Patogenesi delle infezioni batterica parte II
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Sistemi di trasporto e secrezione delle cellule batteriche •Un aspetto interessante della virulenza batterica è rappresentato dai sistemi di trasporto; •Un mezzo utilizzato dai patogeni per bersagliare le cellule ospiti direttamente con fattori di patogenicità (o con molecole effettrici) che influenzano la cellula ospite e ne alterano la fisiologia; •I geni codificanti le proteine di tali sistemi sono localizzati in isole di patogenicità (PAI) o in elementi genetici extracromosomici come plasmidi. Sistemi dipendenti da Sec a due passaggi: coinvolti nella produzione di molte tossine e nella biogenesi dei Pili di tipo IV Sistemi indipendenti da Sec ad un passaggio: tipo I, trasportatori ABC e tipo III Il sistema Sec è un sistema secretorio costituito da una traslocasi in grado di trasportare proteine all’esterno della membrana o di inserirle nella membrana nel giusto orientamento orientamento.. Sistemi di secrezione di tipo III I sistemi di secrezione di tipo III sono stati ben caratterizzati in diversi batteri patogeni Gram-; Sono sistemi composti da un complesso di oltre 20 proteine; Tali proteine si assemblano in un canale altamente regolato che attraversa la membrana interna, il periplasma e la membrana esterna, con un meccanismo a guisa di siringa munita di relativo ago da iniezione che penetra nella membrana della cellula bersaglio. Membrana cellula ospite Membrana batterica esterna Periplasma Membrana batterica interna Tipo III ATP binding protein Sistemi di secrezione di tipo III Il processo di secrezione dei sistemi di tipo III è innescato quando il patogeno entra in stretto contatto con la cellula ospite, è infatti definito ContattoContatto-Dipendente. Dipendente Questo sistema è usato da numerosi batteri patogeni come: Salmonelle, Shigelle, Yersinie, E. coli EPEC e EHEC, Vibrioni, Pseudomonas aeruginosa. Possono essere a codificazione Cromosomica o extracromosomica: -Il sistema delle Salmonelle è codificato da 3 isole di patogenicità (PAI) localizzate nel genoma batterico (Cromosomiche) -Nelle Shigelle i geni codificanti il sistema di secrezione di tipo III sono situati invece in un plasmide (Extracromosomiche) Una volta secrete nella cellula bersaglio le molecole del batterio ne alterano la fisiologia per favorire la replicazione e la sopravvivenza del patogeno (es. Riarrangiamento del citoscheletro) Penetrazione e disseminazione nei tessuti profondi dell’ospite Fattori e Meccanismi di Diffusione Penetrazione e disseminazione nei tessuti La maggior parte dei batteri patogeni per iniziare il processo infettivo penetra nell’epitelio mediante differenti meccanismi di invasione. Il processo di penetrazione e la successiva diffusione dei microrganismi sono fortemente facilitati dalla secrezione di enzimi con funzione di fattori di invasione. L’invasione dei tessuti dell’ospite può quindi essere facilitata dalla produzione di proteine extracellulari che agiscono localmente per facilitare la crescita e la diffusione del patogeno e/o per danneggiare le cellule dell’ospite, tali proteine sono definite INVASINE. FATTORI DI DIFFUSIONE: DIFFUSIONE: INVASINE Ialuronidasi (Streptococchi, Stafilococchi, Clostridi), Degrada l’acido ialuronico che svolge funzioni di collante nei tessuti; Collagenasi (Clostridium histolyticum, C. perfringens), Degrada la trama di collagene che sostiene i tessuti favorendo la diffusione Neuraminidasi (Vibrio cholerae, Shigella dysenteriae), Favorisce la diffusione locale degradando le mucosa (orofaringea, intestinale ecc) Chinasi (Streptococchi, Stafilococchi), corrispondenza di una lesione tissutale; Elastasi Dissolve i coaguli di fibrina in (P. aeruginosa), Degradare il collagene e le giunzioni strette nei tessuti, favorendo cheratiti ed infezioni polmonari. Una peculiare invasina: invasina: la COAGULASI •Alcuni microrganismi sintetizzano enzimi che promuovono la formazione di coaguli di fibrina che permettono al microrganismo, piuttosto che diffondere, di rimanere localizzato e protetto. •Il più studiato di questi enzimi è la Coagulasi prodotta dallo Stafilococcus aureus, che induce la formazione di un deposito di fibrina sui cocchi stessi, proteggendoli, quindi dall’attacco delle cellule immunitarie dell’ospite. Produzione di Coagulasi = Potenziale Patogeno Il Test della Coagulasi è utilizzato nella pratica per l’identificazione di S. aureus Si mescola, in una provetta, una piccola quantità (0,5 ml) di una coltura batterica in terreno liquido dello Stafilococco in esame con 1 o 2 ml di plasma; Si incuba la coltura a 37°C; Nel caso di Stafilococchi patogeni, entro 3 ore si produce un evidente Coagulo Coagulo, mentre gli Stafilococchi non-patogeni lasciano inalterata la fluidità della miscela. Fattori di diffusione: Enzimi che causano digestione Tra le proteine extracellulari che promuovono la patogenesi batterica favorendo lo stabilirsi ed il mantenimento della malattia ci sono altre proteine secrete nello spazio extracellulare con funzioni digestive: Proteasi:: catalizzano la rottura del legame peptidico. Proteasi Lipasi: trasformano i trigliceridi in glicerolo. Glicoidrolasi:: degradano il maltosio. Glicoidrolasi Nucleasi: degradano il legame fosfodiestere negli ac. nucleici Fattori di diffusione: Enzimi che causano citolisi Alcuni microrganismi patogeni in fase di crescita per poter diffondere dal focolaio di infezione verso altre parti del corpo, provocando danno in siti distanti, da quello d’ingresso, rilasciano tossine che sono enzimi che attaccano costituenti cellulari citolitiche Alcuni patogeni producono molecole in grado di danneggiare la membrana citoplasmatica delle cellule ospiti causandone la lisi e molte citotossine agiscono sui globuli rossi causandone la lisi, Tali molecole sono dette Emolisine Emolisine, facilmente evidenziabili come attività facendo crescere i batteri in terreni di coltura contenenti sangue. Durante la crescita del batterio l’emolisina rilasciata lisa gli eritrociti generando un alone di emolisi che può essere parziale (alfa emolisi) o completa (beta emolisi). Emolisi parziale Emolisi completa Fattori di diffusione: Enzimi che causano citolisi Alcune emolisine attaccano i fosfolipidi di membrana soprattutto la fosfatidilcolina questi enzimi sono detti Fosfolipasi, Un tipico esempio è la fosfolipasi del Clostridium perfrigens in grado di degradare la membrana di cellule sia eucariotiche che procariotiche (contenenti entrambi fosfolipidi). Tale tossina è prodotta da tutti i ceppi di Clostridium perfringens, è definita Fosfolipasi C ed ha attività litica verso eritrociti, leucociti e cellule endoteliali. Ciò provoca aumento della permeabilità vascolare, emolisi, sanguinamento e distruzione dei tessuti con disseminazione del batterio manifestazioni tipiche della gangrena gassosa. Meccanismi di penetrazione Sostanzialmente i batteri possono penetrare nella cellula e nel tessuto ospite mediante due meccanismi: 1) Distruzione del tessuto tessuto:: i batteri diffondono grazie a danni fisici generati con la produzione di enzimi degradativi e litici extracellulari. 2) Meccanismi invasivi invasivi:: consentono al batterio di penetrare direttamente nelle cellule dell’epitelio senza generare un danno fisico mediante cioè un processo di endocitosi (utilizzati anche per penetrare nei fagociti professionali); 1) Un tipico esempio è rappresentato da S. aureus 2) Un tipico esempio sono i meccanismi delle Neisserie patogene e di batteri come Shigella ed E. coli. Batteri che si internalizzano in cellule non non--immuni mediante invasine Transcitosi Alcuni batteri producono Adesine e Invasine che attivano l’apparato citoscheletrico della cellula ospite permettendo al batterio di entrare nella cellula per fagocitosi. Tali batteri, come le Neisserie patogene, possiedono un Sistema di Secrezione di tipo III III.. Quando il batterio contatta le cellule eucariotiche, secerne al loro interno proteine che rendono tali cellule capaci di inglobare il batterio, all’interno di un vacuolo. Successivamente il batterio viene liberato dal vacuolo e si moltiplica nel citoplasma della cellula o liberato nello spazio sottomucoso per esocitosi. Meccanismi di penetrazione: E. coli Enteropatogeni (EPEC) I ceppi di E. coli enteropatogeni sono privi di potere tossinogeno o invasivo, ma sono dotati di un particolare carattere di adesività localizzata alle cellule dell’intestino tenue. I ceppi EPEC formano micro-colonie simili a calici sulla superficie delle cellule epiteliali, con i batteri attaccati alle cellule ospiti attraverso strutture a piedistallo. Inizialmente si ha una debole adesione mediata da Pili a fascio BFp, BFp Successivamente si verifica una secrezione attiva di proteine da parte di un sistema di secrezione di tipo III, nella cellula epiteliale ospite, In particolare è secreta la proteina Tir che funge da recettore dell’intimina dell’intimina insieme ad altre 2 proteine, che nel complesso costituiscono il recettore per l’INTIMINA, INTIMINA, una molecola di membrana esterna del batterio. Il batterio altera così la struttura cellulare con riarrangiamento dell’actina e la formazione di una struttura a piedistallo. Ciò determina la distruzione dei microvilli che porterà ad una sindrome di malassorbimento e diarrea Immagine schematica e che mostra EPEC aderenti all’orletto a spazzola delle cellule della mucosa intestinale con evidente distruzione localizzata dei microvilli. Il complesso intimina-TIR è codificato da un gene cromosomale eae Meccanismi invasivi Tra gli enterobatteri di particolare interesse per il loro meccanismo di invasione c’è il genere Shigella. Questo batterio privo di flagelli è in grado di passare attraverso la mucosa intestinale invadendo le cellule epiteliali. E’ stato proposto un probabile modello per l'invasione delle cellule epiteliali del colon da parte di Shigella, denominato Actin based motility Probabile modello per l'invasione delle cellule epiteliali del colon 1) Shigella passa la mucosa attraverso cellule specializzate chiamate cellule M. Dalla cellula M, Shigella passa ad un macrofago da cui successivamente fuoriesce. 2) Shigella utilizza le sue invasine per entrare nelle cellule epiteliali della mucosa dalla parte basale. Le invasine causano riarrangiamenti del citoscheletro delle cellule ospiti che determinano l’endocitosi del batterio all’interno di vescicole. Una volta dentro la cellula, Shigella fuoriesce dal vacuolo e si moltiplica nel citoplasma. 3) Le Shigelle sono in grado di muoversi attraverso la cellula ospite e diffondere alle cellule ospiti adiacenti mediante un processo unico chiamato actin-based motility. 4) In questo processo, i filamenti di actina polimerizzano ad una estremità del batterio, producendo code simili a comete che spingono il batterio attraverso il citoplasma della cellula ospite. 5) Quando raggiungono l’estremità della cellula, i filamenti di actina spingono Shigella attraverso tutta la membrana e quindi nella cellula adiacente. Tipi di Meccanismi invasivi Il genoma procariotico Il genoma procariotico Isole di Patogenicità (Pathogenicity Islands, Islands, PAI) Regioni del cromosoma in grado di codificare per uno o più determinanti di virulenza. Sono caratterizzate da tratti di DNA eterologo per la presenza di elementi genetici mobili derivanti da scambi genetici orizzontali: Sequenze d’inserzione; geni plasmidici; geni fagici. Caratterizzano la patogenicità di batteri di una stessa specie differenziandoli da batteri non patogeni. Caratteristiche delle isole di patogenicità: 1. Sono assenti nei corrispondenti ceppi avirulenti. 2. Il contenuto in G-C è diverso dal resto del cromosoma. 3. Presentano alle estremità sequenze ripetute/ inserzione. 4. Contengono elementi genetici mobili (transposoni). 5. Sono instabili, presentano meccanismi di variazione genetica. 6. E’ possibile identificarle mediante tecniche di ibridazione molecolare Regioni con contenuto di GC anomalo L’analisi del contenuto anomalo di GC (mediante sequenziamento), consente di identificare la presenza di PAI che derivano da scambi genetici orizzontali con DNA acquisito da altre specie batteriche. L’identificazione delle PAI nel genoma batterico è indice di un elevato tasso di variabilità nella specie batterica. GC totale 47.3% 52.7% 54% 44.3% 42.5% DNA acquisito da altre specie L’assetto chimico del segmento donato è differente da quello del cromosoma del batterio ricevente FATTORI DI VIRULENZA CODIFICATI DALLE PAI 1. Sistemi di secrezione 2. Interferenza con il sistema immune 3. Adesività e colonizzazione 4. Modulatori di funzioni della cellula ospite 5. Internalizzazione/invasione 6. Sopravvivenza/moltiplicazione intracellulare 7. Sottrazione di nutrienti (es: ferro) Isole di patogenicità in ceppi di E. coli uropatogeni e enteropatogeni Nei ceppi di E. coli uropatogeni sono state individuate diverse PAI: Un’isola di patogenicità codifica per una α-emolisina e per i pili P, fondamentali per il patogeno per legarsi ai P-glicolipidi delle cellule epiteliali uretrali e renali in modo da resistere al flusso dell’urina e alla peristalsi uretrale. Una seconda PAI codifica per altre fimbrie, per l’emolisina II e per il fattore tossico necrotizzante. Inoltre in ceppi di E. coli enteropatogeni isolati da feci di soggetti affetti da diarrea sono presenti isole di patogenicità con raggruppamenti di geni di virulenza responsabili dell’attacco dei batteri alle cellule ospiti, della perdita dei villi intestinali e del profondo riarrangiamento del citoscheletro cellulare. Isola di patogenicità cag (cag(cag-PAI) di Helicobacter pylori Helicobacter pylori colonizza lo strato mucoso della parete gastrica dell’uomo, provocando nella maggior parte de soggetti colonizzati infiammazione gastrica (cronica, superficiale, asintomatica). E’ un batterio gram-negativo, spiraliforme, microaerofilo e ureasi positivo. La persistenza dei batteri è legata alla mobilità assicurata dai flagelli insieme alla capacità di produrre enzimi, come l’UREASI in grado di degradare la mucina gastrica. L'ureasi è un enzima, appartenente alla classe delle idrolasi, che catalizza l'idrolisi dell'urea in CO2 e NH3 e neutralizza l'effetto dei succhi gastrici. (NH2)2CO + H2O CO2 + 2 NH3 Isola di patogenicità cag (cag(cag-PAI) di Helicobacter pylori Ad'oggi conosciamo vari ceppi di H. pylori, suddivisi in modo anche minimale, tra loro. Due stipiti risultano altamente virulenti per l’uomo e mostrano grandi differenze tra loro, con più del 6% della differenza genomica. L’analisi del genoma ha individuato 62 geni coinvolti nella patogenesi dell’infezione di questi stipiti batterici. Entrambi i ceppi tuttavia possiedono un'isola patogenica di 40 kB in cui mappano circa 30 geni, tale regione è detta cag-PAI Tale isola di patogenicità è comunemente assente nei ceppi di H. pylori isolati in organismi differenti dall’uomo (visione molecolare dei postulati di Koch). Isola di patogenicità cag (cag(cag-PAI) di Helicobacter pylori Questa regione Cag-PAI si riscontra mediamente nel 50-70% dei ceppi batterici isolati nei Paesi industrializzati; I ceppi portatori dei geni che codificano per questa regione (CagApositivi) sono più virulenti; Essi raggiungono una più alta densità batterica nella mucosa gastrica e causano una maggiore infiammazione rispetto ai ceppi CagA-negativi; Cag-PAI, codifica tra l’altro per un Sistema di Secrezione di tipo IV che permette l'iniezione diretta nelle cellule epiteliali gastriche di una serie di prodotti citotossici con funzioni effettrici; Tra questi i principali sono: VacA e CagA CagA, regolati da altri geni che mappano all’interno della PAI. Isola di patogenicità cag (cag(cag-PAI) di Helicobacter pylori Il gene cagA (cytotoxin associated gene A) codifica per CagA, una proteina che stimola la secrezione di IL-8 da parte delle cellule della mucosa gastrica; l‘IL-8 ricopre un ruolo di primo piano nell'induzione del processo infiammatorio responsabile dell’innesco della gastrite. Il gene cagA è considerato un marker della pericolosità di H. pylori, in quanto espressione della Cag-PAI. La presenza invece del gene vacA (vacuolating cytotoxin A) è indice di infezione VacA è una tossina vacuolizzante che provoca la fusione fra endosomi e lisosomi a livello delle cellule epiteliali gastriche. VacA favorisce la persistenza batterica nello strato mucoso dello stomaco e conferisce al batterio la capacità di sfuggire alla risposta immunitaria locale (macrofagica). La variazione genica Molte specie microbiche altamente patogene per l’essere umano hanno evoluto sofisticati meccanismi adattativi che gli consentono di eludere il sistema immunitario dell’ospite durante il loro ciclo infettivo: La variazione antigenica antigenica:: un meccanismo irreversibile che si basa sulla ricombinazione genica tra loci silenti e loci di espressione e che consente al batterio di variare le caratteristiche antigeniche dei principali determinanti di superficie. La variazione di fase: fase: che consiste nella oscillazione reversibile tra stati di espressione alternativi di un gene. Variazione antigenica ai loci delle piline 5’ 3’ PilE PilS1-6 Locus di Espressione Loci Silenti Capacità di elaborare delle versione antigenicamente differenti dei principali determinanti di superficie, Il processo si verifica mediante eventi di ricombinazione omologa irreversibile (doppio crossing over) tra loci silenti con il locus di espressione. Variazione di fase Si tratta di una oscillazione reversibile tra stati di espressione alternativi di un gene. Coinvolge sequenze ripetute, brevi tratti etero- o omo-polimerici che fiancheggiano le regioni espresse del gene. La variazione di fase della capsula di Neisseria meningitidis ad esempio coinvolge una breve ripetizione omopolimerica di residui di citosina localizzata nella porzione 5’-non tradotta del gene siaD, La variazione del numero di citosine causata da inserzioni o delezioni determina uno scivolamento della cornice di lettura con uno switching on-off del gene e quindi della capsula. Meccanismi di difesa dalle infezioni Meccanismi di difesa dalle infezioni L’esistenza dei meccanismi di difesa nei confronti delle infezioni era nota sin dall’antichità molto prima che si sviluppasse il concetto di sistema immunitario, questo perché era evidente come durante le epidemie alcuni individui non si ammalassero nonostante i ripetuti contatti stretti con soggetti malati. Le difese antibatteriche dell’organismo sono principalmente assicurate dal Microbiota residente e dal Sistema immunitario dell’ospite. dell’ospite La prima difesa a livello delle superfici è rappresentata dalla normale flora, che si acquisisce gradualmente dopo la nascita mediante la colonizzazione di diverse specie microbiche che costituiranno un complesso ecosistema. Questo microbiota entra in competizione per le fonti di nutrimento ed energia con un qualsiasi microbo esogeno in un meccanismo di Antagonismo microbico e sfavorisce la colonizzazione di specie microbiche esogene con la produzione di Batteriocine Batteriocine. Meccanismi di difesa Flora batterica residente: antagonismo microbico e batteriocine Barriere anatomiche: meccanismi chimico-fisici Le barriere anatomiche e chimiche rappresentano una barriera invalicabile per la maggioranza dei microrganismi. La cute intatta è infatti impenetrabile per qualsiasi microbo grazie alla presenza di cheratina, della secchezza ed dal suo pH acido. In aggiunta, il sebo contiene acidi grassi con un potente potere batteriostatico e battericida, e infine le ghiandole sudoripare producono Lisozima. Il processo di esfoliazione e l’attività dilavante delle secrezioni sfavoriscono ogni forma di colonizzazione. Meccanismi di difesa La capacità di resistere al sistema immunitario è un prerequisito fondamentale per qualsiasi tipo di colonizzazione microbica. I microbi devono eludere due meccanismi di risposta: Risposta immune innata innata:: meccanismi di risposta rapidi, non specifici e senza memoria immunologica, che cercano di bloccare l’invasione da parte del microrganismo Risposta immune adattative adattative:: meccanismi di risposta attivati in modo specifico verso il microrganismo invasore e dotati di memoria immunologica, che cercano di eradicare l’infezione e prevenire una successiva invasione da parte dello stesso microrganismo Evasione dei meccanismi difensivi dell’immunità naturale Meccanismi che evitano la fagocitosi - Presenza di capsula - Distruzione dei fagociti - Inibizione della opsonizzazione - Inibizione della fagocitosi Meccanismi che consentono ai batteri di sopravvivere nei fagociti - Inibizione della fusione fagolisosomica - Sopravvivenza all’interno del fagocita - Resistenza agli enzimi lisosomiali Evasione dei meccanismi difensivi dell’immunità naturale Rilascio di tossine: I fagociti possono essere distrutti dal rilascio di esotossine, un meccanismo di difesa molto utilizzato da Stafilococchi, Streptococchi ed Amebe. Impedimento dell’opsonizzazione: L’opsonizzazione è un meccanismo molto importante nell’attivazione del complemento, mediato dalla marcatura del patogeno per azione di opsonine che rivestendo la cellula favorendo l’adesione e la digestione da parte dei macrofagi. Alcuni batteri come gli Stafilococchi producono proteine che impediscono il legame tra gli anticorpi opsonizzanti ed i fagociti, impedendo così l’ingestione del batterio. Proteina A-Staphylococcus aureus La proteina A è una molecola di superficie che lega la regione Fc delle IgG inibendo il processo di opsonizzazione e la rimozione anticorpomediata del batterio. Evasione dei meccanismi difensivi dell’immunità naturale Ci sono alcuni patogeni in grado di sopravvivere nelle cellule ospiti come il Toxoplasma gondii e la Clamidia spp. che impediscono la fusione del fagosoma contenente il patogeno con il lisosoma, In alcuni casi il microrganismo evade dal fagolisosoma riversandosi nel citosol dove si replica come nel caso della Leishmania. Infine l’uccisione del microbo nel fagolisosoma avviene per azione di sostanze come intermedi dell’O2, idrolasi e fosfolipasi in un processo definito killing ossidativo ossidativo, che può essere bloccato da alcuni patogeni mediante la produzione di antiossidanti come la Catalasi prodotta da Stafilococchi e Neisserie. La catalasi è uno degli enzimi chiave nei meccanismi di resistenza al Killing ossidativo, La produzione di specie reattive dell’ossigeno è uno dei principali meccanismi di difesa dell’essere umano in risposta all’infezione di microrganismi patogeni. EVASIONE DEI MECCANISMI DIFENSIVI DELL’IMMUNITÀ ACQUISITA -Inattivazione di IgA secretorie: mediante la produzione di IgA proteasi che degradano le IgA secretorie e sieriche di tipo 1. -Mimetismo molecolare: presenza di Antigeni batterici molto simili o identici a quelli dell’ospite, riconosciuti come Self dall’organismo ospite. -Variazione genica: possibilità di variare periodicamente il proprio repertorio antigenico. -Esistenza di tipi antigenici multipli: molti batteri patogeni esistono in natura come tipi antigenici multipli in modo da aumentare la possibilità per la specie di “trovare” un ospite non immunizzato. -Induzione nell’ospite di uno stato di immunosoppressione: alcuni patogeni, causano uno stato di immunosoppressione nell’ospite che determina una ridotta capacità di rispondere a tutti gli Ag inclusi quelli del patogeno. -Localizzazione in siti inaccessibili: La replicazione intracellulare rende il patogeno inaccessibile all’azione degli anticorpi……così come la produzione di Biofilm!
