Il fuso mitotico in metafase

Il fuso mitotico in metafase
1
3 TIPI DI MICROTUBULI
1.
POLARI (sovrapposti sulla linea
mediana del fuso)
2.
DEL CINETOCORE (attaccati al
cinetocore specializzato)
3.
ASTRALI (irradiano in tutte le
direzioni dai centrosomi)
2
Attacco dei
cinetocore
microtubuli del
al cromosoma
3
Forza di esclusione astrale
• Respinge ciò che si
avvicina troppo ai poli
• Agisce in direzione
opposta ai microtubuli del
cinetocore
• Segregazione dei 2
cromatidi fratelli ai lati
opposti della cellula
4
Modello di come
due forze
opposte possono
cooperare a
muovere i
cromosomi verso
il centrosoma.
5
Forze bipolari
Formazione piastra metafasica
Come cromosomi si allineano a distanza uguale dai 2 poli del
fuso:
C) TRAZIONE
agisce sui cinetocori e tira i cromosomi
•
•
B) SPINTA
agisce sui cinetocori e spinge i cromosomi
all’equatore
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Fuso mitotico in metafase
• Equilibrio dinamico
• Incorporazione tubulina fluorescente
• TREADMILLING: subunità tubulina si muovono con
continuità verso i poli
7
Fuso mitotico in anafase
Anafase A
•Movimento di cromatidi verso i
poli
•Accorciamento dei microtubuli
del cinetocore
Anafase B
•Separazione dei poli
•Allungamento microtubuli polari;
movimento spinto da proteine
motrici
8
Anafase A
Forze generate a livello del cinetocore
2 modelli alternativi per spiegare questo movimento:
Proteina motrice/ATP
Movimento passivo
9
Anafase B
2 forze agiscono per separare i poli:
2. Spinta (microtubuli polari)
3. Trazione (microtubuli astrali)
10
11
(B)
Microfotografia del
solco di segmentazione
di una cellula animale
(C)
Microfotografia a
fluorescenza di una
ameba colorata per
actina (in rosso) e
miosina II (in verde)
12
Influenza della posizione degli aster sul piano
di segmentazione
13
 La maggior parte delle cellule si divide
simmetricamente;
 Il fuso mitotico generalmente è
posizionato al centro del citoplasma;
 L’anello contrattile si forma in prossimità
dell’equatore della cellula parentale;
 Le due cellule figlie hanno uguali
dimensioni
14
In alcuni casi le cellule si dividono asimmetricamente per
produrre due cellule figlie che differiscono per
dimensioni e/o contenuto citoplasmatico
Colorazione in
blu del DNA
Localizzazione
dei granuli P
con anticorpo
fluorescente
Segregazione asimmetrica di componenti citoplasmatici (granuli P
fluorescenti) in una cellula figlia durante la prima divisione mitotica
dell’uovo fecondato di C. elegans. I granuli P vengono ereditati solo
dalle cellule che daranno origine a uova e a spermatozoi.
15
Per creare due cellule figlie con destini diversi, la
cellula madre deve prima segregare alcuni componenti
(determinanti del destino) ad un lato della cellula e poi
posizionare il piano di divisione in modo che la cellula
figlia appropriata erediti questi componenti.
Il fuso mitotico deve essere mosso in maniera
controllata all’interno della cellula in divisione
16
17
 I movimenti del fuso mitotico sono diretti da
cambiamenti in regioni locali della corteccia
cellulare.
 Proteine motrici presenti in queste regioni sono
responsabili del movimento dei microtubuli astrali.
 La divisione asimmetrica è particolarmente
importante nelle cellule vegetali.
 Poiché queste cellule non possono muoversi dopo la
citocinesi, la scelta dei piani di divisione è cruciale
per determinare la morfologia del tessuto.
18
Differenti
meccanismi di
separazione dei
cromosomi sono
usati in diversi
organismi
19
The Cell Cycle
The durations of G1
and G2 are variable,
even within an
organism or cell type.
The durations of S
and M are usually
quite consistent
START or Restriction Point
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Differentiated cells
Cardiac muscle cells
⇒
they no longer divide
Skin fibroblasts, smooth muscle cells, endothelial
cells of blood vessels, and the epithelial cells of
most internal organs ⇒ they can resume
proliferation to replace dead cells
Liver cells normally divide rarely ⇒ but if a large
number of cells is lost, the remaining ones
proliferate to replace the missing ones.
21
STEM CELLS
Some types of differentiated cells are replaced via
proliferation of cells that are less differentiated, and
called stem cells
Unipotent stem cells
produce only one
type of
differentiated cell,
whereas totipotent
ones produce many
different
differentiated cells
22
Formazione delle cellule differenziate del sangue dalle
cellule staminali ematopietiche del midollo osseo
23
Embryonal stem cells
They are stem cells with the most powerful
differentiative ability.
They are present in the early embryo and
can give rise to all kind of differentiated
cell types of the adult organism.
24
CANCER
Results from the breakdown of the regulatory
mechanisms that govern normal cell behavior
(proliferation, differentiation, apoptosis, necrosis).
When cell regulation is lost, cancer cells will grow and
divide, and ultimately spread throughout the body
interfering with the function of tissues and organs.
25
Arresto in G1
✠ Cellule del sistema nervoso centrale differenziate;
✠ Cellule del tessuto muscolare differenziate;
✠ Cellule dei tessuti che costituiscono la radice, il fusto e le
foglie delle piante (ad eccezione dei meristemi e dei cambi)
Arresto in G2
✠ Cellule renali dei vertebrati superiori;
✠ Cellule dell’epidermide dell’orecchio del topo;
✠ Alcune cellule embrionali di Drosophila
26
Le tre fasi principali del ciclo cellulare
(INTERFASE, MITOSI, CITODIERESI)
CITODIERESI sono
coordinate e presenti tutte all’interno di un
ciclo cellulare tipico.
ECCEZIONI
1. Cromosomi politenici di Drosophila melanogaster
Replicazione del DNA e assenza di citodieresi
Formazione di nuclei politenici
27
Il DNA di ciascuno dei
quattro cromosomi di D.
melanogaster è stato
replicato attraverso 10
cicli senza separazione dei
cromosomi figli, sicchè
1024 (210) filamenti
identici di cromatina sono
allineati fianco a fianco.
I quattro cromosomi sono
uniti in corrispondenza dei
cromocentri.
28
2. Cellule multinucleate del fegato dei mammiferi
Alla replicazione del DNA e alla mitosi non segue la
citodieresi
3. Cellule dell’endosperma dei cereali
Cicli successivi di replicazione del DNA e mitosi
Produzione di un embrione precoce multinucleato
citodieresi
Produzione di cellule mono nucleate
29
Section through a gran of cereal
Germ
contains vitamins, minerals,
protein and fat
Endosperm
contains mainly starch and protein
Seed coat
contains many minerals, vitamins
and dietary fibre
30
Crescita cellulare e contenuto di DNA
durante un ciclo cellulare
Processi continui: avvengono durante l’interfase e portano ad un processo
continuo di crescita: sintesi di nuovi ribosomi, membrane,
mitocondri, proteine cellulari
Processi discontinui: avvengono una sola volta per ogni ciclo cellulare: sintesi
31
di DNA, segregazione dei cromosomi
INTERFASE
FASE G1:
sintesi di proteine, carboidrati, lipidi
FASE S:
sintesi di DNA e di proteine che legano i
cromosomi
FASE G2:
sintesi delle proteine necessarie per
l’ingresso in Mitosi
32
Different cell cycle
The shortest cell cycle occur in
early embryos (8 min). The length
of each cycle is very constant.
The cell cycle of growing cells lasts
from 90 min to more than 24 h; its
duration is variable within a
population of cells.
Post-embryonic cells can leave the
cell cycle for several hours or
years.
33
Le cellule somatiche non crescono in maniera
sincrona;
la
loro
sincronizzazione
puo’
avvenire in due modi:
INDUZIONE: si ottiene mediante l’uso di droghe specifiche che bloccano
il ciclo cellulare in momenti particolari; la rimozione del
blocco consente la ripresa del ciclo di tutte le cellule in
coltura
SELEZIONE: si isola una sub-popolazione di cellule che si trovano nella
stessa fase del ciclo cellulare (cell sorting).
Le cellule precoci embrionali fertilizzate sono
“naturalmente” sincronizzate. Uso di cellule
embrionali di riccio di mare e Xenopus leavis.
34
ciclo cellulare standard
G1
S
G2
M
G1
S
G2
M
ciclo cellulare embrionale precoce
S
M
S
M
S
M
S
M
S
M
Nel ciclo cellulare delle cellule embrionali precoci
non si ha crescita, così che ciascuna cellula
figlia è la metà della cellula madre.
La durata del ciclo è breve e le fasi S e M si
alternano senza fasi G1 e G2.
35
Crescita cellulare di cellule somatiche e di
cellule embrionali
Le cellule somatiche “nascono” piccole e devono importare nutrienti
per poter crescere e duplicare la massa cellulare.
Le cellule embrionali ”nascono” già grandi ed ereditano tutti i
nutrienti dalla cellula madre.
36
Ciclo cellulare ed embrionale di Xenopus leavis
Una femmina di rana produce svariate migliaia di uova di circa 1
mm di diametro che possono dare origine ad una popolazione
enorme di cellule che si riproducono in maniera sincrona per
parecchi cicli cellulari.
37
Crescita dell’oocita e divisione dell’uovo
in Xenopus
Dopo la fecondazione l’uovo si divide repentinamente
(12 divisioni sincrone di circa 30 min) per produrre
la blastula che darà poi origine ad un girino
multicellulare entro un giorno o due.
38
Different experimental systems have contributed
distinct kinds of information to our understanding
of the cell division cycle
Embryos (amphibian and echinoderm) have provided
large numbers of synchronized cells for useful
biochemistry, which has in turn led to the
identification of important control proteins;
Mammalian cells showed us the subdivision of
interphase into G1, S, and G2;
Yeast cells have provided insight into the pathways
that control the decision to move from one stage
to the next.
39
Experimental Systems Important for Cell Cycle Studies
Saccharomyces cerevisiae
Arbacia punctulata
(riccio di mare)
Fused mammalian cells
Xenopus leavis
Schizosaccharomyces pombe
40
Quali sono gli approcci sperimentali che si possono
usare per definire in quale fase del ciclo cellulare
si trova una popolazione di cellule sincrone?
INDICE DI MARCATURA:
Marcatura
degli
acidi
nucleici
con
composti
radioattivi o con bromodeossiuridina (BrdU).
INDICE MITOTICO:
Esame delle cellule in mitosi: stima della durata
della fase M.
41
Various labeling schemes
Label with 3H thymidine: DNA
Label with 3H uridine: RNA
Label with 35S: proteins
Autoradiograph to see
where label has gone
But: To achieve some sense of when materials are being
synthesized: use “pulse” labeling technique
Time
Add label
Wash cells
42
Typical method of study: a pulse labeling experiment
T*
1. Feed radioactive
thymidine (T*) to
cells growing in
culture.
2. After 30 minutes,
wash unincorporated
T* out of cell culture.
3. Spread out cells
and lay x-ray film
over them.
Only interphase cells are labeled with T*
43
Separatore cellulare attivato dalla
fluorescenza (FACS)
44
Analisi del contenuto di DNA in
due popolazioni cellulari
G1
G1
S
G2/M
A: distribuzione di cellule di controllo
B: cellule bloccate in G1
45
Completion problem:
How does a cell know each cell cycle step is
complete?
Multiple checkpoints
G1 Checkpoint:
“Is my DNA damaged?”
G2 Checkpoint:
“Is my DNA replicated?”
Mitotic Checkpoint: “Are my chromosomes
properly attached to the
spindle?”
46
47
Il ciclo cellulare è il risultato finale
dell’azione di una serie di EVENTI
COSTITUTIVI che sono alla base del
funzionamento del macchinario del
ciclo cellulare e l’azione di ELEMENTI
REGOLATIVI che rappresentano
l’interfaccia con l’ambiente esterno
48
Cell Cycle Checkpoints
49
La logica del ciclo cellulare:
• I cromosomi devono essere REPLICATI correttamente
• I cromosomi devono essere SEGREGATI correttamente
La REPLICAZIONE e la SEGREGAZIONE devono essere
COORDINATE
La mitosi può iniziare solo se tutto il DNA è stato
replicato: esempio di COMPLETAMENTO delle fasi
Ad ogni mitosi deve corrispondere una sola duplicazione
50
del DNA: esempio di ALTERNANZA delle fasi
51
Cell fusion experiments
52
Fusion of mitotic cell to interphase cells
Interphase cells are induced to enter mitosis: chromosome
condensation + nuclear membrane breakdown
53
Fusione fra cellule in interfase e cellule in
mitosi:
 La mitosi è dominante rispetto alle altre fasi;
 Le cellule in mitosi contengono dei fattori
solubili che inducono cellule in interfase ad
entrare prematuramente in mitosi
M-phase Promoting Factor = MPF
54
Fusione fra cellule in G1 e cellule in S:
 Le cellule in S contengono dei fattori
solubili che inducono la replicazione in nuclei
in G1;
 L’eterocarion fuso non entra in M fino a
che il nucleo G1 non si è replicato
CONTROLLO FEEDBACK
55
Fusione fra cellule in G2 e cellule in S:
 Le cellule in G2 non rientrano in S;
 L’eterocarion fuso entra in M solo quando
tutto il nucleo in S è stato completamente
replicato
Blocco di rireplicazione
56
Different experimental systems have
contributed distinct kinds of information to our
understanding of the cell division cycle
Mammalian cells showed us the subdivision of
interphase into G1, S, and G2
Embryos (amphibian and echinoderm) have provided
large numbers of synchronized cells for useful
biochemistry, which has in turn led to the
identification of important control proteins
Yeast cells have provided insight into the pathways
that control the decision to move from one stage
to the next
57
Xenopus oocyte maturation
 Good model for studying cell cycle regulation
 Oocyte cytoplasm can be obtained in quantity
and manipulated, allowing both experimental
and biochemical studies
58
Maturation of frog eggs is induced by
progesterone, induction of
embryogenesis is induced by a sperm
Maturation
Activation
Use Oocyte maturation to study a simple, synchronized cell cycle
Hormone can drive G2 - M
Activation can drive M-G1
59
Once they are activated, oocytes produce a
cytoplasmic Maturation Promoting Factor (MPF),
which is Transferable and Autocatalytically produced
~100x dil.
~100x dil.
~100x dil.
(106 x dil.
In toto)
Yoshio Masui, Differentiation (2001) 69:1-17
60
MPF turns out to regulate the
embryonic Cell Cycle
MPF Regulates Mitosis as well as Meiosis
Yoshio Masui, Differentiation (2001) 69:1-17
61
How
MFP?
to pursue the purification of
Take advantage of synchrony
 Collect many eggs that contain active MPF
 Crush them and make cytoplasm or “egg
extract”
 Fractionate by standard biochemistry, but
use a bioassay for MPF activity
 Achieve several thousand-fold purification
62
Xenopus laevis egg extract system
centrifuge
+ Ca++
interphase
spindle assembly
in vitro
collect
Cytoplasm
= “egg extract”
Xenopus
sperm nucleus
+
rhodamine tubulin
63
Preparazione del citoplasma di Xenopus
64
To follow changes during the cell cycle:
Add



Xenopus sperm nuclei
can undergo rounds of S and M-phase
centrosome attached that nucleates microtubules
stain with blue DNA dye
Add rhodamine-labeled tubulin

incorporates into frog microtubules

microtubules appear red
65
MPF
- use of cell free assay to purify MPF
- test on various cytosolic fractions for MPF activity
66
Assay for Maturation Promoting Factor (MPF)
67
MPF Activity Peaks Before Each Cell Division
Moreover, MPF has kinase activity
68
M-phase promoting factor = MPF
=cdk1/cyclinB
MPF is a 2 subunit protein kinase complex:
 cdk1 cyclin dependent kinase 1 (32 kDa)
 Induces mitosis by phosphorylating
specific downstream targets on serine and
threonine
 cyclin B (45 kDa)
 regulatory subunit that activates cdk1
 abundance oscillates during the cell cycle
69
Cyclin was Discovered in Sea Urchin Embryos
can stimulate to
lay lots of eggs
Protein
Level
cyclin A
cyclin B
M
M
M70
Time
2001 Nobel Prize in Medicine
“for their discovery of key regulators of the cell cycle”
Tim Hunt
QuickTime™ and a
Photo - JPEG decompressor
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Paul Nurse
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Lee Hartwell
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QuickTime™ and a
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Sea urchin:
Identified cyclin
proteins in sea
urchin eggs
Yeast:
Identified genes that regulate
the cell cycle and showed that
humans also have them
71
La presenza di
inibitori della sintesi
proteica blocca l’uovo
fertilizzato in
interfase
L’aggiunta di MPF
spinge l’uovo in mitosi
anche in presenza di
inibitori della sintesi
proteica
72
 Il progesterone induce l’attivazione di MPF e la
rottura della membrana nucleare solo se l’oocita è in
grado di sintetizzare proteine;
 L’iniezione di citoplasma contenente MPF induce la
maturazione anche se la sintesi proteica dell’oocita
recipiente è inibita
 Gli oociti devono contenere complessi (definiti preMPF) che possono essere convertiti in MPF attivo
mediante modifiche post-traduzionali;
 L’attivazione di MPF è un evento citoplasmatico
poiché oociti privati del nucleo continuano a produrre
MPF attivo se trattati con progesterone
73
L’attività di MPF oscilla indipendentemente dalla
sintesi di DNA e dall’assemblaggio del fuso mitotico
Presenza di nocodazolo
(inibitore dell’assemblaggio
del fuso)
Presenza di afidicolina
(inibitore della
polimerizzazione di DNA)
74
Schema di funzionamento del ciclo cellulare
Il “motore” del ciclo cellulare
è MPF: una elevata
concentrazione di MPF
induce la mitosi e una sua
bassa concentrazione induce
l’ingresso in interfase
75
Organizzazione del ciclo cellulare di una cellula
embrionale
somatica
76
Il ciclo cellulare embrionale ha solo due transizioni:
attivazione e inattivazione di MPF
Nel ciclo cellulare di una cellula somatica c’è anche
una terza transizione: START
77
Two sets of studies converged on same
regulators of the cell cycle:
3. Identification of proteins whose abundance varied
with the cell cycle from the eggs of marine
invertebrates;
4. Identification of mutants and the subsequent cloning
of the corresponding genes that are defective in
cell cycle progression.
 These lines of investigations converged on the same
set of regulatory proteins.
 The mechanisms regulating the progression through
the cell division cycle are largely conserved in all
eukaryotes!!
78
MPF regulation was elucidated
by Tim Hunt’s discovery of Cyclins
 Cyclin B protein is synthesized continuously
 Threshold cyclin B level induces MPF kinase activity
 Cyclin B disappears suddenly during anaphase 79
80
Purification of MPF: The Birth
of Cyclin Dependent Kinases
This is cdc2+!!
(Cdc28 in
S. cerevisiae)
This is cyclin!!
(cdc13+
in S. pombe)
81
Cyclin synthesis
Interphase
Inactive MPF
Mitosis
Active MPF
Cyclin degradation
82
Dimostrazione che la sintesi e la degradazione della
ciclina sono necessarie per le oscillazioni cicliche
dell’attività dell’MPF
83
Cyclins are synthesized and degraded
during each cell cycle
Cyclins are a family of related proteins
Cyclin B:
• abundance peaks during G2/M
• degraded at anaphase onset
Anaphase-promoting complex (APC) causes
Polyubiquitination of cyclin B
Ubiquitination triggers degradation by the
proteasome
84
85
Cyclin Destruction Drives Mitotic Exit
G1
S
G2
M
G1
86
Mitotic Cyclins are Destroyed by
Ubiquitin-Dependent Proteolysis
M-cyclin
M-cyclin
Cdk
Cdk
87