Cell fusion experiments 1 Fusion of mitotic cell to interphase cells Interphase cells are induced to enter mitosis: chromosome condensation + nuclear membrane breakdown 2 Fusione fra cellule in interfase e cellule in mitosi: La mitosi è dominante rispetto alle altre fasi; Le cellule in mitosi contengono dei fattori solubili che inducono cellule in interfase ad entrare prematuramente in mitosi M-phase Promoting Factor = MPF 3 Fusione fra cellule in G1 e cellule in S: Le cellule in S contengono dei fattori solubili che inducono la replicazione di nuclei in G1; L’eterocarion fuso non entra in M fino a che il nucleo G1 non si è replicato CONTROLLO FEEDBACK 4 Fusione fra cellule in G2 e cellule in S: Le cellule in G2 non rientrano in S; L’eterocarion fuso entra in M solo quando tutto il nucleo in S è stato completamente replicato BLOCCO DI RIREPLICAZIONE 5 Different experimental systems have contributed distinct kinds of information to our understanding of the cell division cycle Mammalian cells showed us the subdivision of interphase into G1, S, and G2 Embryos (amphibian and echinoderm) have provided large numbers of synchronized cells for useful biochemistry, which has in turn led to the identification of important control proteins Yeast cells have provided insight into the pathways that control the decision to move from one stage to the next 6 Xenopus oocyte maturation Good model for studying cell cycle regulation Oocyte cytoplasm can be obtained in quantity and manipulated, allowing both experimental and biochemical studies 7 Maturation of frog eggs is induced by progesterone, induction of embryogenesis is induced by a sperm Maturation Activation Use Oocyte maturation to study a simple, synchronized cell cycle Hormone can drive G2 - M Activation can drive M-G1 8 Once they are activated, oocytes produce a cytoplasmic Maturation Promoting Factor (MPF), which is Transferable and Autocatalytically produced ~100x dil. ~100x dil. ~100x dil. (106 x dil. In toto) Yoshio Masui, Differentiation (2001) 69:1-17 9 MPF turns out to regulate the embryonic Cell Cycle MPF Regulates Mitosis as well as Meiosis Yoshio Masui, Differentiation (2001) 69:1-17 10 How MFP? to pursue the purification of Take advantage of synchrony Collect many eggs that contain active MPF Crush them and make cytoplasm or “egg extract” Fractionate by standard biochemistry, but use a bioassay for MPF activity Achieve several thousand-fold purification 11 Xenopus laevis egg extract system centrifuge + Ca++ interphase spindle assembly in vitro collect Cytoplasm = “egg extract” Xenopus sperm nucleus + rhodamine tubulin 12 Preparazione del citoplasma di Xenopus 13 To follow changes during the cell cycle: Add Xenopus sperm nuclei can undergo rounds of S and M-phase centrosome attached that nucleates microtubules stain with blue DNA dye Add rhodamine-labeled tubulin incorporates into frog microtubules microtubules appear red 14 MPF - use of cell free assay to purify MPF - test on various cytosolic fractions for MPF activity 15 Assay for Maturation Promoting Factor (MPF) 16 MPF Activity Peaks Before Each Cell Division Moreover, MPF has kinase activity 17 M-phase promoting factor = MPF =cdk1/cyclinB MPF is a 2 subunit protein kinase complex: cdk1 cyclin dependent kinase 1 (32 kDa) Induces mitosis by phosphorylating specific downstream targets on serine and threonine cyclin B (45 kDa) regulatory subunit that activates cdk1 abundance oscillates during the cell cycle 18 Cyclin was Discovered in Sea Urchin Embryos can stimulate to lay lots of eggs Protein Level cyclin A cyclin B M M M19 Time 2001 Nobel Prize in Medicine “for their discovery of key regulators of the cell cycle” Tim Hunt QuickTime™ and a Photo - JPEG decompressor are needed to see this picture. Paul Nurse QuickTime™ and a Photo - JPEG decompressor are needed to see this picture. Lee Hartwell QuickTime™ and a Photo - JPEG decompressor are needed to see this picture. QuickTime™ and a Photo - JPEG decompressor are needed to see this picture. Sea urchin: Identified cyclin proteins in sea urchin eggs Yeast: Identified genes that regulate the cell cycle and showed that humans also have them 20 La presenza di inibitori della sintesi proteica blocca l’uovo fertilizzato in interfase L’aggiunta di MPF spinge l’uovo in mitosi anche in presenza di inibitori della sintesi proteica 21 ✿ Il progesterone induce l’attivazione di MPF e la rottura della membrana nucleare solo se l’oocita è in grado di sintetizzare proteine; ✿ L’iniezione di citoplasma contenente MPF induce la maturazione anche se la sintesi proteica dell’oocita recipiente è inibita ✿ Gli oociti devono contenere complessi (definiti preMPF) che possono essere convertiti in MPF attivo mediante modifiche post-traduzionali; ✿ L’attivazione di MPF è un evento citoplasmatico poiché oociti privati del nucleo continuano a produrre MPF attivo se trattati con progesterone 22 L’attività di MPF oscilla indipendentemente dalla sintesi di DNA e dall’assemblaggio del fuso mitotico Presenza di nocodazolo (inibitore dell’assemblaggio del fuso) Presenza di afidicolina (inibitore della polimerizzazione di DNA) 23 Schema di funzionamento del ciclo cellulare Il “motore” del ciclo cellulare è MPF: una elevata concentrazione di MPF induce la mitosi e una sua bassa concentrazione induce l’ingresso in interfase 24 Organizzazione del ciclo cellulare di una cellula embrionale somatica 25 Il ciclo cellulare embrionale ha solo due transizioni: attivazione e inattivazione di MPF Nel ciclo cellulare di una cellula somatica c’è anche una terza transizione: START 26 Two sets of studies converged on same regulators of the cell cycle: 3. Identification of proteins whose abundance varied with the cell cycle from the eggs of marine invertebrates; 4. Identification of mutants and the subsequent cloning of the corresponding genes that are defective in cell cycle progression. These lines of investigations converged on the same set of regulatory proteins. The mechanisms regulating the progression through the cell division cycle are largely conserved in all eukaryotes!! 27 MPF regulation was elucidated by Tim Hunt’s discovery of Cyclins Cyclin B protein is synthesized continuously Threshold cyclin B level induces MPF kinase activity Cyclin B disappears suddenly during anaphase 28 29 Purification of MPF: The Birth of Cyclin Dependent Kinases This is cdc2+!! (Cdc28 in S. cerevisiae) This is cyclin!! (cdc13+ in S. pombe) 30 Cyclin synthesis Interphase Inactive MPF Mitosis Active MPF Cyclin degradation 31 Dimostrazione che la sintesi e la degradazione della ciclina sono necessarie per le oscillazioni cicliche dell’attività dell’MPF 32 Cyclins are synthesized and degraded during each cell cycle Cyclins are a family of related proteins Cyclin B: • abundance peaks during G2/M • degraded at anaphase onset Anaphase-promoting complex (APC) causes Polyubiquitination of cyclin B Ubiquitination triggers degradation by the proteasome 33 34 Cyclin Destruction Drives Mitotic Exit G1 S G2 M G1 35 Mitotic Cyclins are Destroyed by Ubiquitin-Dependent Proteolysis M-cyclin M-cyclin Cdk Cdk 36 Ubiquitin NH2 Hydrophobic globular core COOH Point of attachment to lysine side chains of proteins 37 Ubiquitin is Transferred via Thioester Bonds High Energy Thioester Bond, can be transferred from E1 to E2, E3, or substrate 38 Substrate Ubiquitination is Processive Processivity Isopeptide Bond Il legame isopeptidico si forma fra la Gly C-terminale della ubiquitina e il gruppo ε-amminico della Lys 48 ….…-Lys-NH-CO-Gly-………. 39 Ubiquitination of Protein Substrates E3 Enzymes: responsible for specificity and diversity of Ub system 40 Diversity in Ubiquitination Machinery is largely provided by the many E3s, each of which recognizes a specific group of substrates Single E1 Few E2’s Many E3’s 41 Three examples of E3s in action 42 Two classes of E3 Ubiquitin Ligases are important for cell cycle control APC/C and SCF: These Regulate Major Cell-Cycle Transitions APC Important for mitotic exit SCF Important for a cell’s entry into S-phase 43 Inibizione di un complesso Cdk/ciclina da parte di una CKI Il controllo della proteolisi da parte di SCF e APC durante il ciclo cellulare 44 APC/C Recognizes Different Substrates Through Binding Different Accessory Proteins and is Regulated by its own Phosphorylation Cdc20 Cdh1 Present from G2/M through G1 - regulates Meta/Anaphase transition - regulates M/G1 transition 45 APC Substrates active KEN-box proteins (KENxxxxN) i.e. Securin inactive active D-box proteins (RxxLxxxxN) i.e. Cyclin B 46 Defining (APC) E3 Recognition Motif’s “D-Box” R X X L X X X X D/N 47 Non-Degradeable Cyclin B Causes an Arrest During Mitosis, because Cells can’t Exit M-phase Cyclin B Destruction Box Cyclin B ∆DB Mitotic Arrest 48 APC controls entry into anaphase and exit from mitosis inactive P active 49 Ubiquitinated Proteins are Degraded by the Proteasome Binds to Ubiquitinated Proteins, Cleaves and Recycles Ubiquitin (Isopeptidase) Destroys Target Proteins (Peptidase) 50 Selective protein degradation occurs in the Proteasome, Proteasome a large protein complex in the nucleus & cytosol of eukaryotic cells. α 20 S Proteasome (yeast) closed state β β α two views PDB 1JD2 The proteasome core complex, with a 20S sedimentation coefficient, contains 2 each of 14 different polypeptides. 7 α-type proteins form each of the two a rings, at the ends of the cylindrical structure. 7 β-type proteins form each of the 2 central b rings. 51 Regolazione dei livelli di cicline mitotiche durante il ciclo cellulare I livelli di APC attivo (APCCdh1) rimangono elevati fino alla G1 avanzata del successivo ciclo cellulare 52 ❀ La regolazione della attività di APC controlla la degradazione della ciclina B ❀ La degradazione della ciclina B provoca la inattivazione di MPF ❀ Per iniziare l’anafase sono necessarie la poliubiquitinazione e la successiva degradazione di altre proteine ❀ La separazione dei cromatidi fratelli dipende dall’APC e induce la anafase 53 Dimostrazione sperimentale che l’inizio della anafase dipende dalla poliubiquitinazione di altre proteine oltre la ciclina B Estratti di uovo di Xenopus e nuclei isolati da spermatozoi di Xenopus. Dopo 40 min il fuso è depolimerizzato e i cromosomi sono decondensati. 54 Dopo 80 min il fuso è ancora presente e i cromosomi non si decondensano! La degradazione della ciclina B non è necessaria per la segregazione dei cromosomi durante l’anafase, anche se è necessaria per la depolimerizzazione del fuso mitotico e per la decondensazione di cromosomi 55 Concentrazioni basse di peptide ritardano la segregazione dei cromosomi, concentrazioni elevate inibiscono completamente la segregazione Il peptide compete con proteine endogene la cui degradazione (mediata da 56 APC) è necessaria per l’inizo della anafase Modello di induzione dell’anafase mediata dalla regolazione dei complessi di coesine Le coesine connettono i centromeri e sono presenti anche lungo i bracci dei cromatidi fratelli. L’inibitore dell’anafase (regolato mediante poliubiquitinazione da APC) modula la attività delle coesine. 57 Struttura e funzione delle coesine e delle condensine La struttura flessibile è molto adatta alla formazione di legami crociati nel DNA 58 La separazione dei cromatidi fratelli è regolata da APC 59 EVENTI INDOTTI DA MPF ❀ Rottura dell’involucro nucleare ❀ Riorganizzazione del citoscheletro ❀ Condensazione dei cromosomi Intervento diretto: fosforilazione di componenti strutturali chiave della cellula Intervento indiretto: fosforilazione di proteine chinasi di controllo che agiscono in cascata 60 EVENTI INDOTTI DA MPF ❃ Rottura dell’involucro nucleare Intervento diretto: fosforilazione di componenti strutturali chiave della cellula Intervento indiretto: fosforilazione di proteine chinasi di controllo che agiscono in cascata 61 La lamina nucleare 62 I tetrameri di lamina sono formati da due dimeri di lamina: Lamina A e C codificate dalla stessa unità trascrizionale mediante splicing alternativo Lamina B codificata da una differente unità trascizionale La fosforilazione delle Lamine A e C provoca il loro rilascio in soluzione, mentre quella della Lamina B non consente il suo rilascio dalla membrana 63 Dimostrazione sperimentale che la fosforilazione della lamina A è necessaria per la depolimerizzazione delle lamine nucleari 64 Assemblaggio dell’involucro nucleare durante la telofase 65 Panoramica sulla polimerizzazione e depolimerizzazione della lamina nucleare durante il ciclo cellulare 66 EVENTI INDOTTI DA MPF ✿ Rottura dell’involucro nucleare ✿ Riorganizzazione del citoscheletro ✿ Condensazione dei cromosomi Intervento diretto: fosforilazione di componenti strutturali chiave della cellula Intervento indiretto: fosforilazione di proteine chinasi di controllo che agiscono in cascata 67 EVENTI INDOTTI DA MPF ❃ Condensazione dei cromosomi Intervento diretto: fosforilazione di componenti strutturali chiave della cellula Intervento indiretto: fosforilazione di proteine chinasi di controllo che agiscono in cascata 68 Livelli di condensazione della cromatina 69 Assemblaggio di un ottamero di istoni Il dimero degli istoni H3-H4 da’ origine al tetramero 2H3-2H4, analogamente il dimero H2A-H2B forma il tetramero 2H2A-2H2B. Successivamente i due tetrameri formano l’ottamero caratteristico del nucleosoma 70 Struttura di un nucleosoma H2A in giallo H2B in fucsia H3 in viola H4 in verde 71 L’istone H1 è legato al DNA fra i nucleosomi Appena inizia la mitosi l’istone H1 viene progressivamente fosforilato su residui di Ser e Thr C N …SPKK… …SPKK… 72 73 EVENTI INDOTTI DA MPF ✿ Rottura dell’involucro nucleare ✿ Riorganizzazione del citoscheletro ✿ Condensazione dei cromosomi Intervento diretto: fosforilazione di componenti strutturali chiave della cellula Intervento indiretto: fosforilazione di proteine chinasi di controllo che agiscono in cascata 74 EVENTI INDOTTI DA MPF ❃ Riorganizzazione del citoscheletro Intervento diretto: fosforilazione di componenti strutturali chiave della cellula Intervento indiretto: fosforilazione di proteine chinasi di controllo che agiscono in cascata 75 Localizzazione della miosina I e della miosina II durante la citocinesi Miosina II in azzurro Actina in fucsia Citocinesi dell’ameba Dictyostelium 76 Struttura delle diverse molecole di miosina Le miosine I e V sono coinvolte nel trasporto delle vescicole La miosina II è coinvolta nella contrazione muscolare e nella citocinesi Il dominio di testa lega la actina ed ha attività ATPasica ❈Il Le catene leggere hanno funzione regolatoria ❈Le Il dominio di coda determina la specificità del ruolo fisiologico ❈Il 77 Regolazione della catena leggera della miosina II da parte di MPF 78