I regolatori del ciclo cellulare

ANALISI CITOFLUORIMETRICA DEL
DNA E IMMUNOMARCATORI NEL
CARCINOMA A CELLULE
TRANSIZIONALI DELLA VESCICA
Natalina Antonella Marchi
TSLB Anatomia Patologica
ULSS 17 Monselice-Este
Il carcinoma della vescica rappresenta il 70% delle forme
maligne dell’apparato urinario.

La sua incidenza aumenta con l’età, passando:
-dal 25% per la fascia di età compresa tra i 59 e i 69 anni
-al 93% per quella compresa tra i 75 e i 79 anni.

Tale patologia colpisce maggiormente i maschi rispetto alle
femmine con un rapporto di 3:1.

La maggioranza dei carcinomi vescicali, il 97%, è
rappresentata dal carcinoma a cellule di transizione mentre,
l’adenocarcinoma ha una frequenza del 2% e, nell’1% dei
casi, si riscontra il carcinoma a cellule squamose.

Il TCC origina di solito nella zona tra la base della vescica e
il trigono e sulle pareti laterali.

Le cellule appaiono giganti con nuclei ammassati ed un
rapporto nucleo citoplasma aumentato; la maturazione
cellulare risulta incompleta e le mitosi sono frequenti.

Il sistema di stadiazione che viene impiegato è la
classificazione TNM.

Tale classificazione permette di valutare le neoplasie
vescicali in base all’estensione locale (“T”), all’
interessamento dei linfonodi regionali al di sotto della
biforcazione delle arterie iliache comuni (“N”), alla presenza
o meno di metastasi a distanza (“M”).

Il grado di malignità istologica viene rappresentato dal
“grading” (basso grado e alto grado), andando da un grado
più basso di anaplasia compatibile con la malignità, ad un
grado di malignità più elevato.

Con questo parametro si intende indicare la modulazione
della differenziazione cellulare e la frequenza di anormalità
nella morfologia delle cellule.

Altro parametro di valutazione importante ai fini della
diagnosi e della prognosi di malattia è l’angioinvasività.
L’angiogenesi è un processo biologico
mediante il quale nuovi capillari sono
formati da vasi pre-esistenti.

L’angiogenesi
si
attraverso 5 fasi.

1) Aumento della permeabilità del vaso;
2) Incremento della sintesi degli enzimi
proteolitici;
3) Migrazione delle cellule nell’area in cui
c’è lo stimolo angiogenico.
4) Fase di differenziazione in cui le cellule
passano da una forma fibroblastoide ad
una poligonale.
5) Fase di stabilizzazione e maturazione
dei vasi, le cellule muscolari lisce si
addensano all’interno della parete del
vaso formando una nuova matrice
extracellulare




compie
passando
I regolatori del ciclo cellulare

La proliferazione tumorale dipende dallo sconvolgimento
della normale progressione del ciclo cellulare e del suo
controllo.

Le proteine associate al ciclo cellulare annoverano cicline e
chinasi ciclina dipendenti che regolano la normale
proliferazione delle cellule.

Sono stati riconosciuti due tipi di meccanismi per il controllo
del ciclo cellulare:

una cascata di fosforilazioni proteiche che transita una
cellula da uno stadio al successivo;
checkpoints prestabiliti che monitorano il completamento di
eventi critici e rinviano, se necessario, la progressione del
ciclo alla fase seguente.


A questo gruppo di proteine appartengono
p21, p 27 e Ki-67.

P21: proteina regolata da p53, inibisce la
cdk2 (ciclina chinasi dipendente) e gioca
un ruolo centrale nel checkpoint in G1.
L’inibizione delle proteine cdk è essenziale
per entrare in fase S.

P27: proteina inibitrice che si lega,
mediante il suo dominio N-terminale, a
cdk2 bloccando il sito attivo dell’enzima.

Il ruolo della proteina p21 come
variabile prognostica è controverso
poiché studi condotti su questa
proteina hanno dato risultati
discordanti, mentre sembra avere
un
valore
prognostico
la
diminuzione dell’espressione di
p27 nel carcinoma della vescica.

Ki-67 è una proteina
nucleare codificata da un
gene che mappa sul
cromosoma 10 il cui locus
però non è stato ancora
ben caratterizzato, essa si
accumula soltanto quando
la cellula si trova allo stato
proliferativo, dalla fase G1
alla mitosi.
Studi
biochimici
hanno
evidenziato che la maggior parte
di Ki-67 è legata ad una frazione
di
cromatina
densamente
impacchettata,
probabilmente
eterocromatina.

Altri la descrivono come una
proteina che possiede una
funzione
di
rilievo
nella
condensazione della cromatina
mediante la sua regione Cterminale, fungendo da raccordo
tra i cromosomi e il loro apparato
mitotico
nella
regione
Nterminale.
REGOLATORI DEL CICLO CELLULARE (5)

Usando
tecniche
di
immunoistochimica, Ki-67 è
stata localizzata, durante il ciclo
da G1 a M, a livello della
cromatina condensata spesso
formante
una
struttura
a
reticolo.

La proteina Ki-67 può assolvere
un
ruolo
multifunzionale
all’interno del ciclo cellulare.
REGOLATORI DEL CICLO CELLULARE (6)

Ki-67 è coinvolta attivamente
nella ricostruzione della struttura
della cromatina reclutando le
heterochromatin protein 1 (HP1).

Permane associata alle HP1 per
il
mantenimento
della
eterocromatina
neoformata
anche quando la cellula entra in
interfase.
REGOLATORI DEL CICLO CELLULARE (7)

La proteina Ki-67 viene definita
un marker promettente da molti
autori per la progressione e la
ricorrenza
del
carcinoma
superficiale della vescica ma,
non è ancora certo il ruolo che
può ricoprire come marker
prognostico
nel
tumore
localmente avanzato e nella
metastasi.

Tra i geni coinvolti nella
cancerogenesi il più studiato è
un gene tumore-soppressore
che mappa sul cromosoma 17 e
codifica per la proteina p53.

p53
è
una
fosfoproteina
nucleare la quale, in risposta ai
danni del DNA, rallenta o
arresta la progressione del ciclo
cellulare e indirizza la cellula
verso l’apoptosi se il danno
riportato è severo.



La p53 viene accumulata nel
nucleo delle cellule, dove agisce
come fattore di trascrizione.
A seconda del tipo di cellula e
del grado di danno, la proteina
transattiva geni che codificano
sia per enzimi coinvolti nella
riparazione del DNA che per
inibitori del ciclo cellulare.
Inducendo poi la trascrizione di
geni pro-apoptotici come BAX,
p53 orienta la cellula verso
l’apoptosi.




I checkpoints che vedono
l’attiva presenza di p53 sono
da G1 a S e da G2 a M.
In una cellula normale, la
proteina p53 è presente in
bassi livelli con emivita breve.
La sua degradazione coinvolge
Mdm2,
una
proteina
intracellulare la quale si lega a
p53 portandola fuori dal
nucleo.
Nel
citoplasma
viene
ubiquitinata
e
subisce
proteolisi.

Come risposta a danni al genoma,
p53 viene stabilizzata grazie alla
inibizione della degradazione Mdm2dipendente, in questo modo la
proteina modificata non interagendo
più con Mdm2, può essere espressa
ad elevate concentrazioni .

p53 agisce come attivatore della
trascrizione di geni che codificano per
proteine tra cui la proteina p21, che
inibisce le proteine cdk che sono
essenziali per entrare in fase S.

p53 è coinvolta anche nel
checkpoint in fase G2. Questa
proteina e molte altre sue
proteine
bersaglio
sono
necessarie per mantenere la
cellula ferma in fase G2 dopo
aver riportato danni al DNA.

Nelle cellule tumorali queste
proteine
mancano,
di
conseguenza entrano in mitosi
con una cinetica accelerata .
GENI TUMORE-SOPPRESSORE (6)

Si pensa che p53 eserciti il
blocco
in
G2
attraverso
l’attivazione della trascrizione di
geni che codificano per p21 ed
altre proteine.

p21 può legare ed inibire il
complesso ciclinaB-cdc2 al fine
di impedire alla cellula di entrare
in mitosi.
GENI TUMORE-SOPPRESSORE (7)

p53 è presente soprattutto in tumori di alto grado e stadio
ed è associata alla progressione del tumore.

Preparati istologici mostrano una colorazione positiva per
p53 più frequentemente in tumori poco differenziati e
invasivi.

L’incidenza di mutazione di p53 stimata mediante PCR, è
più elevata nel tumore della vescica invasivo di alto grado
che nei tumori superficiali e di basso grado.
GENI TUMORE-SOPPRESSORE (8)

Evidenze
sperimentali
depongono
per
un
ruolo
sinergico dell’espressione di p53
ed RB nella progressione del
cancro alla vescica.

Tumori con l’alterazione di
entrambe le proteine sono
associati ad una prognosi
infausta rispetto a tumori che
esprimono il fenotipo wild tipe
delle proteine.
GENI TUMORE-SOPPRESSORE (9)

Un’indagine
immunoistochimica
della
presenza
contemporanea di Ki-67 e p53, può avere valore
prognostico per il cancro alla vescica che invade il tessuto
muscolare.

Pazienti ad alto rischio con una bassa espressione di Ki-67
e p53 possono non richiedere terapie post-operatorie
aggressive, evidenziando pertanto l’esistenza di una
significativa correlazione tra la concentrazione di Ki-67 e
l’espressione di p53.

L’amplificazione di oncogeni viene riscontrata in molti tumori
solidi ed è spesso associata all’aggressività e all’esito
infausto della malattia.

Il proto-oncogene c-erbB-2 è una delle regioni più
frequentemente amplificate nei tumori di varia origine ed in
molti casi anche nel cancro della vescica.

L’amplificazione del gene e l’elevata espressione del suo
prodotto sono considerati un utile marker prognostico.

Il gene c-erbB-2, conosciuto
anche
come
HER-2/neu,
mappa sul cromosoma 17 ed il
suo prodotto è un antigene
tumorale.

HER-2/neu è membro della
famiglia EGFR che comprende
quattro recettori
correlati:
HER-2/neu, HER-3, HER-4 ed
EGFR.

Questi
recettori
sono
fosfoglicoproteine
transmembranali con attività
tirosin-chinasica.

Il recettore EGFR è presente soltanto sulle cellule dello
strato basale (cellule immature) ed è associato alla
differenziazione dell’urotelio in vivo.

HER-2/neu è espresso soprattutto
differenziate del livello superficiale.

In particolare l’espressione di EGFR ed ErbB-2 aumenta la
migrazione delle cellule, un passo molto importante per la
formazione di metastasi.
sulle
cellule
già
PROTO-ONCOGENI ED ONCOGENI (4)

Il legame con l’epidermal growth
factor (EGF) promuove la
fosforilazione del suo substrato
con successivo incremento della
trascrizione
e
della
proliferazione cellulare.

L’espressione patologica
recettore di EGF causa:
-
una
proliferazione
cellulare
incontrollata;
incremento dell’ angiogenesi
riduzione dell’apoptosi
-
del

L’angiogenesi è essenziale per lo sviluppo e la crescita del
cancro e, affinché la massa tumorale possa aumentare oltre
1-2 mm, necessita dell’apporto di nutrienti ed ossigeno.

Sono stati identificati un numero elevato di fattori
proangiogenici e i loro recettori corrispondenti quali il:

fibroblast growth factor (FGF)
il platelet-derived growth factor (PDGF)
angiopoietina
l’epidermal growth factor (EGF)
vascular endothelial growth factor (VEGF)





Il VEGF è una glicoproteina
costituita da due subunità e, il
suo mRNA, subisce splicing
alternativo producendo quattro
varianti della glicoproteina
stessa.

Tali isoforme, sembrano essere
ugualmente capaci di stimolare,
nelle cellule endoteliali la mitosi.

Il VEGF è considerato un fattore
di sopravvivenza per le cellule
endoteliali
poiché
inibisce
l’apoptosi.

Esercita il suo effetto attraverso
il legame ad elevata affinità a
due recettori ad attività tirosinchinasica il VEGFR1 e il
VEGFR2, i quali sono espressi
dalla maggior parte delle cellule
endoteliali.
FATTORI RELATIVI ALL’ANGIOGENESI (4)

Nella progressione tumorale
l’espressione di VEGF viene iperregolata:

da fattori di crescita
da oncogeni
da stati di ipossia nel tessuto
tumorale stesso.



L’ipossia sembra essere lo
stimolo più importante, per la
produzione
di
VEGF
sia
all’interno della massa tumorale
che nei tessuti sani.

La citometria a flusso permette la
misurazione della fluorescenza in
una sospensione cellulare che viene
fatta scorrere attraverso un apparato
di rilevamento mentre un fascio di
luce laser eccita il fluorocromo
preventivamente
inserito
nella
cellula.

L’intensità
di
fluorescenza,
determinata dallo strumento, è
direttamente
proporzionale
alla
quantità di DNA presente nella
cellula e l’esito della misurazione
viene rappresentato in un grafico.

Nelle neoplasie maligne il contenuto di DNA può variare, le
cellule che costituiscono il tumore possono avere una
quantità addizionale o una perdita di DNA.

I parametri più importanti che si possono valutare con un
istogramma citometrico sono: l’indice di DNA (D.I.) e la
percentuale di cellule che sono nella fase S del ciclo
cellulare (cellule che stanno proliferando).

La quntità di DNA consente di valutare aspetti importanti
utili nel precisare il quadro diagnostico e spesso nella scelta
di una terapia:

1) Il “grado di alterazione” rispetto al contenuto diploide
delle cellule normali (ploidia del DNA);
2) Lo “stato proliferativo” individuato attraverso la
consistenza numerica della popolazione in fase di sintesi
del DNA (percentuale di cellule in fase S).


Queste informazioni si ottengono
dall’istogramma, risultato della
misura del campione.

L’intensità di fluorescenza
emessa da ciascuna cellula è
proporzionale al suo contenuto
di DNA.
In particolare sono riconoscibili le diverse
sottopopolazioni presenti.
Il primo “picco” corrisponde ai segnali di
fluorescenza emessi dalle cellule in fase
G0/G1, il secondo è relativo alle cellule in
fase premitotica e mitotica (G2 + M) con
contenuto di DNA doppio e la
distribuzione tra di essi rappresenta
le cellule in fase di sintesi.
Nel caso di campioni con neoplasie, è
frequente la presenza nello stesso
campione di più popolazioni cellulari con
diverso contenuto di DNA (tumori
aneuploidi).
LA DNA PLOIDIA (4)

Nelle neoplasie maligne il contenuto di DNA può variare, nello stesso campione
neoplastico è frequente la presenza di più popolazioni con diverso contenuto di DNA
(tumori aneuploidi).

Il parametro utilizzato è il DNA INDEX (D.I.) cioè il rapporto tra il contenuto modale di DNA
in fase G1 della sottopopolazione cellulare aneuploide e quello della sottopopolazione
diploide. D.I.= 1 corrisponde alla diploidia.
Esempio di istogramma che presenta popolazione aneuploide.
IL NOSTRO LAVORO

Nel nostro laboratorio abbiamo selezionato 70 soggetti con
neoplasia vescicale: 50 con neoplasia di alto grado e 20
con neoplasia di basso grado.

Con la classificazione TNM sono stati valutati il grading
istopatologico, il grado di infiltrazione, l’angioinvasione, la
necrosi, l’infiltrato linfocitario.
IL NOSTRO LAVORO

Su ogni campione è stata poi eseguita immunoistochimica
per: p53, Ki-67, EGFR, VEGF e, per alcuni, l’Hercep Test.

Su tutti i casi è stato eseguito l’esame citofluorimetrico per
determinare la ploidia del DNA.
I NOSTRI PREPARATI
Sezione di tessuto con neoplasia
vescicale di alto grado. Particolare
con invasione vascolare.
(Ematossilina-eosina,
ingrandimento 10x).
I NOSTRI PREPARATI
Sezione di tessuto con neoplasia
vescicale di alto grado ed evidente
necrosi centrale. (Ematossilinaeosina, ingrandimento 20x).
I NOSTRI PREPARATI
Sezione istologica che evidenzia la
presenza di p53 mutata. (Colorazione
immunoistochimica, ingrandimento
10x).
I NOSTRI PREPARATI
Sezione con colorazione
immunoistochimica che
evidenzia la presenza di p53.
Particolare che presenta
invasione di un vaso.
I NOSTRI PREPARATI
Sezione istologica positiva per
Ki-67.
(Colorazione immunoistochimica,
ingrandimento 40x).
I NOSTRI PREPARATI
Sezione istologica
positiva per VEGF.
(Colorazione
immunoistochimica,
ingrandimento 10x).
I NOSTRI PREPARATI
Sezione positiva per il marcatore
EGFR.
(Colorazione immunoistochimica,
ingrandimento 20x).
I NOSTRI PREPARATI
Sezione che mostra una forte
positività all’HercepTest.
(Ingrandimento 40x).
RISULTATI (1)

I 50 campioni con neoplasia di alto grado sono stati valutati
su vetrini colorati con ematossilina eosina e di questi il 74%
presentava angioinvasione, il 44% necrosi, il 78% infiltrava
il connettivo sottoepiteliale mentre il 22% la tonaca
muscolare (metà interna), il 44% mostrava infiltrato
linfocitario.

Con metodica immunoistochimica è stato visto che l’86%
risultava positivo per p53, il 98% per VEGF e il 76% per
EGFR.

Nessuno dei 20 campioni con neoplasia di basso grado
presentava angioinvasione , necrosi e infiltrazione.

All’analisi immunoistochimica il 75% era positivo per p53, il
95% per VEGF e il 75% per EGFR.

La proteina Ki-67 nei campioni di alto grado è risultata
essere positiva in tutti i campioni in percentuali diverse. Tali
valori sono stati correlati con gli altri parametri di
valutazione.
RISULTATI (3)

Piu’ del 50% dei campioni con neoplasia vescicale di alto
grado ha evidenziato una alta positività per Ki-67 (40-70%
delle cellule neoplastiche) e di questi il 100% presentava
positività per VEGF, il 96% per p53 ed il 75% per EGFR.

Piu’ dell’80% dei campioni con neoplasia vescicale di basso
grado mostra una bassa positività per Ki-67.
Il 10% dei campioni di basso grado mostra una alta
positività per Ki-67 e, di questi, il 100% è positivo per VEGF,
EGFR e p53.
RISULTATI (4)

L’Hercep Test è stato eseguito su 27 campioni selezionati in
base alla percentuale di positività per Ki-67.

Il 33% delle neoplasie vescicali di alto grado è risultato
avere una alta positività per Her2/neu (range 16-60%) e di
questi il 100% è risultato positivo per VEGF e p53, il 77%
positivo per EGFR ed il 100% mostrava una alta positività
per Ki-67.

Gli altri campioni presentavano negatività o bassa positività.

Del gruppo con neoplasia vescicale di basso grado nessuno
è risultato positivo per Her2/neu.



Su 50 casi di neoplasia vescicale
di alto grado e su 20 casi di
neoplasia di basso grado è stato
eseguito esame citofluorimetrico
per determinare il contenuto di
DNA.
Il 58% dei casi di neoplasia di
alto grado è risultato essere
diploide (D.I.=1) ed il 42% è
risultato
essere
aneuploide
(D.I.>1).
Il 100% dei casi di neoplasia di
basso grado è risultato essere
diploide.
Istogramma che rappresenta popolazione
aneuploide/poliploide (D.I.=1,69/2,0).
VALUTAZIONE DELLA PLOIDIA DEL DNA (2)

Questi risultati sono stati correlati
con il parametro Ki-67 e il dato
significativo che ne emerge
riguarda i casi con popolazione
aneuploide che presentavano una
alta positività per Ki-67.

Dei 50 casi con neoplasia di alto
grado, 19 mostrano un contenuto
aneuploide/poliploide di DNA e
sono i casi che presentano una
positività alta (40-70% delle cellule
neoplastiche) di Ki-67.
Istogramma che rappresenta popolazione
aneuploide/poliploide (D.I.=1,69/2,0).
VALUTAZIONE DELLA PLOIDIA DEL DNA (3)
Grading
Alto
(50)
Basso
(9)
Ki-67
Diploide
Aneuploide
Basso
(11)
10
1
Medio
(11)
10
1
Alto (28)
9
19
Basso
(17)
17
0
Medio (1)
1
0
Alto
2
0
(2)
DISCUSSIONE (1)

I nostri dati evidenziano che i carcinomi a cellule
transizionali di alto grado della vescica morfologicamente
caratterizzati da necrosi e angioinvasione iperesprimono
all’immunoistochimica Ki.67, p53 VEGF, EGFR e all’analisi
citofluorimetrica aneuploidia/poliploidia.

Nel carcinoma vescicale invasivo, p53 è un importante
fattore prognostico poiché la sua espressione è correlata
con il grado e lo stadio del tumore mentre, Her2/neu, non
mostra significato prognostico.

Ulteriori studi sono necessari per quanto riguarda non solo
l’iperespressione di Her2/neu ma anche l’amplificazione del
suo gene per chiarire il suo coinvolgimento nella
differenziazione cellulare, nell’adesione e nella motilità
cellulare attraverso la sua attività tirosin-chinasica.

L’espressione di EGFR, VEGF e p53 vengono associati a
prognosi sfavorevole.

L’elevata correlazione tra Ki-67 e ploidia del DNA ha
evidenziato che neoplasie di alto grado, con spiccata
angioinvasione e diffuse aree di necrosi, costituiscono il
gruppo aneuploide/poliploide che potrebbe avvalersi di
trattamento più aggressivo. Si configura pertanto un gruppo
a prognosi ancora più sfavorevole all’interno del gruppo
degli alti gradi.
CONCLUSIONI

Utilizzando i criteri istopatologici, le tecniche di
immunoistochimica e citofluorimetria, il nostro lavoro
dimostra una stretta correlazione tra l’espressione di Ki-67,
DNA ploidia e parametri prognostici morfologici infausti nel
carcinoma a cellule transizionali di alto grado della vescica.

L’identificazione di un gruppo aneuploide/poliploide,
all’interno dell’alto grado, potrebbe rendere più efficace
l’iter diagnostico-terapeutico del paziente con neoplasia
vescicale.
GRAZIE A TUTTI PER L’ATTENZIONE ED
IN PARTICOLARE AGLI
ORGANIZZATORI PER AVERMI DATO
LA POSSIBILITA’ DI ESSERE QUI OGGI
Antonella Marchi