08 2016 istoenzimologia

ISTOENZIMOLOGIA
L’istoenzimologia si prefigge di localizzare attività
enzimatiche nei tessuti ed all’interno di cellule
si utilizzano reazioni chimiche catalizzate dagli enzimi
tissutali,
Le reazioni enzimatiche danno luogo ad un prodotto
insolubile e visibile in microscopia (ottica o elettronica)
Con i metodi isto-enzimologici non si mettono in
evidenza le molecole stesse degli enzimi, ma la loro
attività sui substrati di reazione impiegati nelle indagini
I preparati debbono essere allestiti mantenendo il più
possibile inalterata l’attività enzimatica e la sua
localizzazione
A SECONDA DELLA REAZIONE CATALIZZATA, GLI ENZIMI SI
SUDDIVIDONO IN SEI CATEGORIE
IDROLASI: catalizzano reazioni di idrolisi
OSSIDOREDUTTASI: catalizzano reazioni di ossidoriduzione
TRANSFERASI: catalizzano il trasferimento di una porzione di una
molecola ad un’altra molecola e viceversa
LIASI o SINTASI: catalizzano interruzione di legami senza introduzione
di molecole di acqua, o sintesi che non comportino dispendio
energetico.
LIGASI o SINTETASI: catalizzano sintesi con consumo di energia,
fornita dalla contemporanea idrolisi di adenosintrifosfato
ISOMERASI: catalizzano trasformazioni tra isomeri
Le reazioni isto-enzimatiche sono principalmente rivolte allo studio di
idrolasi e, in minor misura, di ossidoreduttasi;
esistono anche reazioni per altri enzimi (ad esempio per la anidrasi
carbonica, una liasi, ma sono reazioni dotate di scarsa specificità
Le reazioni enzimatiche si usano frequentemente nella fase di
rivelazione delle reazioni immunoistochimiche
ESEMPIO DI
LIGASI
PREPARAZIONE DEL TESSUTO PER INDAGINI
ISTO-ENZIMOLOGICHE IN MICROSCOPIA OTTICA
si possono verificare tre condizioni:
1) l’attività enzimatica non sopporta
alcun tipo di
fissazione
2) l’attività enzimatica sopporta la fissazione
(effettuata in modo adeguato) ma non la
disidratazione né l’inclusione in paraffina
3) l’attività enzimatica tollera anche queste ultime
tappe della tecnica istologica
1) Se l’enzima non sopporta la fissazione (ad esempio, la
succinodeidrogenasi) occorre sezionare il tessuto congelato e
subito dopo eseguire la reazione istochimica; la fissazione del
tessuto, contenente il prodotto di reazione, viene condotta
successivamente, per ottenere un preparato stabile nel tempo
2) Se l’enzima tollera la fissazione (ad esempio, la fosfatasi acida e
la perossidasi) si fissa il tessuto con formaldeide, si seziona
mediante congelamento e criotomia e si procede alla reazione
istochimica
3) Nel caso infine che l’enzima studiato tolleri anche l’inclusione in
paraffina (è il caso della fosfatasi alcalina), si procede alla sua
dimostrazione su sezioni di materiale incluso, sparaffinate e
idratate come da procedura standard
CARATTERISTICHE GENERALI DELLE REAZIONI ISTOENZIMOLOGICHE
Per mettere in evidenza l’attività di un enzima si pone in
incubazione il tessuto in un medium contenente le
molecole sulle quali l’enzima agisce (substrati
dell’attività enzimatica)
a seguito dell’azione catalitica dell’enzima, i substrati
danno luogo a prodotti di reazione che possono essere:
n insolubili e quindi subito visibili al microscopio ottico o
elettronico
n solubili. si tratta di prodotti che non sono immediatamente
visibili al microscopio, ma lo possono diventare mediante
successive reazioni chimiche
Il requisito dell’insolubilità dei prodotti di reazione è
essenziale perché si abbia localizzazione dell’attività
enzimatica ed essa sia precisa
Qualora il prodotto della reazione catalizzata
dall’enzima non sia di per sé insolubile, occorre
renderlo tale per reazione con una sostanza (“agente di
cattura”) il più rapidamente possibile
REALIZZAZIONE DELLE REAZIONI ISTOENZIMOLOGICHE
Il tessuto è incubato in un medium contenente:
1) il substrato o i substrati della reazione
2) l’eventuale agente di cattura
3) eventuali ioni minerali attivatori dell’enzima
4) ioni, necessari per tamponare il medium al pH
idoneo all’attività enzimatica
§ L’incubazione avviene usualmente a 37° C;
§ in alcuni casi a temperatura ambiente (20—
22°C)
§ inferiore (4°C) (è opportuno quando una
formazione eccessivamente rapida di gran
quantità del prodotto di reazione, solubile, rischi
di provocare una conseguente diffusione del
prodotto di reazione a distanza dalla sede di
formazione; temperature più basse rallentano la
reazione)
CONTROLLI DELLE REAZIONI ISTOENZIMOLOGICHE
In ogni reazione istoenzimologica è opportuno eseguire
controlli per garantire la specificità
Possibilità:
1) ripetizione della reazione (su un’altra sezione del medesimo
tessuto) con un medium di incubazione privo del substrato
specifico
2) ripetizione della reazione in un medium privo di fattori attivanti
specifici (ad esempio, ioni magnesio nelle reazioni per la
fosfatasi alcalina o per la succinodeidrogenasi)
3) controllo con un medium completo di tutti i substrati e gli
attivatori, al quale sia aggiunto un inibitore specifico dell’enzima
oggetto di studio
Nei preparati di controllo non deve essere presente
alcun prodotto di reazione: solo in questo caso si può
accettare come specifico un risultato positivo nel
preparato incubato regolarmente