Nuovi sviluppi nella terapia genica e cellulare della fibrosi
cistica
Bob Williamson AO, FRS
Ufficiale dell’Ordine dell’Australia
Membro della Royal Society
Professore di Genetica Medica
Università di Melbourne
Melbourne, Australia
Quando il gene della fibrosi cistica (CFTR) venne finalmente
isolato e descritto da Lap Chee Tsui e colleghi nel 1989, tutti
pensarono che sarebbe stato facile usare una copia
normale del gene per curare la malattia. Ci saremmo dovuti
rendere conto che il corpo umano oppone una resistenza
molto forte all’incorporazione di geni estranei, per
proteggersi dall’invasione genetica da parte di altre piante
o animali. Nonostante gli sforzi di numerosi gruppi di ricerca,
che hanno utilizzato virus o grassi per trasportare il gene
normale CFTR all’interno di cellule di pazienti affetti da fibrosi
cistica (pazienti FC), non siamo ancora riusciti a sviluppare
questa nuova forma di trattamento. Detto questo, sappiamo
anche che la terapia è migliorata molto rispetto a 20 anni fa,
non solo per quanto riguarda l’aspettativa di vita, ma anche
il miglioramento della qualità della vita delle persone affette
da fibrosi cistica.
“Credo che la terapia genica e cellulare sarà disponibile nei
prossimi anni, ma non immediatamente.”
Chiunque studi lo sviluppo dei farmaci sa che normalmente
trascorrono circa 20 anni dall’ideazione di un nuovo
farmaco all’introduzione del prodotto sul mercato, perciò
forse non dovremmo essere sorpresi dalla lentezza dei
progressi. Gli scienziati e i medici, proprio come i pazienti, si
entusiasmano di fronte alle nuove idee e dimenticano il
tempo che ci vuole per provare che il medicinale funziona,
determinarne la dose migliore, valutarne la stabilità alle alte
e alle basse temperature e in condizioni umide e secche, ma
soprattutto dimostrarne la sicurezza. Lo stesso procedimento
si applica alle nuove proposte sull’impiego di geni o di
cellule staminali in terapia. Credo che la terapia genica e
cellulare sarà disponibile nei prossimi anni, ma non
immediatamente.
Nei primi tentativi di terapia genica sono stati utilizzati
“retrovirus oncogeni” (basati su virus del cancro dei topi) o
“adenovirus” (basati su virus del raffreddore comune
umano). Quando sono stati usati per il trattamento di
bambini con immunodeficienza (i cosiddetti “bambini nella
bolla”) i retrovirus hanno provocato lo sviluppo di tumori.
Sebbene ci siano ragioni per ritenere che questo possa non
accadere nella FC, sarebbe comunque molto difficile
infettare i polmoni con questi virus. Negli Stati Uniti, due
gruppi di ricerca hanno impiegato adenovirus per
trasportare il gene CFTR nelle cellule che rivestono i polmoni.
Gli esperimenti non hanno avuto successo, e gli adenovirus
hanno causato problemi in alcuni pazienti con fibrosi cistica
quando le dosi sono state aumentate.
Durante un esperimento su un’altra malattia, complicazioni
causate dall’adenovirus hanno provocato una tragica
morte.
In ogni caso, la copia normale del gene CFTR che può
essere trasportata nelle cellule dal virus è molto piccola e
contiene soltanto la sequenza di codifica, ossia le istruzioni
per la formazione della proteina, ma non le regioni
regolatrici. È un po’ come mettere un motore in
un’automobile che può andare solo a una data velocità,
senza freni o acceleratore.
Allo stesso tempo, alcuni gruppi di ricerca di Londra (St Mary
Hospital e Brompton Hospital) hanno sperimentato la terapia
genica CFTR utilizzando rivestimenti lipidici non virali per
trasportare il gene nelle cellule di rivestimento del naso e
delle vie aeree superiori. Nonostante questo approccio si sia
rivelato sicuro, il miglioramento nella capacità delle cellule di
correggere il difetto FC trasportando sale e acqua verso la
superficie delle vie aeree è stato piccolo, inefficace e di
breve durata.
“Oggi, dieci anni più tardi, c’è un nuovo fervore nel campo
della terapia genica e cellulare.”
Dopo questi esperimenti, condotti da numerosi gruppi di
ricercatori in paesi diversi, la maggior parte del lavoro si è
spostata dai test sui pazienti allo studio in laboratorio di
animali e modelli cellulari, per sviluppare nuovi metodi che
avessero maggiori probabilità di successo. Oggi, dieci anni
più tardi, c’è un nuovo fervore nel campo della terapia
genica e cellulare.
NUOVI APPROCCI ADENOVIRUS E AAV
I primi esperimenti basati sull’impiego di adenovirus
presentavano problemi perchè il trasferimento di CFTR nelle
cellule polmonari era inefficiente, e l’espressione dei geni del
virus, che continuava a produrre proteine virali, causava
infiammazione. Per risolvere questi problemi vennero costruiti
nuovi adenovirus “sventrati”, cio cioè privi di geni virali
(erano prodotti in laboratorio utilizzando cellule con “virus
aiutanti”, che fornivano le funzioni mancanti ma non erano
presenti nel prodotto finale). L’impiego di questi nuovi vettori
nel trasporto di geni all’interno delle cellule, insieme a segnali
umani di inizio e di termine sul gene CFTR invece di segnali
virali, porta a risultati di gran lunga migliori. L’infiammazione
del naso o delle cellule polmonari è ridotta o assente e nei
modelli dei topi si è verificata un’espressione del CFTR di
lunga durata. Questi promettenti risultati devono ancora
essere ripetuti nella sperimentazione sugli esseri umani, dove
introdurre grandi quantità di virus nell’intero polmone
rappresenta un problema. Potrebbe inoltre verificarsi una
reazione immunitaria alle proteine che rivestono il virus, nel
qual caso potrebbe essere somministrata soltanto una dose.
Uno dei pochi virus che non sembrano causare malattie è il
virus adenoassociato, o AAV (adeno-associated virus). È un
virus molto piccolo che normalmente ha bisogno di
adenovirus per moltiplicarsi, e possiede l’interessante
proprietà di integrare il proprio DNA nel genoma umano in
un sito specifico del cromosoma 19. Si tratta di un fattore
importante perchè se conosciamo il punto di ingresso del
gene CFTR possiamo essere ragionevolmente sicuri della sua
lontananza da geni che, se disturbati, potrebbero causare il
cancro. Sfortunatamente, esso perde la sua abilità di
integrarsi in questo sito quando trasporta nel proprio DNA un
gene umano!
“…grazie al suo tasso di sicurezza estremamente elevato
l’AAV continua a essere ritenuto un vettore interessante per
l’impiego in fibrosi cistica.”
Nel corso di esperimenti clinici effettuati su circa 200 persone
affette da fibrosi cistica, il virus AAV ha trasferito il gene in
modo sicuro, ma sfortunatamente la sua espressione non è
stata di lunga durata, e sembra che dosi ripetute non
avrebbero funzionato a causa dello sviluppo, da parte dei
pazienti, di una reazione immunitaria alle proteine che
rivestono il virus. Nonostante la terapia genica sia stata
rallentata dai risultati deludenti, grazie al suo tasso di
sicurezza estremamente elevato l’AAV continua a essere
ritenuto un vettore interessante per l’impiego in fibrosi cistica,
a condizione di poterne aumentare l’efficienza o che sia
possibile farlo integrare in un sito sicuro. Alcuni dei vettori
AAV più recenti, dotati di rivestimenti diversi (“serotipi”),
sembrano dare un trasferimento di geni nelle cellule
polmonari molto più efficiente.
METODI BASATI SU VETTORI LENTIVIRALI
Il lentivirus più noto è quello dell’AIDS (lentivirus come l’HIV
sono anche retrovirus, ma molto diversi dai retrovirus
oncogeni di cui sopra). Chiaramente, l’uso di un virus che
può provocare una malattia devastante deve essere
trattato con grande cautela, per avere la certezza che il
vettore sia sicuro. Tuttavia, i vettori lentivirali che trasportano
il gene CFTR hanno un grande vantaggio: essi infettano le
cellule polmonari in modo molto più efficace rispetto agli
adenovirus o agli oncoretrovirus (molti virus infettano solo le
cellule in divisione, e le cellule polmonari si dividono molto
lentamente). Sebbene i lentivirus non siano abbastanza
grandi da trasportare un intero gene CFTR, essi possono
accogliere una parte più estesa del gene, comprese le
regioni di controllo, rispetto ai molti altri virus studiati. Dopo il
trasferimento del gene CFTR nelle cellule FC in coltura, il
difetto di trasporto dello ione risulta corretto, ma la necessità
di garantire la sicurezza del procedimento ha messo un freno
alla sperimentazione clinica. Invece di utilizzare HIV umano, i
laboratori stanno impiegando sequenze di lentivirus di gatto
e di marmotta americana, sebbene non sia ancora stato
chiarito se questi possano rappresentare un rischio maggiore
o minore per gli esseri umani (potrebbero rivelarsi letali
perchè le cellule umane, non essendo mai state infettate da
questi virus, non possiedono meccanismi di resistenza).
“A differenza dei virus, i liposomi sono piuttosto inerti e hanno
un margine di sicurezza maggiore.”
TRASFERIMENTO GENICO NON VIRALE
I liposomi sono pacchetti di grassi naturali biodegradabili
(“lipidi”) che possono avvolgersi intorno ai geni e trasportarli
all’interno delle cellule. Sono stati usati per la prima volta in
un esperimento clinico sulla fibrosi cistica a Londra, nel 1995,
e si sono rivelati sicuri ma inefficaci. L’associazione UK Cystic
Fibrosis Trust si è impegnata enormemente per sviluppare
nuovi liposomi in grado di portare il gene FC nelle cellule in
modo rapido e sicuro. Mentre i liposomi tradizionali
potevano avvolgersi solo intorno a brevi tratti di DNA, i lipidi
di sviluppo più recente possono trasportare l’intero gene
nella cellula umana, incluse le sequenze di controllo, in uno
stato decodificato. A differenza dei virus, i liposomi sono
piuttosto inerti, hanno un margine di sicurezza maggiore, e
non sembrano perdere efficacia quando vengono usati
ripetutamente. Nuovi esperimenti clinici saranno
probabilmente effettuati in Gran Bretagna nell’anno a
venire.
“…Chi nasce oggi con la fibrosi cistica può vivere fino a 40 o
persino 50 anni, quindi un trattamento sperimentale condotto
nella prima infanzia deve essere completamente privo di
rischi.”
TERAPIA GENICA IN ETÀ FETALE
Uno dei principali problemi della terapia genica è il tempo.
In teoria, qualunque forma di terapia che cerca di curare il
polmone dovrebbe avere luogo alla nascita, o addirittura
prima della nascita, quando i polmoni non sono ancora stati
infettati o danneggiati. Tuttavia, chi nasce oggi con la fibrosi
cistica può vivere fino a 40 o persino 50 anni, quindi un
trattamento sperimentale condotto nella prima infanzia
deve essere completamente privo di rischi. Utilizzando
modelli animali, un gruppo di ricerca dell’Imperial College di
Londra ha dimostrato che la terapia genica può funzionare
dopo la nascita se il trattamento è somministrato tardi nella
vita fetale (verso l’ottavo mese), ma è necessario dimostrare
che la terapia fetale sia sicura prima di sperimentarla sugli
esseri umani.
CELLULE STAMINALI
Oggigiorno, tutti hanno sentito parlare delle cellule staminali.
La derivazione e l’uso delle cellule staminali embrionali pone
forti dilemmi etici in alcuni scienziati e pazienti, mentre altri
sostengono che qualunque approccio naturale alla cura
della fibrosi cistica dovrebbe essere seguito. Non mi
addentrerò nel dibattito etico sulle cellule staminali
embrionali, ma spiegherò perchè un particolare approccio
alla terapia basato sull’impiego di cellule staminali
(“trasferimento nucleare di cellule somatiche”, o clonazione
terapeutica) sia particolarmente importante per la fibrosi
cistica.
Tutti nasciamo come una singola cellula staminale,
composta da un ovulo e da uno spermatozoo. Dopo la
fecondazione, questa cellula staminale dà origine a tutti i
tessuti del corpo. Nel feto in via di sviluppo e nel bambino
appena nato ci sono molte cellule staminali in quasi tutti i
tessuti del corpo, compresi i polmoni. Tuttavia, le cellule
staminali che conosciamo meglio in medicina, al momento,
sono quelle nel midollo osseo, che producono i globuli
bianchi e i globuli rossi del sangue. Nel trapianto di midollo
osseo (in un bambino con leucemia o con anemia
mediterranea) queste cellule staminali, ricevute da un
parente o da un donatore compatibile, possono sostituire le
cellule staminali originali del bambino e produrre una serie
completamente nuova di cellule del sangue. Sono inoltre in
fase di sviluppo terapie per la cura delle ustioni che utilizzano
cellule staminali estratte dal paziente stesso (come
alternativa al trapianto di pelle), o che impiegano cellule
staminali per curare malattie dell’occhio (perchè l’occhio
non rigetta le cellule “estranee”con la stessa frequenza del
midollo osseo o del polmone).
“Questo metodo potrebbe rivelarsi interessante, dal
momento che le cellule, provenendo dal paziente stesso,
non verrebbero rigettate.”
Ovviamente, chiunque sia affetto da fibrosi cistica presenta
lo stesso difetto genetico nel gene CFTR di ogni cellula del
corpo. Non serve estrarre una cellula staminale da un
paziente con fibrosi cistica e utilizzarla nel suo stesso
polmone, perchè essa avrà ancora il difetto FC. Sarebbe
possibile, tuttavia, correggere in provetta la mutazione
presente nelle cellule staminali, e impiantare nuovamente
nel polmone le cellule corrette? Questo metodo potrebbe
rivelarsi interessante, dal momento che le cellule,
provenendo dal paziente stesso, non verrebbero rigettate. A
San Francisco e a Roma, alcuni gruppi di ricerca stanno
studiando la possibilità di correggere nelle cellule staminali la
mutazione legata alla fibrosi cistica, preservando allo stesso
tempo l’integrità delle cellule in modo da poterle
reintrodurre nel paziente. Questo approccio mi sembra
potenzialmente più efficace rispetto all’impiego di cellule
staminali provenienti da una banca del seme o da un
embrione, poichè le cellule di un donatore senza legami di
parentela sarebbero rigettate a meno di non somministrare
farmaci immunodepressivi molto forti.
Se diventasse possibile correggere il difetto FC in una cellula
staminale del paziente, emergerebbe una nuova ed
eccitante possibilità. Il modo più semplice di ottenere cellule
staminali polmonari da un paziente è probabilmente il
“trasferimento nucleare di cellula somatica”, o clonazione
terapeutica, dove il DNA di una cellula della pelle del
paziente viene inserito in un ovulo dal quale sono stati rimossi
tutti i geni. Le cellule staminali, che saranno in principio
“cellule FC”, potranno essere coltivate in laboratorio e poi
corrette! Grazie ad alcune ricerche condotte in Francia e
nella Carolina del Nord, sappiamo che questo tipo di cellula
può essere indotta a produrre cellule epiteliali polmonari.
Non tutti ritengono che questo procedimento sia
eticamente accettabile. Tuttavia esso è legale negli Stati
Uniti, nella maggior parte dei paesi europei, compreso il
Regno Unito, e in Australia. La mia opinione è che una
cellula staminale proveniente da un paziente non possa
essere considerata come un embrione, in quanto non deriva
dall’unione di un ovulo e di uno spermatozoo ma dalle
cellule del corpo del paziente stesso, ma so che non tutti
sarebbero d’accordo con me.
“...liquido amniotico e sangue ombelicale. Questi tessuti
sembrano contenere cellule staminali molto giovani che
possono moltiplicarsi facilmente e formare epitelio.”
CELLULE STAMINALI ADULTE
Un feto ha più cellule staminali di un neonato, e un neonato,
a sua volta, ne ha più di un adulto. Stranamente, cellule
staminali di feti e neonati sono chiamate “cellule staminali
adulte”, perchè non hanno origine da un embrione. Non
solo ci sono più cellule staminali man mano che si va indietro
nel tempo, ma le cellule possono anche eseguire più
compiti: esse sono ”pluripotenti”(possono dare origine a
molti tipi diversi di cellule). Una fonte di cellule che si è da
poco iniziato a studiare è la placenta, insieme al liquido
amniotico e al sangue ombelicale ad essa associati. Questi
tessuti sembrano contenere cellule staminali molto giovani
che possono moltiplicarsi facilmente e produrre epitelio, ma
ovviamente ci si dovrebbe accertare che non sarebbero
rigettate prima di impiegarle nel trattamento di pazienti con
fibrosi cistica.
Le cellule staminali polmonari non sono mai state isolate in
grandi quantità, sono poco comprese, e poichè il polmone
è un “tessuto strutturato”(a differenza del midollo osseo, che
somiglia più a un sacchetto di cellule libere) le cellule
staminali non possono essere estratte dal corpo del paziente
per il trattamento. Il polmone è anche ben protetto contro
l’estrazione di cellule viventi dalle vie aeree, e non è ancora
chiaro se le cellule possano accedere attraverso il sangue
alle parti del polmone danneggiate da fibrosi cistica. Ci sono
speranze che cellule estratte dal midollo osseo possano dare
origine a cellule polmonari se trattate correttamente in
laboratorio, e si sa per certo che cellule staminali embrionali
possano produrre cellule polmonari. Tuttavia, tutti sembrano
essere d’accordo sul fatto che prima che la terapia basata
sulle cellule staminali possa diventare realtà, sarà necessario
compiere numerosi studi per dimostrarne l’affidabilità e la
sicurezza.
COMBINAZIONI, COMBINAZIONI
Uno dei maggiori progressi compiuti dalla medicina negli
ultimi anni è stato dimostrare come la combinazione di
approcci diversi spesso funzioni meglio della
somministrazione di trattamenti singoli (ovvero, come dice
spesso un mio amico, “I miracoli non avvengono spesso!”).
Un errore che molti hanno commesso vent’anni fa (me
compreso) è stato presumere che la terapia genica fosse
una cura che avrebbe sostituito tutti gli altri progressi
terapeutici: antibiotici, fisioterapia, dieta, e così via. Io non la
penso più così. Credo che terapia genica e terapia cellulare
troveranno posto accanto agli altri metodi. Anche se la
terapia genica e cellulare rappresentasse solo un piccolo
passo avanti, presto potremmo iniziare a parlare di
aspettative di vita medie di 50 o 60 anni, con una buona
qualità di vita, per coloro che nasceranno con la fibrosi
cistica nel prossimo decennio. Non sarebbe meraviglioso?
TESTI DI RIFERIMENTO
Per coloro che desiderassero una descrizione più dettagliata
degli attuali sviluppi, sono stati pubblicati di recente quattro
esaurienti rapporti. Sono stati scritti per scienziati e medici,
ma so per esperienza che molte persone affette da fibrosi
cistica, così come le loro famiglie e i loro amici, saranno in
grado di comprenderne i complessi ragionamenti.
Terapia genica
“Novel Molecular Approaches to CF Gene Therapy” (Nuovi
approcci molecolari alla terapia genica della fibrosi cistica),
di Tim Lee, David Matthews e Eric Blair, apparso sul
Biochemical Journal, volume 387 (2005) 1-15. Tratta tutti i
tentativi di terapia genica, con enfasi particolare sugli
approcci non virali.
“Gene Therapy Progress and Prospects: Cystic Fibrosis”
(Progressi e avvenire della terapia genica: la fibrosi cistica),
di U. Griesenbach, Duncan Geddes e Eric Alton, apparso su
Gene Therapy, volume 13 (2006) 1061-1067. Il rapporto
descrive in modo particolarmente efficace il metodo del
trasporto genico non virale promosso dall’organizzazione UK
Cystic Fibrosis Trust.
“Viral Vector-Mediated and Cell-Based Therapies for
Treatment of CF” (Terapie basate su vettori virali e terapie
cellulari per il trattamento della fibrosi cistica), di Terence
Flotte, Philip Ng, Doug Dylla, Paul McCray Jr, Guoshun Wang,
Jay Kolls e Jim Hu, apparso su Molecular Therapy, volume 15
(2007) 229-241. Tratta gli approcci virali alla terapia genica,
in particolare quelli basati sui virus adenoassociati.
Terapia cellulare
“Adult Stem Cells, Lung Biology, and Lung Disease” (Cellule
staminali adulte, biologia del polmone e patologia del
polmone) di Daniel Weiss, Mary Anne Berberich, Zea Borok,
Dorothy Gail, Jay Kolls, Christopher Penland and Darwin
Prockop, apparso su Proceedings of the American Thoracic
Society, volume 3 (2006) 193-207. Un rapporto dettagliato
promosso tra gli altri dalla US Cystic Fibrosis Foundation.
Translated by: Melania Bertini
E-mail: [email protected]
