Sistemi di trasporto e secrezione delle cellule batteriche
•Un aspetto interessante della virulenza batterica è rappresentato dai sistemi
di trasporto;
•Un mezzo utilizzato dai patogeni per bersagliare le cellule ospiti
direttamente con fattori di patogenicità (o con molecole effettrici) che
influenzano la cellula ospite e ne alterano la fisiologia;
•I geni codificanti le proteine di tali sistemi sono localizzati in isole di
patogenicità (PAI) o in elementi genetici extracromosomici come plasmidi.
Sistemi dipendenti da Sec a due
passaggi:
coinvolti nella produzione di molte tossine
e nella biogenesi dei Pili di tipo IV
Sistemi indipendenti da Sec ad
un passaggio:
tipo I, trasportatori ABC e tipo III
Il sistema Sec è un sistema secretorio costituito da una traslocasi
in grado di trasportare proteine all’esterno della membrana o di
inserirle nella membrana nel giusto orientamento
orientamento..
Sistemi di secrezione di tipo III
I sistemi di secrezione di tipo III
sono stati ben caratterizzati in
diversi batteri patogeni Gram-;
Sono sistemi composti da un
complesso
di
oltre
20
proteine;
Tali proteine si assemblano in
un canale altamente regolato
che attraversa la membrana
interna, il periplasma e la
membrana esterna, con un
meccanismo a guisa di siringa
munita di relativo ago da
iniezione che penetra nella
membrana
della
cellula
bersaglio.
Membrana cellula ospite
Membrana batterica esterna
Periplasma
Membrana batterica interna
Tipo III
ATP binding protein
Sistemi di secrezione di tipo III
Il processo di secrezione dei sistemi di tipo III è innescato quando il
patogeno entra in stretto contatto con la cellula ospite, è infatti
definito ContattoContatto-Dipendente.
Dipendente
Questo sistema è usato da numerosi batteri patogeni come:
Salmonelle, Shigelle, Yersinie, E. coli EPEC e EHEC, Vibrioni,
Pseudomonas aeruginosa.
Possono essere a codificazione Cromosomica o extracromosomica:
-Il sistema delle Salmonelle è codificato da 3 isole di patogenicità
(PAI) localizzate nel genoma batterico (Cromosomiche)
-Nelle Shigelle i geni codificanti il sistema di secrezione di tipo III
sono situati invece in un plasmide (Extracromosomiche)
Una volta secrete nella cellula bersaglio le molecole del batterio ne
alterano la fisiologia per favorire la replicazione e la sopravvivenza
del patogeno (es. Riarrangiamento del citoscheletro)
Penetrazione e disseminazione nei tessuti
profondi dell’ospite
Fattori e Meccanismi di Diffusione
Penetrazione e disseminazione nei tessuti
La maggior parte dei batteri patogeni per iniziare il processo
infettivo penetra nell’epitelio mediante differenti meccanismi
di invasione.
Il processo di penetrazione e la successiva diffusione dei
microrganismi sono fortemente facilitati dalla secrezione di
enzimi con funzione di fattori di invasione.
L’invasione dei tessuti dell’ospite può quindi essere facilitata
dalla produzione di proteine extracellulari che agiscono
localmente per facilitare la crescita e la diffusione del
patogeno e/o per danneggiare le cellule dell’ospite, tali
proteine sono definite INVASINE.
FATTORI DI DIFFUSIONE:
DIFFUSIONE: INVASINE
Ialuronidasi
(Streptococchi, Stafilococchi, Clostridi), Degrada l’acido ialuronico
che svolge funzioni di collante nei tessuti;
Collagenasi
(Clostridium histolyticum, C. perfringens), Degrada la trama di
collagene che sostiene i tessuti favorendo la diffusione
Neuraminidasi
(Vibrio cholerae, Shigella dysenteriae), Favorisce la diffusione
locale degradando le mucosa (orofaringea, intestinale ecc)
Chinasi
(Streptococchi, Stafilococchi),
corrispondenza di una lesione tissutale;
Elastasi
Dissolve
i
coaguli
di
fibrina
in
(P. aeruginosa), Degradare il collagene e le giunzioni strette nei tessuti,
favorendo cheratiti ed infezioni polmonari.
Una peculiare invasina:
invasina: la COAGULASI
•Alcuni microrganismi sintetizzano enzimi che promuovono la
formazione di coaguli di fibrina che permettono al
microrganismo, piuttosto che diffondere, di rimanere
localizzato e protetto.
•Il più studiato di questi enzimi è la Coagulasi prodotta dallo
Stafilococcus aureus, che induce la formazione di un deposito
di fibrina sui cocchi stessi, proteggendoli, quindi dall’attacco
delle cellule immunitarie dell’ospite.
Produzione di Coagulasi = Potenziale Patogeno
Il Test della Coagulasi è utilizzato nella pratica per
l’identificazione di S. aureus
Si mescola, in una provetta, una piccola
quantità (0,5 ml) di una coltura batterica in
terreno liquido dello Stafilococco in esame con 1
o 2 ml di plasma;
Si incuba la coltura a 37°C;
Nel caso di Stafilococchi patogeni, entro 3 ore
si produce un evidente Coagulo
Coagulo, mentre gli
Stafilococchi non-patogeni lasciano inalterata la
fluidità della miscela.
Fattori di diffusione: Enzimi che causano digestione
Tra le proteine extracellulari che promuovono la patogenesi batterica
favorendo lo stabilirsi ed il mantenimento della malattia ci sono altre
proteine secrete nello spazio extracellulare con funzioni digestive:
Proteasi:: catalizzano la rottura del legame peptidico.
Proteasi
Lipasi: trasformano i trigliceridi in glicerolo.
Glicoidrolasi:: degradano il maltosio.
Glicoidrolasi
Nucleasi: degradano il legame fosfodiestere negli ac.
nucleici
Fattori di diffusione: Enzimi che causano citolisi
Alcuni microrganismi patogeni in fase di crescita per poter diffondere
dal focolaio di infezione verso altre parti del corpo, provocando danno in
siti distanti, da quello d’ingresso, rilasciano tossine
che sono enzimi che attaccano costituenti cellulari
citolitiche
Alcuni patogeni producono molecole in grado di danneggiare la
membrana citoplasmatica delle cellule ospiti causandone la lisi e molte
citotossine agiscono sui globuli rossi causandone la lisi,
Tali molecole sono dette Emolisine
Emolisine, facilmente evidenziabili come
attività facendo crescere i batteri in terreni di coltura contenenti sangue.
Durante la crescita del batterio l’emolisina rilasciata lisa gli eritrociti
generando un alone di emolisi che può essere parziale (alfa emolisi) o
completa (beta emolisi).
Emolisi parziale
Emolisi completa
Fattori di diffusione: Enzimi che causano citolisi
Alcune emolisine attaccano i fosfolipidi di membrana soprattutto
la fosfatidilcolina questi enzimi sono detti Fosfolipasi,
Un tipico esempio è la fosfolipasi del Clostridium perfrigens in
grado di degradare la membrana di cellule sia eucariotiche che
procariotiche (contenenti entrambi fosfolipidi).
Tale tossina è prodotta da tutti i ceppi di Clostridium perfringens,
è definita Fosfolipasi C ed ha attività litica verso eritrociti,
leucociti e cellule endoteliali.
Ciò provoca aumento della permeabilità vascolare, emolisi,
sanguinamento e distruzione dei tessuti con disseminazione del
batterio manifestazioni tipiche della gangrena gassosa.
Meccanismi di penetrazione
Sostanzialmente i batteri possono penetrare nella cellula
e nel tessuto ospite mediante due meccanismi:
1) Distruzione del tessuto
tessuto:: i batteri diffondono grazie a danni
fisici generati con la produzione di enzimi degradativi e litici
extracellulari.
2) Meccanismi invasivi
invasivi:: consentono al batterio di penetrare
direttamente nelle cellule dell’epitelio senza generare un danno fisico
mediante cioè un processo di endocitosi (utilizzati anche per
penetrare nei fagociti professionali);
1) Un tipico esempio è rappresentato da S. aureus
2) Un tipico esempio sono i meccanismi delle Neisserie patogene e
di batteri come Shigella ed E. coli.
Batteri che si internalizzano in cellule non
non--immuni mediante invasine
Transcitosi
Alcuni batteri producono Adesine e Invasine che attivano l’apparato citoscheletrico
della cellula ospite permettendo al batterio di entrare nella cellula per fagocitosi.
Tali batteri, come le Neisserie patogene, possiedono un Sistema di Secrezione di
tipo III
III..
Quando il batterio contatta le cellule eucariotiche, secerne al loro interno proteine che
rendono tali cellule capaci di inglobare il batterio, all’interno di un vacuolo.
Successivamente il batterio viene liberato dal vacuolo e si moltiplica nel citoplasma
della cellula o liberato nello spazio sottomucoso per esocitosi.
Meccanismi di penetrazione: E. coli Enteropatogeni (EPEC)
I ceppi di E. coli enteropatogeni sono privi di potere tossinogeno o invasivo,
ma sono dotati di un particolare carattere di adesività localizzata alle cellule
dell’intestino tenue.
I ceppi EPEC formano micro-colonie simili a calici sulla superficie delle
cellule epiteliali, con i batteri attaccati alle cellule ospiti attraverso strutture a
piedistallo.
Inizialmente si ha una debole adesione mediata da Pili a fascio BFp,
BFp
Successivamente si verifica una secrezione attiva di proteine da parte di un
sistema di secrezione di tipo III, nella cellula epiteliale ospite,
In particolare è secreta la proteina Tir che funge da recettore dell’intimina
dell’intimina
insieme ad altre 2 proteine, che nel complesso costituiscono il recettore per
l’INTIMINA,
INTIMINA, una molecola di membrana esterna del batterio.
Il batterio altera così la struttura cellulare con riarrangiamento dell’actina e la
formazione di una struttura a piedistallo.
Ciò determina la distruzione dei microvilli che porterà ad una sindrome di
malassorbimento e diarrea
Immagine schematica e
che mostra EPEC aderenti
all’orletto a spazzola delle
cellule
della
mucosa
intestinale con evidente
distruzione localizzata dei
microvilli.
Il complesso intimina-TIR è codificato da un gene cromosomale eae
Meccanismi invasivi
Tra gli enterobatteri di particolare interesse per il loro
meccanismo di invasione c’è il genere Shigella.
Questo batterio privo di flagelli è in grado di passare attraverso
la mucosa intestinale invadendo le cellule epiteliali.
E’ stato proposto un probabile modello per l'invasione delle
cellule epiteliali del colon da parte di Shigella, denominato
Actin based motility
Probabile modello per l'invasione delle cellule
epiteliali del colon
1)
Shigella passa la mucosa attraverso cellule specializzate chiamate cellule M.
Dalla cellula M, Shigella passa ad un macrofago da cui successivamente
fuoriesce.
2)
Shigella utilizza le sue invasine per entrare nelle cellule epiteliali della mucosa
dalla parte basale. Le invasine causano riarrangiamenti del citoscheletro delle
cellule ospiti che determinano l’endocitosi del batterio all’interno di vescicole. Una
volta dentro la cellula, Shigella fuoriesce dal vacuolo e si moltiplica nel citoplasma.
3)
Le Shigelle sono in grado di muoversi attraverso la cellula ospite e diffondere alle
cellule ospiti adiacenti mediante un processo unico chiamato actin-based
motility.
4)
In questo processo, i filamenti di actina polimerizzano ad una estremità del
batterio, producendo code simili a comete che spingono il batterio attraverso il
citoplasma della cellula ospite.
5)
Quando raggiungono l’estremità della cellula, i filamenti di actina spingono
Shigella attraverso tutta la membrana e quindi nella cellula adiacente.
Tipi di Meccanismi invasivi
Il genoma procariotico
Il genoma procariotico
Isole di Patogenicità (Pathogenicity Islands,
Islands, PAI)
Regioni del cromosoma in grado di codificare per uno o più
determinanti di virulenza.
Sono caratterizzate da tratti di DNA eterologo per la presenza di
elementi genetici mobili derivanti da scambi genetici orizzontali:
Sequenze d’inserzione; geni plasmidici; geni fagici.
Caratterizzano la patogenicità di batteri di una stessa specie
differenziandoli da batteri non patogeni.
Caratteristiche delle isole di patogenicità:
1. Sono assenti nei corrispondenti ceppi avirulenti.
2. Il contenuto in G-C è diverso dal resto del cromosoma.
3. Presentano alle estremità sequenze ripetute/ inserzione.
4. Contengono elementi genetici mobili (transposoni).
5. Sono instabili, presentano meccanismi di variazione
genetica.
6. E’ possibile identificarle mediante tecniche di ibridazione
molecolare
Regioni con contenuto di GC anomalo
L’analisi del contenuto anomalo di GC (mediante sequenziamento), consente di
identificare la presenza di PAI che derivano da scambi genetici orizzontali con DNA
acquisito da altre specie batteriche. L’identificazione delle PAI nel genoma batterico è
indice di un elevato tasso di variabilità nella specie batterica.
GC totale 47.3%
52.7%
54%
44.3%
42.5%
DNA acquisito da altre specie
L’assetto chimico del segmento donato è differente da quello del
cromosoma del batterio ricevente
FATTORI DI VIRULENZA CODIFICATI DALLE PAI
1. Sistemi di secrezione
2. Interferenza con il sistema immune
3. Adesività e colonizzazione
4. Modulatori di funzioni della cellula ospite
5. Internalizzazione/invasione
6. Sopravvivenza/moltiplicazione intracellulare
7. Sottrazione di nutrienti (es: ferro)
Isole di patogenicità in ceppi di E. coli uropatogeni e enteropatogeni
Nei ceppi di E. coli uropatogeni sono state individuate diverse PAI:
Un’isola di patogenicità codifica per una α-emolisina e per i pili P,
fondamentali per il patogeno per legarsi ai P-glicolipidi delle cellule
epiteliali uretrali e renali in modo da resistere al flusso dell’urina e
alla peristalsi uretrale.
Una seconda PAI codifica per altre fimbrie,
per l’emolisina II e per il fattore tossico necrotizzante.
Inoltre in ceppi di E. coli enteropatogeni isolati da feci di soggetti affetti da diarrea
sono presenti isole di patogenicità con raggruppamenti di geni di virulenza
responsabili dell’attacco dei batteri alle cellule ospiti, della perdita dei villi
intestinali e del profondo riarrangiamento del citoscheletro cellulare.
Isola di patogenicità cag (cag(cag-PAI) di Helicobacter pylori
Helicobacter pylori colonizza lo strato mucoso della
parete gastrica dell’uomo, provocando nella maggior
parte de soggetti colonizzati infiammazione gastrica
(cronica, superficiale, asintomatica).
E’ un batterio gram-negativo, spiraliforme, microaerofilo e ureasi positivo.
La persistenza dei batteri è legata alla mobilità assicurata dai flagelli insieme
alla capacità di produrre enzimi, come l’UREASI in grado di degradare la
mucina gastrica.
L'ureasi è un enzima, appartenente alla classe delle idrolasi, che catalizza
l'idrolisi dell'urea in CO2 e NH3 e neutralizza l'effetto dei succhi gastrici.
(NH2)2CO + H2O
CO2 + 2 NH3
Isola di patogenicità cag (cag(cag-PAI) di Helicobacter pylori
Ad'oggi conosciamo vari ceppi di H. pylori, suddivisi in modo anche
minimale, tra loro.
Due stipiti risultano altamente virulenti per l’uomo e mostrano
grandi differenze tra loro, con più del 6% della differenza genomica.
L’analisi del genoma ha individuato 62 geni coinvolti nella
patogenesi dell’infezione di questi stipiti batterici.
Entrambi i ceppi tuttavia possiedono un'isola patogenica di 40 kB in
cui mappano circa 30 geni, tale regione è detta cag-PAI
Tale isola di patogenicità è comunemente assente nei ceppi di H.
pylori isolati in organismi differenti dall’uomo (visione molecolare dei
postulati di Koch).
Isola di patogenicità cag (cag(cag-PAI) di Helicobacter pylori
Questa regione Cag-PAI si riscontra mediamente nel 50-70% dei
ceppi batterici isolati nei Paesi industrializzati;
I ceppi portatori dei geni che codificano per questa regione (CagApositivi) sono più virulenti;
Essi raggiungono una più alta densità batterica nella mucosa
gastrica e causano una maggiore infiammazione rispetto ai ceppi
CagA-negativi;
Cag-PAI, codifica tra l’altro per un Sistema di Secrezione di tipo IV
che permette l'iniezione diretta nelle cellule epiteliali gastriche di una
serie di prodotti citotossici con funzioni effettrici;
Tra questi i principali sono: VacA e CagA
CagA, regolati da altri geni
che mappano all’interno della PAI.
Isola di patogenicità cag (cag(cag-PAI) di Helicobacter pylori
Il gene cagA (cytotoxin associated gene A) codifica per CagA, una proteina
che stimola la secrezione di IL-8 da parte delle cellule della mucosa gastrica;
l‘IL-8 ricopre un ruolo di primo piano nell'induzione del processo
infiammatorio responsabile dell’innesco della gastrite.
Il gene cagA è considerato un marker della pericolosità di H. pylori, in quanto
espressione della Cag-PAI.
La presenza invece del gene vacA (vacuolating cytotoxin A) è indice di
infezione
VacA è una tossina vacuolizzante che provoca la fusione fra endosomi e
lisosomi a livello delle cellule epiteliali gastriche.
VacA favorisce la persistenza batterica nello strato mucoso dello stomaco e
conferisce al batterio la capacità di sfuggire alla risposta immunitaria locale
(macrofagica).
La variazione genica
Molte specie microbiche altamente patogene per l’essere umano
hanno evoluto sofisticati meccanismi adattativi che gli consentono
di eludere il sistema immunitario dell’ospite durante il loro ciclo
infettivo:
La variazione antigenica
antigenica:: un meccanismo irreversibile che si basa
sulla ricombinazione genica tra loci silenti e loci di espressione e che
consente al batterio di variare le caratteristiche antigeniche dei principali
determinanti di superficie.
La variazione di fase:
fase: che consiste nella oscillazione reversibile tra
stati di espressione alternativi di un gene.
Variazione antigenica ai loci delle piline
5’
3’
PilE
PilS1-6
Locus di Espressione
Loci Silenti
Capacità di elaborare delle versione antigenicamente
differenti dei principali determinanti di superficie,
Il processo si verifica mediante eventi di ricombinazione
omologa irreversibile (doppio crossing over) tra loci silenti
con il locus di espressione.
Variazione di fase
Si tratta di una oscillazione reversibile tra stati di espressione
alternativi di un gene. Coinvolge sequenze ripetute, brevi tratti etero- o
omo-polimerici che fiancheggiano le regioni espresse del gene.
La variazione di fase della capsula di Neisseria meningitidis ad esempio
coinvolge una breve ripetizione omopolimerica di residui di citosina localizzata
nella porzione 5’-non tradotta del gene siaD,
La variazione del numero di citosine causata da inserzioni o delezioni
determina uno scivolamento della cornice di lettura con uno switching on-off
del gene e quindi della capsula.
Meccanismi di difesa dalle infezioni
Meccanismi di difesa dalle infezioni
L’esistenza dei meccanismi di difesa nei confronti delle infezioni era nota sin
dall’antichità molto prima che si sviluppasse il concetto di sistema
immunitario, questo perché era evidente come durante le epidemie alcuni
individui non si ammalassero nonostante i ripetuti contatti stretti con soggetti
malati.
Le difese antibatteriche dell’organismo sono principalmente assicurate dal
Microbiota residente e dal Sistema immunitario dell’ospite.
dell’ospite
La prima difesa a livello delle superfici è rappresentata dalla normale flora,
che si acquisisce gradualmente dopo la nascita mediante la colonizzazione di
diverse specie microbiche che costituiranno un complesso ecosistema.
Questo microbiota entra in competizione per le fonti di nutrimento ed
energia con un qualsiasi microbo esogeno in un meccanismo di
Antagonismo microbico e sfavorisce la colonizzazione di specie microbiche
esogene con la produzione di Batteriocine
Batteriocine.
Meccanismi di difesa
Flora batterica residente: antagonismo microbico e batteriocine
Barriere anatomiche: meccanismi chimico-fisici
Le barriere anatomiche e chimiche rappresentano una barriera
invalicabile per la maggioranza dei microrganismi.
La cute intatta è infatti impenetrabile per qualsiasi microbo grazie
alla presenza di cheratina, della secchezza ed dal suo pH acido.
In aggiunta, il sebo contiene acidi grassi con un potente potere
batteriostatico e battericida, e infine le ghiandole sudoripare
producono Lisozima.
Il processo di esfoliazione e l’attività dilavante delle secrezioni
sfavoriscono ogni forma di colonizzazione.
Meccanismi di difesa
La capacità di resistere al sistema immunitario è
un prerequisito fondamentale per qualsiasi tipo
di colonizzazione microbica. I microbi devono
eludere due meccanismi di risposta:
Risposta immune innata
innata:: meccanismi di risposta rapidi, non
specifici e senza memoria immunologica, che cercano di bloccare
l’invasione da parte del microrganismo
Risposta immune adattative
adattative:: meccanismi di risposta attivati
in modo specifico verso il microrganismo invasore e dotati di
memoria immunologica, che cercano di eradicare l’infezione e
prevenire una successiva invasione da parte dello stesso
microrganismo
Evasione dei meccanismi difensivi dell’immunità naturale
Meccanismi che evitano la fagocitosi
- Presenza di capsula
- Distruzione dei fagociti
- Inibizione della opsonizzazione
- Inibizione della fagocitosi
Meccanismi che consentono ai batteri di sopravvivere nei
fagociti
- Inibizione della fusione fagolisosomica
- Sopravvivenza all’interno del fagocita
- Resistenza agli enzimi lisosomiali
Evasione dei meccanismi difensivi dell’immunità naturale
Rilascio di tossine: I fagociti possono essere distrutti dal rilascio di esotossine, un
meccanismo di difesa molto utilizzato da Stafilococchi, Streptococchi ed Amebe.
Impedimento dell’opsonizzazione: L’opsonizzazione è un meccanismo molto
importante nell’attivazione del complemento, mediato dalla marcatura del patogeno
per azione di opsonine che rivestendo la cellula favorendo l’adesione e la digestione
da parte dei macrofagi.
Alcuni batteri come gli Stafilococchi producono proteine che impediscono il legame
tra gli anticorpi opsonizzanti ed i fagociti, impedendo così l’ingestione del batterio.
Proteina A-Staphylococcus aureus
La proteina A è una molecola di superficie che lega la regione Fc delle
IgG inibendo il processo di opsonizzazione e la rimozione anticorpomediata del batterio.
Evasione dei meccanismi difensivi dell’immunità naturale
Ci sono alcuni patogeni in grado di sopravvivere nelle cellule ospiti come il
Toxoplasma gondii e la Clamidia spp. che impediscono la fusione del fagosoma
contenente il patogeno con il lisosoma,
In alcuni casi il microrganismo evade dal fagolisosoma riversandosi nel citosol dove si
replica come nel caso della Leishmania.
Infine l’uccisione del microbo nel fagolisosoma avviene per azione di sostanze come
intermedi dell’O2, idrolasi e fosfolipasi in un processo definito killing ossidativo
ossidativo, che
può essere bloccato da alcuni patogeni mediante la produzione di antiossidanti come
la Catalasi prodotta da Stafilococchi e Neisserie.
La catalasi è uno degli enzimi chiave nei meccanismi di
resistenza al Killing ossidativo,
La produzione di specie reattive dell’ossigeno è uno dei
principali meccanismi di difesa dell’essere umano in
risposta all’infezione di microrganismi patogeni.
EVASIONE DEI MECCANISMI DIFENSIVI DELL’IMMUNITÀ ACQUISITA
-Inattivazione di IgA secretorie:
mediante la produzione di IgA proteasi che degradano le
IgA secretorie e sieriche di tipo 1.
-Mimetismo molecolare:
presenza di Antigeni batterici molto simili o identici a quelli
dell’ospite, riconosciuti come Self dall’organismo ospite.
-Variazione genica:
possibilità di variare periodicamente il proprio repertorio
antigenico.
-Esistenza di tipi antigenici multipli:
molti batteri patogeni esistono in natura come tipi antigenici multipli in
modo da aumentare la possibilità per la specie di “trovare” un ospite
non immunizzato.
-Induzione nell’ospite di uno stato di immunosoppressione:
alcuni patogeni, causano uno stato di immunosoppressione nell’ospite
che determina una ridotta capacità di rispondere a tutti gli Ag inclusi
quelli del patogeno.
-Localizzazione in siti inaccessibili:
La replicazione intracellulare rende il patogeno inaccessibile all’azione
degli anticorpi……così come la produzione di Biofilm!
