l`espressione della proteina nef del virus hiv

L’ESPRESSIONE DELLA PROTEINA NEF DEL VIRUS HIV-1 DETERMINA
L'ALTERAZIONE DELLE CARATTERISTICHE ELETTROFISIOLOGICHE DI UNA
LINEA CELLULARE LINFOBLASTOIDE
O. Zegarra-Moran*, A. Rasola#, B. Rossi# e L.J.V. Galietta*
*Laboratorio di Genetica Molecolare, Istituto G. Gaslini, L.go G. Gaslini 5, Genova-16148. #Unité de
recherches en immulologie cellulaire et moléculaire, Inserm, 06107-Nice
Nef é una proteina del virus HIV. La sua presenza sembra essere necessaria per la replicazione virale e per
lo sviluppo della patologia associata al AIDS. Nonostante vari studi abbiano dimostrato svariati aspetti delle
funzioni che Nef può svolgere, il meccanismo d'azione di questa proteina rimane poco chiaro. Nef é miristolato e
questa modificazione posttranslazionale gli permette di associarsi alle membrane cellulari. Questa particolare
localizzazione di Nef ci ha permesso d'ipotizare che la proteina possa interagire con altre proteine di membrana
come i canali ionici. Per testare questa ipotesi abbiamo studiato le proprietà elettrofisiologiche delle cellule
CEM, una linea linfoblastoide CD4+, e le abbiamo confrontato con quelle di cellule CEM trasfettate con Nef
(CEM/Nef). Il potenziale di riposo nelle cellule CEM/Nef é risultato di 20 mV più depolarizzato che nelle
cellule CEM (VCEM = -51,9±2,9 mV, VNef = -32,7±1,8 mV, n=10 per ogni linea). L'uso del chelante del Ca2+
permeabile alla membrana Bapta/AM, oppure della Charibdotossina, causano una depolarizazione di 20 mV
nelle cellule CEM senza alterare il potenziale di riposo delle CEM/Nef. Questo suggerisce che un canale del K+
attivato dal Ca2+ e sensibile alla Charibdotossina determini il potenziale di riposo delle cellule native, ma non
nelle cellule trasfettate con Nef, nelle quali tale canale sarebbe inattivo. Esperimenti di voltage-clamp nella
configurazione di patch-perforato hanno confermato che a riposo le cellule CEM mostrano l'attività di un canale
del K+ Ca2+-dipendente e voltaggio-indipendente (44,8±12,5 pA/pF a -100 mV con 160 mM di K+ simmetrico) e
che questo canale non é attivo nelle cellule CEM/Nef. Lo studio di singolo canale in inside-out patch hanno
dimostrato la presenza, tanto nelle cellule CEM come nelle CEM/Nef, di un canale del K+ Ca2+-dipendente con
una conduttanza di circa 35 pS e con una attivazione media a concentrazioni di Ca2+ di 400 nM. In conclusione,
la presenza di Nef causa una depolarizazione della cellula di 20 mV. Questa depolarizazione é dovuta a inattività
di un canale del K+ Ca2+-dipendente di conduttanza intermedia. Dato che il canale é presente nella membrane
delle cellule (esperimenti in inside-out), si puo escludere che Nef abbia un effeto sulla trascrizione o sul
inserimento del canale nella membrana. E' possibile che Nef causi un blocco del poro oppure che modifichi
l'affinità del canale per il Ca2+. Anche se meno probabile, non possiamo escludere che Nef agisca sui sistemi
tampone per il Ca2+ intracellulari determinando una minore concentrazione di Ca2+ citoplasmatico. La messa a
punto di esperimenti mirati a chiarire queste domande potranno indicare il meccanismo attraverso il quale Nef
inibisce il canale.