Jessica Caprioli - Istituto di Ricerche Farmacologiche Mario Negri

Jessica Caprioli
Istituto di Ricerche Farmacologiche Mario Negri
Centro di ricerche cliniche per le Malattie Rare
Aldo e Cele Daccò, Ranica
Dipartimento di Medicina Molecolare
Genetica:
metodi di studio e
applicazioni in medicina
Come è organizzata questa
lezione
• 
Introduzione • 
• 
Diapositive teoriche: sfondo blu
Diapositive relative ad un esempio
reale: sfondo azzurro
Che cosʼè la genetica
• 
• 
• 
• 
Eʼ la scienza che studia i geni e in
particolare la loro:
Struttura
Funzione
Trasmissione
Si occupa inoltre di identificare le
alterazioni dei geni che producono
malattie e come queste alterazioni
vengono trasmesse.
1866
Gregor Mendel (1822-1884) pubblica il
suo lavoro “Experiments in Plant
Hybridisation” e stabilisce le leggi
dellʼereditarietà.
- dominanza (F1 omogenea per un dato carattere)
-  segregazione dei caratteri (incrociando individui
della F1 in carattere recessivo ricompare nella F2)
-  assortimento independente dei caratteri (segue la
trasmissione di due caratteri diversi nelle generazioni)
1908
Archibald E. Garrod (1857-1936)
postula che i difetti genetici
causano
molte
malattie
ereditarie.
A causa di un difetto genetico, i pazienti
con alcaptonuria sono privi di un enzima
del metabolismo. Il risultato di tale deficit
è un accumulo di un composto chimico
che rende scure le urine.
1953
James Watson e Francis Crick scoprono la struttura
tridimensionale del DNA e subito dopo ne deducono il
meccanismo di replicazione.
DNA
LA STRUTTURA DEL DNA
•  Lineare, a doppia elica: due
catene attorcigliate, orientate
in senso opposto lʼuna rispetto
allʼaltra
•  Struttura portante di ciascuna
catena è composta da un
polimero costante: zuccherofosfato-zucchero-fosfato
•  Ad ogni zucchero (desossiribosio) si
lega una base o nucleotide
•  4 basi: Adenina (A) Citosina (C) Guanina (G)
Timina (T) Ogni uomo è formato da
100 miliardi di cellule
Ogni cromosoma è un piccolo
bastoncello formato da una
lunga molecola attorcigliata su
se stessa, il DNA
Ogni cellula contiene nel
proprio nucleo 46 cromosomi:
23 di origine paterna e 23 di
origine materna
DNA
Il genoma è organizzato in 46
cromosomi (capitoli del codice)
e i geni sono contenuti nei
cromosomi. Ciascun cromosoma è lungo circa
50 mm e quindi in ogni cellula
sono contenuti circa 2 m di DNA.
Il codice genetico è il manuale di istruzioni per il
corretto funzionamento della cellula
15 February 2001 16February 2001
…..AGCTAACTGG
TACTAGTCAGGTA
CTCCTAGCA…..
CHE COSA SONO I GENI
Il codice genetico è il manuale
di istruzioni per il corretto
funzionamento della cellula
I geni sono le istruzioni
necessarie alla cellula per
compiere tutte le sue funzioni
vitali
…..AGCTAACTGGTACTAGT
CAGGTACTCCTAGCA…..
DNA
Dal gene alla proteina
Transcription
La funzione principale di
ogni gene è la formazione
di proteine
Funzioni di una proteina: - strutturale
- enzimatica
-  di controllo
Transcribed strain
Translation
Codon
Nucleus
Cytoplasm
Anticodon
Growing
polypeptide
chain
tRNA
GENI
Gene alterato
PROTEINE
Proteine alterate
Malattia
Predisposizione
alla malattia
Le mutazioni
Come si possono identificare le mutazioni?
La malattia ha una componente genetica? 1) Studio delle famiglie
2) Identificazione dellʼarea genomica di interesse
Individuazione del gene mutato
3) Studio del DNA e identificazione della mutazione
4) Verifica dellʼeffetto funzionale della mutazione
A cosa serve identificare le mutazioni?
A compiere una diagnosi corretta
A identificare i soggetti a rischio (medicina
preventiva)
1) Studio delle famiglie
sono causate da un singolo gene
Ripercorriamo con un esempio quanto visto finora
LA SINDROME EMOLITICO-UREMICA
Malattia multisistemica caratterizzata da anemia emolitica e
trombocitopenia, con predominante, ma non esclusivo,
coinvolgimento renale.
male
= dead
female
= unaffected to date
= affected
= probably affected
= spontaneous abortion
La malattia ha una componente genetica? 1) Studio delle famiglie
2) Identificazione dellʼarea genomica di interesse
- Quali sono le caratteristiche della patologia?
- Eʼ possibile supporre che alcune proteine e quindi alcuni
geni possano essere coinvolti? In altre parole, abbiamo uno
o più geni candidati? 2) Identificazione dellʼarea genomica di interesse: lʼanalisi di linkage
I MARCATORI POLIMORFICI
I MICROSATELLITI
PRIMER
RIPETIZIONI CA
individui
a b c d
PRIMER
24 ripetizioni
23 ripetizioni
22 ripetizioni
21 ripetizioni
La PCR
Denaturazione a 94°
Annealing dei primers
Ripetendo questo procedimento per 20-35 volte si
ottengono più di 2.000.000 di copie del frammento di
DNA di interesse che può essere visualizzato
facilmente e utilizzato per il sequenziamento.
2) Identificazione dellʼarea genomica di interesse: lʼanalisi di linkage Chromosome 1
1q32
Gene
di interesse D1S412 3
5
7
1
3
7
3
7
5
1
D1S2816 2
3
3
2
2
3
2
3
3
2
D1S413 2
7
7
6
2
7
2
7
7
6
D1S2738 2
2
2
3
2
2
2
2
2
3
F F
M M F M
F M
FM
I due soggetti affetti ereditano dal padre lo stesso
tratto cromosomico nellʼintorno del gene di interesse:
è probabile quindi che questo sia il gene responsabile
della malattia in questa famiglia.
La malattia ha una componente genetica? 1) Studio delle famiglie
2) Identificazione dellʼarea genomica di interesse
- A volte non è possibile individuare alcun gene candidato.
- In questi casi è possibile estendere lʼanalisi di linkage a
tutto il genoma, fino ad individuare la regione candidata.
Allʼinterno di tale regione si cercherà poi il gene
responsabile della malattia.
La malattia ha una componente genetica? 1) Studio delle famiglie
2) Identificazione dellʼarea genomica di interesse
Individuazione del gene mutato
3) Studio del gene e identificazione della mutazione
4) Verifica dellʼeffetto funzionale della mutazione
Il sequenziamento
Normale
TCT TTC ATC ATG TTC TCC
Ser Phe Ile Met Phe Ser
Mutato
TCT TTC ATC ACG TTC TCC
Ser Phe Ile Thr Phe Ser
Caso clinico
Paziente di 21 anni in emodialisi in seguito a ripetuti episodi di SEU
Fratello con storia di SEU
Genitori sani
Analisi genetiche
Normale
Mutato
G
A C A C A A T
T G T C T G T
Asp
Thr
Ile
Val
Cys
A A T T G
T C T G T G A
Asn
Cys
Leu
Stop
COME CAMBIERAʼ LA MEDICINA?
Individuazione del genotipo
Comprensione del
difetto biologico
Terapia mirata
C3b
Fattore B
Il sistema del complemento si attiva
Cellula batterica
MCP
Fattore B
C3b
Fattore H
nucleo
Cellula umana
Il sistema del complemento non si attiva
Le cellule dell’organismo sono protette
Fattore H
Prodotto principalmente
dalle cellule del fegato
Fattore H
COME CAMBIERAʼ LA MEDICINA?
Individuazione del genotipo
Comprensione del
difetto biologico
Terapia mirata: il trapianto di rene non
funziona, ma è possibile ad esempio
infondere la proteina normale (come
lʼinsulina nel caso dei diabetici)
MCP
MCP
C3b
+ Fattore I
nucleo
nucleo
Cellula umana
C3b
inattivato
Cellula umana
MCP
normale
MCP
alterato
nucleo
(45.3-46.5)
Padre
(33.1-39.6)
Fratello
50
45
40
35
30
25
20
15
10
5
0
Paziente
MCP, mediana dell’intensità di
fluorescenza
Cellula umana
Soggetti con mutazione
Madre
Controlli
dializzati
Controlli
sani
MCP
E’ possibile che la disfunzione in MCP,
che e’ una proteina di membrana
altamente espressa nel rene, possa
essere corretta trapiantando un rene
normale?
CASO CLINICO: B.A. una giovane donna con SEU
Agosto 1994, a 25 anni:
Diagnosi: SEU
Gennaio 1995:
Progressivo deterioramento della funzione renale
Severa, intrattabile ipertensione
Nefrectomia bilaterale:
Remissione completa dei processi microangiopatici
Pressione sanguigna normalizzata, emodialisi
Giugno 1995:
Riceve un trapianto di rene
Nessun segno di ricorrenza, fino ad oggi buona funzione renale
Ottobre 2003: analisi genetiche
Nessuna mutazione al Fattore H Mutazione nel gene di MCP COME CAMBIERAʼ LA MEDICINA?
Individuazione del genotipo
Comprensione del
difetto biologico
Terapia mirata
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