DISS. ETH No. 20849
Role of ECF factors in stress response
of Bradyrhizobium japonicum
A dissertation submitted to the
ETH Zurich
for the degree of
DOCTOR OF SCIENCES
presented by
NADEZDA MASLOBOEVA
Dipl. Biol., Novosibirsk State University
born October 23, 1985
citizen of the Russian Federation
Prof. Dr. Hans-Martin Fischer, examiner
Prof. Dr. Hauke Hennecke, co-examiner
Prof. Dr. Julia Vorholt, co-examiner
Prof. Dr. Justine Collier, co-examiner
2012
THESIS SUMMARY
Living organisms including bacteria are constantly challenged by changes in environmental
conditions. Bacteria adapt to these fluctuations by altering gene expression using a wide set
of regulatory mechanisms. One of the possible ways to achieve coordinated expression of
entire sets of genes is the use of alternative factors which determine promoter specificity of
the RNA polymerase (RNAP) holoenzyme. Extracytoplasmic function (ECF) σ factors
belong to this class of regulators. They are required for RNAP to recognize promoters
associated with genes which are involved in many different tasks, including stress responses,
metal homeostasis, virulence-related traits, and maintenance of cell envelope structure. The
genome of Bradyrhizobium japonicum, the nitrogen-fixing soybean endosymbiont, encodes
17 predicted ECF factors. This work aimed at unraveling the functions of ECF factors in
B. japonicum, identifying mechanisms regulating their activity, and their target genes.
The first part of this thesis deals with the oxidative stress response of B. japonicum and the
role played by two ECF factors, EcfQ and EcfF, in this process. Mutant analysis showed
that both factors are required for tolerance to singlet oxygen under free-living conditions
but not for an effective symbiosis. Potential target genes of EcfQ and EcfF were determined
by microarray analyses. These data disclosed that each of the two ECF factors controls a
distinct, rather small set of genes. While functions of the genes within the EcfQ-regulon are
largely unknown, EcfF directs transcription of a group of three methionine sulfoxide
reductase genes. Moreover, the activity of each of these factors is controlled by different
mechanisms. We show that EcfF is auto-regulated via an EcfF-dependent promoter and
negatively regulated via interaction with its cognate anti- factor OsrA whose gene is
cotranscribed with ecfF. In this work, two cysteine residues required for proper function of
OsrA were identified.
Expression of ecfQ and genes coding for paralogous class-33 ECF factors, to which EcfF
belongs, is probably controlled by an as yet unidentified transcription factor because putative
promoter regions of these genes share a remarkable degree of sequence similarity. Since no
cognate anti- factor gene is associated with ecfQ, the mechanism(s) regulating EcfQ activity
remains unclear.
The second part of this work is dedicated to the further characterization of the general stress
response in B. japonicum. As shown in previous studies, and similar to other 1 Thesis summary
proteobacteria, the general stress response in B. japonicum involves ECF factor EcfG
controlled by a partner-switching mechanism involving the anti- factor NepR and the antianti- factor PhyR. Using deletion mutants and phenotypic assays, it was shown that PhyR
and EcfG are required for stress responses and symbiotic interactions with various host
plants. Microarray analysis revealed that PhyR and EcfG control highly congruent regulons
with a large portion of genes of unknown function. In this work, we deleted a cluster of five
functionally undefined genes which are organized in two divergently oriented operons,
bll1467-65 and blr1468-69, and transcribed in an EcfG-dependent manner. The resulting
mutant strain is more sensitive to elevated temperature and UV exposure than the wild type,
yet still symbiotically proficient. Thus the PhyR/EcfG regulon probably can be subdivided in
genes whose products are crucial for free-living stress conditions, symbiosis or both. Finally,
analysis of a putative histidine kinase, Blr1461, which might be involved in PhyR-/NepRmediated signalling to EcfG is described. However, repeated attempts to construct a deletion
mutant in the blr1461 gene were unsuccessful, implying that Blr1461 might be an essential
protein. Attempts to document autophosphorylation of purified Blr1461 variants have failed,
rendering its function as a kinase questionable.
2 RIASSUNTO DELLA TESI
Gli organismi viventi, batteri inclusi, sono costantemente sottoposti a cambiamenti delle
condizioni ambientali. I batteri si adattano a queste variazioni usando una serie di proteine
regolatrici che alterano l’espressione genica. L’uso di fattori alternativi, determinanti la
specificità dell’oloenzima RNAP per un promotore, è uno dei possibili modi per ottenere il
coordinamento nell’espressione di un intero set di geni. I fattori con funzione
extracitoplasmatica (ECF) appartengono a questo tipo di regolatori, e sono necessari per la
trascrizione di geni coinvolti in svariati processi, come risposta allo stress, omeostasi dei
metalli, virulenza e mantenimento del rivestimento cellulare. Nel genoma di Bradyrhizobium
japonicum, l’azoto-fissatore endosimbionte della soia, sono codificati 17 possibili fattori
ECF.
Lo scopo di questo lavoro è la determinazione della funzione di fattori ECF,
l’identificazione dei meccanismi che ne controllano l’attività e l’individuazione dei loro
bersagli genici in B. japonicum.
L’oggetto della prima parte di questa tesi è la risposta allo stress ossidativo da parte di
B. japonicum e il ruolo ricoperto da due fattori ECF: EcfQ e EcfF. L’analisi di ceppi
mutanti per questi geni ha rilevato che entrambi i fattori sono necessari per la resistenza
all’ossigeno singoletto, ma non durante la simbiosi. I bersagli di EcfQ e EcfF sono stati
identificati tramite microarray. Entrambi i fattori controllano un distinto e piuttosto limitato
set di geni, per la maggior parte a funzione ignota per quanto riguarda il regolone di EcfQ. Al
contrario, EcfF controlla la trascrizione di un ipotetico sistema di metionina solfossido
reduttasi. Inoltre la funzione dei due fattori è modulata da meccanismi differenti. EcfF è sia
autoregolato che negativamente regolato dall’interazione con l’anti-fattore OsrA, il cui
gene è co-trascritto con ecfF. La funzionalità di OsrA dipende da due cisteine, identificate in
questo studio. Diversamente, l’espressione di ecfQ e di altri geni codificanti fattori ECF di
classe 33 (alla quale appartiene anche EcfF) è verosimilmente controllata da un fattore di
trascrizione ignoto, dal momento in cui la putativa regione del promotore di questi geni è
marcatamente conservata. Poiché non vi è un anti-fattore geneticamente associato a ecfQ, il
suo meccanismo di regolazione resta ignoto.
La seconda parte di questo lavoro riguarda un’ulteriore caratterizzazione della risposta allo
stress generale da parte di B. japonicum. Come indicato in precedenza, la risposta allo stress
3 Riassunto della tesi
generale in quest’organismo, così come in altri -proteobatteri, include il fattore ECF
EcfG, la cui attività è controllata dall’anti-fattore NepR e dall’anti-anti-fattore PhyR.
Tramite lo studio di ceppi mutanti e saggi fenotipici è stato possibile dimostrare che PhyR e
EcfG sono necessari per la risposta allo stress e per lo sviluppo della simbiosi con diverse
piante. I regoloni di PhyR e EcfG, analizzati attraverso microarray, sono sovrapponibili e
includono molti geni a funzione ignota. Un cluster di cinque geni organizzati in due operoni
con orientamento opposto e appartenente al regolone condiviso, bll/r1465-69, è stato
selezionato per una mutagenesi. Il ceppo mutante si è rilevato più sensibile al caldo e ai raggi
UV del wild type, ma comunque simbioticamente attivo. Il regolone PhyR/EcfG può dunque
essere suddiviso in geni coinvolti nella resistenza allo stress in assenza di simbiosi, nella
simbiosi o in entrambi i casi. Per finire, è riportata l’analisi di una putativa istidina chinasi,
Blr1461, probabilmente coinvolta nella modulazione di EcfG mediata da PhyR/NepR.
Diversi tentativi di creare un mutante di delezione per questo gene sono falliti, suggerendone
l’essenzialità.
Inoltre
esperimenti
mirati
alla
documentazione
di
una
possibile
autofosforilazione di Blr1461 hanno avuto esito negativo, indicando una possibile funzione
alternativa della proteina.
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