premutazione o mutazione
completa. In tal caso è necessario confermare la diagnosi mediante Southern Blot.
1% dei pazienti di sesso maschile con mutazione completa hanno in realtà mutazione completa a
mosaico con un allele normale. In questi casi la PCR potrebbe amplificare solo l’allele di dimensioni
inferiori e diagnosticare quindi come normali pazienti portatori della mutazione.
Quali sono in generale i possibili rischi e i benefici derivanti dalle indagini di genetica
molecolare?
La scelta delle tecniche diagnostiche da utilizzare nell’analisi e l'interpretazione delle indagini genetiche
implica che la storia medica familiare fornita al laboratorio sia accurata e che ciascun campione inviato al
laboratorio corrisponda alla persona indicata sull'etichetta. Pertanto un errore nella storia medica familiare
o nell'identificazione del campione può portare ad una diagnosi errata.
L'accuratezza dei test genetici è limitata sia dalla particolare natura dei test stessi sia dai metodi impiegati.
Per questi motivi è possibile che, nonostante tutte le cure siano poste nell'analisi, questa possa non
essere esaustiva, ovvero la diagnosi possa essere conclusa solamente se Lei si renderà disponibile al
prelievo di uno o più ulteriori campioni. L’accertamento di un difetto genetico in un individuo potrebbe
corrispondere ad un’eventuale condizione di portatore/portatrice in uno o entrambi i genitori, e dei membri
correlati della famiglia. Alcuni test genetici possono rivelare la non-paternità. Se durante l'esecuzione di
un test genetico ciò accadesse, e se tale aspetto potesse significativamente influenzare il risultato
dell’esame, questo Le verrà comunicato attraverso un medico specialista, che potrà essere lo stesso che
Le ha prescritto l’esame.
Tipologia del campione e suo trattamento
Per effettuare la diagnosi molecolare è sufficiente un prelievo di sangue periferico o di altri tessuti.
In rarissimi casi è possibile:
• dover ripetere il prelievo di sangue o di tessuto
• un errore diagnostico
E’ possibile effettuare l’analisi genica anche in epoca prenatale. L’esame viene effettuato su DNA
estratto da villi coriali o da amniociti tramite villocentesi o amniocentesi.
Il DNA estratto è utilizzato al solo scopo di eseguire l’analisi richiesta.
Il referto è previsto dopo circa 2-3 settimane, a partire dalla data del ricevimento del campione.
